Articolo metodologico

Assaggi di attività basati su NMR per determinare l'inibizione composta, i valori IC50, l'attività Artifactual e l'attività intera delle cellule

DOI:

10.3791/59928

⸱

30 giugno 2019

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1Department of Chemistry, Adelphi University, 2Department of Chemistry, Washington University in St. Louis, 3Department of Chemistry, Boston University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sono stati sviluppati saggi sull'attività NMR per identificare e caratterizzare gli inibitori di due enzimi riboidroelettrici nucleoside. I protocolli sono forniti per i saggi composti iniziali a 500 M e 250 M, i saggi di risposta alla dose per determinare i valori IC50, i saggi del controschermo del detergente, i saggi del controschermo jump-diluizione e i saggi in E. coli intere cellule.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La spettroscopia NMR viene spesso utilizzata per l'identificazione e la caratterizzazione degli inibitori degli enzimi nella scoperta di farmaci, in particolare nel contesto dello screening dei frammenti. I saggi di attività basati su NMR sono ideali per lavorare alle concentrazioni più elevate di composti di prova necessari per rilevare questi inibitori più deboli. La gamma dinamica e la dispersione dei cambiamenti chimici in un esperimento NMR possono facilmente risolvere le risonanze da substrati, prodotti e composti di prova. Questo contrasta con i saggi spettrofotometrici, in cui i problemi di interferenza di lettura spesso derivano da composti con profili di assorbimento UV-vis sovrapposti. Inoltre, poiché mancano di enzimi reporterschi, i test NMR a singolo enzima non sono inclini a falsi positivi accoppiati. Questo attributo li rende utili come saggi ortogonali, completando i tradizionali saggi di screening ad alta produttività e i saggi di triage da banco. Sono previsti protocolli dettagliati per i saggi composti iniziali a 500 m e 250 m, i saggi di risposta alla dose per determinare i valori IC50, i saggi dello schermo del controschermo del detergente, i saggi del controschermo jump-dilution e i saggi in E. coli intere cellule. I metodi sono dimostrati utilizzando due enzimi di riboidrolasi nucleoside. L'uso di 1H NMR è indicato per l'enzima specifico della purina, mentre 19F NMR è indicato per l'enzima specifico per la piromidine. I protocolli sono generalmente applicabili a qualsiasi enzima in cui il substrato e le risonanze dei prodotti possono essere osservate e distinte dalla spettroscopia NMR. Per essere il più utile nel contesto della scoperta di farmaci, la concentrazione finale del substrato non dovrebbe essere più di 2-3 volte il suo valore Km. La scelta dell'esperimento NMR dipende dalla reazione enzimatica e dai substrati disponibili, nonché dalla strumentazione NMR disponibile.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La spettroscopia a risonanza magnetica nucleare (NMR) è ben consolidata per caratterizzare e monitorare le reazioni enzimatiche1,2. Le differenze nei cambiamenti chimici e nei modelli di accoppiamento vengono utilizzate per distinguere le risonanze di substrato e prodotto, mentre le intensità di risonanza relativa vengono utilizzate per quantificare la percentuale di reazione. Sia il consumo di substrato che la creazione di prodotto sono osservati direttamente nello spettro NMR. Ciò contrasta con la spettrofotometria o la spettroscopia a fluorescenza, in cui il corso temporale di reazione è indicato da un cambiamento di assorbimento attribuibile ad alcune specie chimiche consumate o create. Proprio come con gli altri metodi, NMR può essere utilizzato per studiare le reazioni enzimatiche in funzione della temperatura, pH, o altre condizioni di soluzione, e gli effetti degli inibitori possono essere determinati.

Più recentemente, sono stati dimostrati i saggi di attività enzimatica basati su NMR per lo screening dei frammenti3,4. I saggi basati su NMR sono ideali per lavorare alle concentrazioni più elevate di composti di prova (spesso fino a 1 mM) necessari per rilevare questi inibitori più deboli. La gamma dinamica e la dispersione dei turni chimici nell'esperimento NMR possono facilmente risolvere le risonanze da substrati, prodotti e composti di prova. Questo si confronta favorevolmente con i saggi spettrofotometrici in cui i problemi di interferenza di lettura spesso derivano da composti con profili di assorbimento UV-vis sovrapposti. Inoltre, poiché mancano di enzimi reporterschi, i test NMR a singolo enzima non sono inclini a falsi positivi accoppiati. Questo vantaggio li rende utili come saggi ortogonali, completando i tradizionali saggi di screening ad alta velocità e i saggi di triage da banco5.

