Sono stati sviluppati saggi sull'attività NMR per identificare e caratterizzare gli inibitori di due enzimi riboidroelettrici nucleoside. I protocolli sono forniti per i saggi composti iniziali a 500 M e 250 M, i saggi di risposta alla dose per determinare i valori IC50, i saggi del controschermo del detergente, i saggi del controschermo jump-diluizione e i saggi in E. coli intere cellule.
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Articolo metodologico
Assaggi di attività basati su NMR per determinare l'inibizione composta, i valori IC50, l'attività Artifactual e l'attività intera delle cellule
In questo articolo
Sommario
Abstract
La spettroscopia NMR viene spesso utilizzata per l'identificazione e la caratterizzazione degli inibitori degli enzimi nella scoperta di farmaci, in particolare nel contesto dello screening dei frammenti. I saggi di attività basati su NMR sono ideali per lavorare alle concentrazioni più elevate di composti di prova necessari per rilevare questi inibitori più deboli. La gamma dinamica e la dispersione dei cambiamenti chimici in un esperimento NMR possono facilmente risolvere le risonanze da substrati, prodotti e composti di prova. Questo contrasta con i saggi spettrofotometrici, in cui i problemi di interferenza di lettura spesso derivano da composti con profili di assorbimento UV-vis sovrapposti. Inoltre, poiché mancano di enzimi reporterschi, i test NMR a singolo enzima non sono inclini a falsi positivi accoppiati. Questo attributo li rende utili come saggi ortogonali, completando i tradizionali saggi di screening ad alta produttività e i saggi di triage da banco. Sono previsti protocolli dettagliati per i saggi composti iniziali a 500 m e 250 m, i saggi di risposta alla dose per determinare i valori IC50, i saggi dello schermo del controschermo del detergente, i saggi del controschermo jump-dilution e i saggi in E. coli intere cellule. I metodi sono dimostrati utilizzando due enzimi di riboidrolasi nucleoside. L'uso di 1H NMR è indicato per l'enzima specifico della purina, mentre 19F NMR è indicato per l'enzima specifico per la piromidine. I protocolli sono generalmente applicabili a qualsiasi enzima in cui il substrato e le risonanze dei prodotti possono essere osservate e distinte dalla spettroscopia NMR. Per essere il più utile nel contesto della scoperta di farmaci, la concentrazione finale del substrato non dovrebbe essere più di 2-3 volte il suo valore Km. La scelta dell'esperimento NMR dipende dalla reazione enzimatica e dai substrati disponibili, nonché dalla strumentazione NMR disponibile.
Introduzione
La spettroscopia a risonanza magnetica nucleare (NMR) è ben consolidata per caratterizzare e monitorare le reazioni enzimatiche1,2. Le differenze nei cambiamenti chimici e nei modelli di accoppiamento vengono utilizzate per distinguere le risonanze di substrato e prodotto, mentre le intensità di risonanza relativa vengono utilizzate per quantificare la percentuale di reazione. Sia il consumo di substrato che la creazione di prodotto sono osservati direttamente nello spettro NMR. Ciò contrasta con la spettrofotometria o la spettroscopia a fluorescenza, in cui il corso temporale di reazione è indicato da un camb....
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Protocollo
1. Saggi composti di prova iniziali a 500 e 250 M
- Preparare il substrato e testare il composto per le reazioni.
- Preparare soluzioni di stock di substrato (adenosina o 5-fluorouridina) in acqua e composto di prova di 50 mM in solforo dimetilo deuterato (DMSO). Fare riferimento alla sezione introduttiva per le concentrazioni di soluzione di substrato da utilizzare.
- Aggiungere 12 l di substrato (adenosina o 5-fluorouridina) a ciascuno dei quattro tubi di microfuge da 1,5 ml, 1–4.
- Aggiungete 6 -L di DMSO deuterated ai tubi 1 (controllo 0 min) e 4 (controllo 30 min). Aggiungere 6 -L di composto di prova al tubo 2. Aggiungere 3 -L di ....
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Risultati
Nella figura 2 vengono illustrati i risultati per il test di due composti rispetto ad AGNH utilizzando 1H NMR seguendo la sezione 1. La reazione enzimatica è più facilmente osservabile e quantificata dalla scomparsa di risonzioni di adenosina singlet e doppietta a 8,48 ppm e 6,09 ppm, rispettivamente, e dalla comparsa di una risonanza singlet adenina a 8,33 ppm come osservato nel controllo di 30 min Spettro. In presenza di 500 m composto 1, nessun prodotto è formato come dimostra .......
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Discussione
I protocolli descritti sono generalmente applicabili a molti enzimi, a condizione che i substrati e/o i prodotti abbiano segnali risolvibili nello spettro NMR. Tuttavia, è fondamentale che la concentrazione di substrato sia vicina al suo valore Km e abbastanza elevata da essere rilevata in un esperimento NMR entro un lasso di tempo ragionevole. Una concentrazione di substrato non superiore a 2-3x il valore Km è ottimale per rilevare inibitori competitivi, non competitivi e non comp.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dr. Dean Brown per aver fornito composti dalla libreria dei frammenti di Astra-eneca e dal Dr. David Parkin per aver fornito gli enzimi AGNH e UNH. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dall'Istituto Nazionale di Allergia e Malattie Infettive dei National Institutes of Health con il numero di premio R15AI128585 a B. J. S. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali dei National Institutes of Health.Research è stato sostenuto anche da una horace G. McDonell Summer Research Fellowship assegnata a S. N. M., una famiglia Landesberg Fellowship assegnato a J. A. G., e....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| AGNH | Purificato in-house | N/A | TVAG_213720 |
| UNH | Purificato in-house | N/A | TVAG_092730 |
| Adenosine | Sigma | A9251 | |
| 5-Fluorouridina | Sigma | F5130 | |
| Dimetil solfossido-D6 | Cambridge Isotope Labs | DLM-10-100 | D, 99,9% |
| Fosfato di potassio monobasico | Sigma | P0662 | |
| Fosfato di potassio bibasico | Sigma | P3786 | |
| Cloruro di potassio | Sigma | P9541 | |
| Ossido di deuterio | Cambridge Isotope Labs | DLM-4-100 | D, 99,9% |
| Acido cloridrico | Fisher Chemical | A144212 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| 3-(Trimetilsilil)propionico-2,2,3,3,-d4 sale sodico acido (TSP) | Sigma | 269913 | D, 98% |
| 2,2,2-Trifluoroetanolo-1,1-d2 | Sigma | 612197 | D, 99,5% |
| Pipetta | Gilson | F123602 | PIPETMAN Classic P1000 |
| Pipetta | Gilson | F123601 | PIPETMAN Classic P200 |
| Pipetta | Gilson | F123600 | PIPETMAN Classic P20 |
| Provette per microfughe | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Provette coniche | Corning | 352099 | |
| Microcentrifuga | Eppendorf | 5418 | |
| Miscelatore a vortice | Fisher Scientific | 02215365 | |
| Provette NMR | Norell | 502-7 | O a seconda dei casi per lo |
| spettrometro NMR NMR | Bruker | N/ A | AvanceIII500 |
| Prism software | GraphPad | N/A | Versione 5.04 |
Riferimenti
- Jardetzky, O., Roberts, G. C. K. NMR in Molecular Biology. , Academic Press. New York. (1981).
- Evans, J. N. S. Biomolecular NMR spectroscopy. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1995).
- Dalvit, C., et al.
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Ristampe e permessi
