L'analisi del doppio righello del DNA viene sviluppata per determinare la posizione dell'mRNA durante la traslocazione del ribosoma, che si basa sulle forze di dissociazione dei duplex DNA-mRNA formati. Con la risoluzione mononucleotide e la capacità di raggiungere entrambe le estremità dell'mRNA, può fornire spunti meccanicistici per la traslocazione del ribosoma e sondare altri spostamenti di acido nucleico.
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Articolo metodologico
I governanti del DOPPIO DNA studiano il meccanismo della traslocazione del ribosoma con la risoluzione Single-Nucleotide
In questo articolo
Sommario
Abstract
La traslocazione del ribosoma si riferisce al movimento ribosomico sull'mRNA da esattamente tre nucleotidi (nt), che è il passo centrale nella sintesi proteica. Per studiarne il meccanismo, esistono due requisiti tecnici essenziali. Il primo è una risoluzione single-nt che può risolvere la normale traslocazione dal frameshifting, durante il quale il ribosoma si muove di diverso da 3 nt. La seconda è la capacità di sondare i lati di ingresso e uscita dell'mRNA al fine di chiarire l'intero quadro della traslocazione. Riportiamo il doppio saggio del righello del DNA che si basa sulle forze di dissociazione critiche dei duplex DNA-mRNA, ottenuti dalla spettroscopia di magnetizzazione residua indotta dalla forza (FIRMS). Con la risoluzione della forza 2-4 pN, l'esempio a doppio righello è sufficiente a distinguere i diversi passaggi di traslocazione. Implementando un lungo linker sui DNA di sondaggio, possono raggiungere l'mRNA sul lato opposto del ribosoma, in modo che la posizione dell'mRNA possa essere determinata per entrambi i lati. Pertanto, l'analisi del doppio righello è particolarmente adatta a studiare la traslocazione del ribosoma e il movimento dell'acido nucleico in generale. Mostriamo risultati rappresentativi che indicavano una conformazione di mRNA in loop e risolvevano la normale traslocazione dal frameshifting.
Introduzione
Lo spostamento biomolecolare è un parametro fondamentale nello studio del meccanismo delle funzioni biologiche correlate. Un esempio particolare è la traslocazione ribosoma1,2, durante la quale il ribosoma si muove esattamente da tre nucleotidi (nt) sull'RNA messaggero (mRNA) normalmente, e da uno, due o altri numeri di nt tranne tre nel caso di frameshifting. Pertanto, è necessario un sistema di righello molecolare a risoluzione a virgola singola per distinguere le diverse dimensioni del passo. Una sfida più grande è quella di sondare il movimento del ribosoma su entrambi i lati di entrata e di uscita. In alt....
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Protocollo
1. Preparazione dei complessi ribosomi
- Fare 1.000 mL di TAM10 buffer, che consiste di 20 mM tris-HCl (pH 7.5), 10 mM Mg (OAc)2, 30 mM NH4Cl, 70 mM KCl, 5 mM EDTA, 7 mM BME (2-cap mertoetanolo) e 0,05% Tween20.
- Preparare le cinque miscele elencate nella Tabella 1.
NOTA: Il ribosoma era del ceppo MRE60011. EF-Tu: fattore di allungamento terminabile. EF-Ts: fattore di allungamento termo stabile. GTP: guanosina tripofosfato. PEP: fosforo (enol)pyruvate. - Incubare le cinque miscele separatamente a 37 gradi centigradi per 25 minuti prima di realizzare i complessi di ribosomi. Prep....
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Risultati
La figura 1 mostra lo schema di rilevamento e le fotografie dei componenti principali. Il rilevamento magnetico è ottenuto da un magnetometro atomico utilizzando lo schema di scansione (Figura 1A)13. Il campione viene posto su un'asta montata su un motore lineare. Il motore trasporta il campione al sensore atomico all'interno di uno scudo magnetico, quindi di nuovo al sito originale per lo scarico. Il magnetometro atomico.......
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Discussione
Nel nostro assaggio doppio righello, le perline magnetiche svolgono due ruoli essenziali. In primo luogo, servono come trasduttori di forza perché la forza centrifuga è proporzionale alla loro massa galleggiante. In secondo luogo, le perline sono vettori di segnale rilevati da un magnetometro atomico, che è attualmente il sensore magnetico più preciso. Combinando la manipolazione meccanica e il rilevamento magnetico, la tecnica FIRMS è in grado di risolvere un gran numero di interazioni molecolari basate sulle loro forze.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno segnalato un potenziale conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Questo lavoro è supportato dagli Stati Uniti National Institutes of Health (R01GM11452, Y.W., S.X.). Y. W. riconosce il sostegno della Welch Foundation (E-1721).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Striscia di stirene | Città dell'industria | MS-861 | |
| Vetrini | Rivestimenti | 60,0 &volte; 4,0 &volte; 0,3 mm3 | |
| Acido acetico | Millipore Sigma | A6283-500ML | |
| 3-Aminopropiltrietossisilano | UCT | specialità 21400088 | |
| mPEG-SVA | Laysan Bio | 154-82 | |
| Biotin-PEG-SVA | Laysan Bio | 152-84 | |
| Bicarbonato di sodio | Millipore Sigma | S5761-500G | |
| Colla epossidica | Devcon | 31345 | |
| Streptavidina | ThermoFisher | 434301 | |
| Acido fusidico | Millipore Sigma | F0756-1G | |
| Neomicina Solfato | Millipore Sigma | ||
| Viomicina Solfato | Millipore Sigma | 1715000 | |
| Igromicina | invitrogen | 10687-010 | |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941-100G | |
| Acetato di magnesio | Millipore Sigma | M5661-50G | |
| Cloruro di ammonio | Millipore Sigma | A9434-500G | |
| Potassio cloruro | Millipore Sigma | P9333-500G | |
| EDTA | GIBCO | 774750 | |
| 2-mercaptoetanolo | Millipore Sigma | M6250-500ML | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-250ML | |
| GTP | Millipore Sigma | G8877-100MG | |
| PEP | Millipore Sigma | P7127-100MG | |
| Piruvato chinasi | Millipore Sigma | P1506-5KU | |
| Saccarosio | Millipore Sigma | S7903-5KG | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | ThermoFisher | 11205D | |
| mRNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 133899727 | 5′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAA AAA GGA AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3′ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468630 | 3?- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5? |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 164845370 | 3?-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5' |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468628 | 3?-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5' |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 163472705 | 3?-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5' |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678130 | 3?-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5' |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678131 | 3?-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5' |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678132 | 3?-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5? |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678133 | 3?-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5' |
| Centrifuga | Eppendorf | 5427R | |
| Micro Ultracentrifuga | Hitachi | CS150FNX | |
| Miscelatore a vortice | VWR | VM-3000 | |
| Amplificatore lock-in | Stanford Research Systems | SR530 | |
| Amplificatore lock-in | Stanford Research Systems | SR830 | |
| Laser | Newport | TLB-6918-D | |
| Generatore di funzioni | Stanford Research Systems | DS345 | |
| Fotorivelatori | Thorlabs | DET36A |
Riferimenti
- Noller, H. F., Lancaster, L., Mohan, S., Zhou, J. Ribosome structural dynamics in translocation: yet another functional role for ribosomal RNA. Quarterly Review of Biophysics. 50, 12(2017).
- Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J. P., Noller, H. F.
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Ristampe e permessi
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