Nel nostro laboratorio di ricerca, i saggi di attività basati su NMR vengono utilizzati per identificare e valutare gli inibitori di Trichomonas vaginalis nucleoside riboidrolasi. Il parassita T. vaginalis causa la malattia sessualmente trasmissibile non virale più diffusa6. La crescente resistenza alle terapie esistenti7 sta guidando la necessità di nuovi trattamenti basati su meccanismi, con enzimi essenziali del percorso di recupero nucleoside che rappresentano gli obiettivi principali8. Sono stati sviluppati saggi sull'attività NMR sia per gli enzimi specifici per la pirimidina che per la purina, per il riboidrolasi del nucleoto uridino (UNH)9e per l'adenosina/guanosina che preferiscono il riboidrolasi nucleoside (AGNH)10. Le reazioni catalizzate da questi due enzimi sono mostrate nella Figura 1. I saggi NMR vengono utilizzati per vagliare le librerie di frammenti per i punti di partenza chimici, determinare i valori IC50 e eserbare gli inibitori di legame basati sull'aggregazione o covalenti11. Gli stessi saggi vengono anche tradotti per valutare l'attività degli enzimi in intere cellule12.

Sono previsti protocolli dettagliati per i saggi composti iniziali a 500 m e 250 m, i saggi di risposta alla dose per determinare i valori IC50, i saggi dello schermo del controschermo del detergente, i saggi del controschermo jump-dilution e i saggi in E. coli intere cellule. I protocolli sono generalmente applicabili a qualsiasi enzima in cui il substrato e le risonanze dei prodotti possono essere osservati e distinti dalla spettroscopia NMR. Sono state fatte tre ipotesi per semplicità. In primo luogo, il substrato non è specificato. Affinché i saggi di attività basati su NMR siano utili, la concentrazione finale del substrato non dovrebbe essere superiore a 2-3 volte il valore Km 4. Negli esempi mostrati, le concentrazioni finali di adenosina e 5-fluorouridina sono rispettivamente 100 M (Km ) e 50 M (Km - 15 M ). Nei protocolli, il raggiungimento di queste concentrazioni corrisponde a 12 - L di 5 mM di adenosina o 12 L di 2,5 mM 5-fluorouridina.

In secondo luogo, è stata scelta la quantità di enzimi prevista nei protocolli, 5 L, per corrispondere alla quantità necessaria per ottenere circa il 75% di conversione del substrato in prodotto in 30 min. Questa quantità rappresenta in genere una grande diluizione da uno stock di enzimi purificato e la diluizione deve essere determinata in anticipo per ogni enzima. Le soluzioni di stock di enzimi Purificate AGNH e UNH sono immagazzinate a -80 gradi centigradi in aliquote che forniscono un enzima sufficiente per diverse migliaia di reazioni. Pertanto, il fattore di diluizione idealmente deve essere determinato o convalidato solo ogni pochi mesi. In terzo luogo, l'esperimento NMR 1D specifico non è specificato. Nei risultati rappresentativi, 1H NMR è indicato per AGNH10 e 19F NMR è indicato per UNH9, con l'esperimento NMR descritto nei riferimenti corrispondenti. La scelta dell'esperimento NMR dipende dalla reazione enzimatica e dai substrati disponibili, nonché dalla strumentazione NMR disponibile. Infine, va sottolineato che l'approccio sperimentale descritto non aderisce ai severi requisiti del NMR quantitativo (qNMR)13,14. Nel protocollo, una reazione percentuale viene determinata utilizzando i cambiamenti relativi di intensità della stessa risonanza in ogni spettro, piuttosto che determinando le concentrazioni assolute. Questo approccio elimina la necessità di modifiche di acquisizione ed elaborazione dei dati, nonché gli standard interni o esterni, necessari per qNMR.

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Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Saggi composti di prova iniziali a 500 e 250 M

  1. Preparare il substrato e testare il composto per le reazioni.
    1. Preparare soluzioni di stock di substrato (adenosina o 5-fluorouridina) in acqua e composto di prova di 50 mM in solforo dimetilo deuterato (DMSO). Fare riferimento alla sezione introduttiva per le concentrazioni di soluzione di substrato da utilizzare.
    2. Aggiungere 12 l di substrato (adenosina o 5-fluorouridina) a ciascuno dei quattro tubi di microfuge da 1,5 ml, 1–4.
    3. Aggiungete 6 -L di DMSO deuterated ai tubi 1 (controllo 0 min) e 4 (controllo 30 min). Aggiungere 6 -L di composto di prova al tubo 2. Aggiungere 3 -L di composto di prova e 3 -L di DMSO deuterato al tubo 3.
  2. Preparare una soluzione sufficiente per le scorte di reazione.
    NOTA: La soluzione stock è per cinque reazioni, ognuna delle quali contiene 517 l. di buffer, 60 l di ossido di deuterio e 5 l di soluzione enzimatica (AGNH o UNH). Fare riferimento alla sezione introduttiva per le concentrazioni di soluzione enzimatica da utilizzare.
    1. Aggiungere 2,59 mL di buffer di reazione (50 mM di fosfato di potassio, 0,3 M KCl, pH 6,5) a un tubo conico da 15 mL. Aggiungere al tubo conico 300 l di ossido di deuterio. Aggiungere al conico 25 di soluzione enzimatica (AGNH o UNH).
    2. Invertire delicatamente il tubo conico due volte per mescolare.
  3. Contemporaneamente avviare e dissondare la reazione di controllo 0 min. Trasferire 582 - L della soluzione del supporto di reazione in un tubo di microfuge pulito. Aggiungere 10 -L di 1,5 M HCl a questo tubo di microfuge. Trasferire il 592 l combinato nel tubo di microfuge 1. Aspirare e dispensare il campione due volte in modo lento ma deliberato.
  4. Avviare ed eseguire le restanti tre reazioni in modo sfalsato. Al momento 0 min, trasferire 582 l della soluzione del materiale di reazione al tubo di microfuge 2. Aspirare e dispensare il campione due volte in modo lento ma deliberato. Ripetere a intervalli di 30 s per i tubi di microfuge 3 e 4. Aspetta 30 min.
  5. Spegni le reazioni. Al momento 30 min, aggiungere 10 l una di 1,5 M HCl al microfuge 2. Ripetere a intervalli di 30 s per i tubi di microfuge 3 e 4. Trasferire 600 l di soluzione da ogni microfuge ai tubi NMR.
  6. Acquisire uno spettro NMR 1D su ogni campione. Elaborare i dati per garantire la corretta fase e le linee di base piatte.
  7. Calcolare la conversione percentuale del substrato per gli spettri di controllo.
    1. Sovrapporre gli spettri per i controlli 0 min e 30 min. Scalare il segnale del substrato nel controllo di 0 min in modo che corrisponda al controllo di 30 min. Notare questa percentuale.
    2. Calcolare la conversione percentuale come (100 – percentuale determinata nel passaggio 1,7,1).
  8. Calcolare la conversione percentuale del substrato per le reazioni contenenti il composto di prova.
    1. Spettri di sovrapposizione per il controllo di 0 min e prima reazione contenente il composto di prova di 500 M. Scalare il segnale del substrato nel controllo 0 min in modo che corrisponda allo spettro con il composto di prova. Notare questa percentuale. Calcolare la conversione percentuale come (100 – percentuale determinata).
    2. Ripetere l'operazione per la seconda reazione contenente il composto di prova da 250 M.
  9. Calcolare la reazione percentuale e l'inibizione percentuale per ogni concentrazione composta di prova.
    1. Calcolare la reazione percentuale come (1.8.1/1.7.2) x 100.
    2. Calcolare l'inibizione percentuale come (100 – percentuale determinata al punto 1.9.1).

2. Determinazione dei valori IC50

  1. Preparare il substrato e testare il composto per le reazioni.
    1. Preparare soluzioni stock di substrato (adenosina o 5-fluorouridina) in acqua e composto di prova di 10 mM in DMSO deuterato. Fare riferimento alla sezione introduttiva per le concentrazioni di soluzione di substrato da utilizzare.
  2. Preparare diluizioni seriali di 10 mM di composto di prova (in DMSO deuterato).
    1. Aggiungere 36 DMSO deuterated a cinque tubi di microfuge da 1,5 ml, 1–5.
    2. Aggiungere 12 10 mM composto di prova al tubo 1 e toccare leggermente per mescolare. Il composto di prova è ora di 2,5 mM.
    3. Trasferire 12 l'una dal tubo 1 al tubo 2 e toccare leggermente per mescolare. Il composto di prova è ora di 0,63 mM. Trasferire 12 l'l dal tubo 2 al tubo 3 e toccare leggermente per mescolare. Il composto di prova è ora 0,16 mM. Trasferire 12 l' dal tubo 3 al tubo 4 e toccare leggermente per mescolare. Il composto di prova è ora 0,04 mM. Trasferire 12 l' dal tubo 4 al tubo 5 e toccare leggermente per mescolare. Il composto di prova è ora 0,01 mM.
  3. Preparare i tubi di microfuge da 14 ml per le reazioni.
    1. Aggiungere 12 l di substrato (adenosina o 5-fluorouridina) a ciascuno dei 14 tubi di microfuge da 1,5 ml, 1-14.
    2. Aggiungere 12 ll di DMSO deuterated ai tubi 1 (controllo 0 min) e 14 (controllo 30 min).
    3. Aggiungere 12 mL di 10 mM di composto di prova ai tubi 2 e 3. Aggiungete 12 unità di prova di 2,5 m ai tubi 4 e 5. Aggiungete 12 unità di prova da 0,63 m ai tubi 6 e 7. Aggiungete 12 unità di prova da 0,16 m ai tubi 8 e 9. Aggiungete 12 unità di prova da 0,04 m ai tubi 10 e 11. Aggiungete 12 unità di prova da 0,01 m ai tubi 12 e 13.
  4. Preparare una soluzione sufficiente per eseguire 15 reazioni che contengono 511 l litri di tampone, 60 l- di ossido di deuterio e 5 l di soluzione enzimatica (AGNH o UNH) ciascuna. Fare riferimento alla sezione introduttiva per le concentrazioni di soluzione enzimatica da utilizzare.
    1. Aggiungere 7,67 mL di buffer di reazione (50 mM di fosfato di potassio, 0,3 M KCl, pH e 6,5) a un tubo conico da 15 mL. Aggiungere 900 l di ossido di deuterio al tubo conico. Aggiungere al cono 75 di soluzione enzimatica (AGNH o UNH).
    2. Invertire delicatamente il tubo conico 2x per mescolare.
  5. Seguire i passaggi descritti nei passaggi da 1,3 a 1,9 a (utilizzando 576 - L della soluzione del supporto di reazione) per determinare la reazione percentuale per ogni concentrazione composta di prova.
  6. Calcola il valore IC50 utilizzando GraphPad Prism.
    1. Creare una tabella di dati che correla il registro delle concentrazioni del composto di test di reazione (200 M, 50 M, 12,5 M, 3,13 , M, 0,78 M, 0,20 M) con reazione percentuale (due valori ciascuno).
    2. Utilizzare un adattamento di curva non lineare per determinare il valore IC50 e l'errore standard.

3. Assione dello schermo del contatore detergente a 100 m e 50 M

  1. Preparare il substrato e testare il composto per le reazioni.
    1. Preparare soluzioni stock di substrato (adenosina o 5-fluorouridina) in acqua e composto di prova di 10 mM in DMSO deuterato. Fare riferimento alla sezione introduttiva per le concentrazioni di soluzione di substrato da utilizzare.
    2. Aggiungere 12 l di substrato (adenosina o 5-fluorouridina) a ciascuno degli otto tubi di microfuge da 1,5 ml, 1-8.
    3. Aggiungete 6 L di DMSO deuterated ai tubi 1 e 5 (controlli 0 min) e 4 e 8 (30 min controls). Aggiungete 6 o più il di composto di prova ai tubi 2 e 6. Aggiungere 3 -L di composto di prova e 3 -L di DMSO deuterato ai tubi 3 e 7.
  2. Preparare una soluzione sufficiente del supporto di reazione SENZA detergente per eseguire cinque reazioni che contengono 517 l of tampone, 60 l di ossido di deuterio e 5 l di soluzione enzimatica (AGNH o UNH) ciascuna. Fare riferimento alla sezione introduttiva per le concentrazioni di soluzione enzimatica da utilizzare.
    1. Aggiungere 2,59 mL di buffer di reazione (50 mM di fosfato di potassio, 0,3 M KCl, pH e 6,5) a un tubo conico da 15 mL. Aggiungere al tubo conico 300 l di ossido di deuterio. Aggiungere al conico 25 di soluzione enzimatica (AGNH o UNH).
    2. Invertire delicatamente il tubo conico 2x per mescolare.
  3. Preparare una soluzione sufficiente del supporto di reazione con 0,01% v/v detergente Triton X-100 per eseguire cinque reazioni che contengono 517 l di tampone, 60 l di ossido di deuterio e 5 l di soluzione enzimatica (AGNH o UNH) ciascuna.
    1. Aggiungere 2 -L di detergente Triton X-100 a 20 mL di buffer di reazione (50 mM di fosfato di potassio, 0,3 M KCl, pH 6,5). Le soluzioni detergenti devono essere utilizzate entro 1 giorno.
    2. Aggiungere 2,59 mL di buffer di reazione contenente 0,01% detergente Triton X-100 a un tubo conico da 15 mL. Aggiungere al tubo conico 300 l di ossido di deuterio. Aggiungere al conico 25 di soluzione enzimatica (AGNH o UNH).
    3. Invertire delicatamente il tubo conico 2x per mescolare.
  4. Per i tubi da 1 a 4, utilizzando la soluzione di stock di reazione WITHOUT detergent, seguire i passaggi descritti nei passaggi da 1,3 a 1,9 per determinare l'inibizione percentuale per ogni concentrazione composta di prova.
  5. Per i tubi 5–8, utilizzando la soluzione di stock di reazione con 0.01% v/v Triton X-100 detergente, seguire i passaggi descritti nei passaggi da 1,3 a 1,9 per determinare l'inibizione percentuale per ogni concentrazione composta di prova.

4. Salto-diluizione schermo contatore dice

  1. Preparare il substrato e testare i composti per le reazioni
    1. Preparare soluzioni stock di substrato (adenosina o 5-fluorouridina) in acqua e composto di prova di 10 mM in DMSO deuterato. Fare riferimento alla sezione introduttiva per le concentrazioni di soluzione di substrato da utilizzare.
    2. Aggiungere 53,8 l di buffer di reazione (50 mM di fosfato di potassio, 0,3 M KCl, pH 6,5) a due tubi di microfuge da 1,5 ml (ciascuno), 1 e 2. Aggiungete 5 - L di enzimi (AGNH o UNH) ai tubi 1 e 2.
    3. Aggiungere 511 l di buffer di reazione a due tubi di microfuge da 1,5 mL, 3 e 4 (ciascuno). Aggiungere 60 -L di ossido di deuterio ai tubi 3 e 4. Aggiungete 5 - L di enzimi (AGNH o UNH) ai tubi 3 e 4.
    4. Aggiungete 1,2 l di DMSO deuterated al tubo 1 (controllo 30 min). Aggiungere 1,2 -L di composto di prova al tubo 2. Aggiungere 12 l di DMSO deuterated al tubo 3 (controllo 30 min). Aggiungere 12 -L di composto di prova al tubo 4. Incubare per 30 min.
  2. Preparare due tubi di microfuge da 1,5 ml con soluzione di diluizione.
    1. Aggiungere 468 l di buffer di reazione a ciascuno dei due tubi di microfuge da 1,5 ml, 5 e 6. Aggiungere 60 -L di ossido di deuterio ad ogni tubo (5 e 6).
  3. Preparare quattro tubi di microfuge da 1,5 mL per le reazioni.
    1. Aggiungere 12 l di substrato (adenosina o 5-fluorouridina) a ciascuno dei quattro tubi di microfuge da 1,5 mL, 7–10.
  4. Eseguire salti e avviare le reazioni.
    1. Trasferire 528 l di soluzione dal tubo 5 al tubo 1. Aspirare e dispensare il campione due volte in modo lento ma deliberato. Trasferire 528 l di soluzione dal tubo 6 al tubo 2. Aspirare e dispensare il campione due volte in modo lento ma deliberato.
    2. Al momento 0 min, trasferire 588 l di soluzione dal tubo 1 al tubo 7. Aspirare e dispensare il campione 2x in modo lento ma deliberato. A intervalli di 30 s, trasferire 588 l of solution dal tubo 2 al tubo 8, dal tubo 3 al tubo 9 e dal tubo 4 al tubo 10. Aspirare e dispensare il campione due volte in modo lento ma deliberato. Aspetta 30 min.
  5. Per i tubi 7–10, seguire i passaggi descritti nei passaggi da 1,5 a 1,9 per determinare l'inibizione percentuale per ogni concentrazione composta di prova.

5. Saggi composti nelle cellule intere di E. coli

  1. Preparare 10 mL di coltura notturna di E. coli il giorno precedente esperimenti.
  2. Preparare le cellule E. coli per gli esperimenti NMR.
    1. Centrifugare le cellule in 1 mL per 10 min a 15.000 x g.
    2. Scartare il supernatante e riutilizzare ogni cellule in 1 mL di buffer di reazione (50 mM di fosfato di potassio, 0,3 M KCl, pH 6,5) vorticando.
  3. Seguire le sezioni 1 o 2 per il saggio desiderato con le seguenti modifiche:
    1. Sostituire 280 l di buffer nella soluzione del supporto di reazione con 280 - L di celle risospese.
    2. Sostituite 5 -L di enzima (AGNH o UNH) nella soluzione del supporto di reazione con 5 L di tampone.

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nella figura 2 vengono illustrati i risultati per il test di due composti rispetto ad AGNH utilizzando 1H NMR seguendo la sezione 1. La reazione enzimatica è più facilmente osservabile e quantificata dalla scomparsa di risonzioni di adenosina singlet e doppietta a 8,48 ppm e 6,09 ppm, rispettivamente, e dalla comparsa di una risonanza singlet adenina a 8,33 ppm come osservato nel controllo di 30 min Spettro. In presenza di 500 m composto 1, nessun prodotto è formato come dimostra ...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I protocolli descritti sono generalmente applicabili a molti enzimi, a condizione che i substrati e/o i prodotti abbiano segnali risolvibili nello spettro NMR. Tuttavia, è fondamentale che la concentrazione di substrato sia vicina al suo valore Km e abbastanza elevata da essere rilevata in un esperimento NMR entro un lasso di tempo ragionevole. Una concentrazione di substrato non superiore a 2-3x il valore Km è ottimale per rilevare inibitori competitivi, non competitivi e non comp...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo il Dr. Dean Brown per aver fornito composti dalla libreria dei frammenti di Astra-eneca e dal Dr. David Parkin per aver fornito gli enzimi AGNH e UNH. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dall'Istituto Nazionale di Allergia e Malattie Infettive dei National Institutes of Health con il numero di premio R15AI128585 a B. J. S. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali dei National Institutes of Health.Research è stato sostenuto anche da una horace G. McDonell Summer Research Fellowship assegnata a S. N. M., una famiglia Landesberg Fellowship assegnato a J. A. G., e Faculty Development Grants e Frederick Bettelheim Research Award dall'Università di Adelphi a B. J. S.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AGNHPurificato in-houseN/ATVAG_213720
UNHPurificato in-houseN/ATVAG_092730
AdenosineSigmaA9251
5-FluorouridinaSigmaF5130
Dimetil solfossido-D6Cambridge Isotope LabsDLM-10-100D, 99,9%
Fosfato di potassio monobasicoSigmaP0662
Fosfato di potassio bibasicoSigmaP3786
Cloruro di potassioSigmaP9541
Ossido di deuterioCambridge Isotope LabsDLM-4-100D, 99,9%
Acido cloridricoFisher ChemicalA144212
Triton X-100SigmaX100
3-(Trimetilsilil)propionico-2,2,3,3,-d4 sale sodico acido (TSP)Sigma269913D, 98%
2,2,2-Trifluoroetanolo-1,1-d2Sigma612197D, 99,5%
PipettaGilsonF123602PIPETMAN Classic P1000
PipettaGilsonF123601PIPETMAN Classic P200
PipettaGilsonF123600PIPETMAN Classic P20
Provette per microfugheFisher Scientific05-408-129
Provette conicheCorning352099
MicrocentrifugaEppendorf5418
Miscelatore a vorticeFisher Scientific02215365
Provette NMRNorell502-7O a seconda dei casi per lo
spettrometro NMR NMRBrukerN/ AAvanceIII500
Prism softwareGraphPadN/AVersione 5.04

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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