La proliferazione è una parte fondamentale della funzione cellulare e una lettura comune utilizzata per valutare la potenziale tossicità di nuovi farmaci. Misurare la proliferazione è, quindi, un saggio frequentemente usato nella biologia cellulare. Qui presentiamo un metodo semplice e versatile di misurazione della proliferazione che può essere utilizzato in cellule aderenti e non aderenti.
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Articolo metodologico
Misurazione della proliferazione delle cellule muscolari lustiche vascolari utilizzando la chimica dei clic
In questo articolo
Sommario
Abstract
La capacità di una cellula di proliferare è parte integrante della normale funzione della maggior parte delle cellule, e la disregolazione della proliferazione è al centro di molti processi di malattia. Per questi motivi, la misurazione della proliferazione è uno strumento comune utilizzato per valutare la funzione cellulare. La proliferazione cellulare può essere misurata semplicemente contando; tuttavia, questo è un mezzo indiretto per misurare la proliferazione. Un mezzo comune per rilevare direttamente le cellule che si preparano a dividersi è l'incorporazione di analoghi nucleoside etichettati. Questi includono il nucleoside radioattivo analogico 3H-thymidine più analoghi nucleoside non radioattivi come la deossiuridina 5-bromo-2' (BrdU) e 5-ethynyl-2-deoxyuridina (EdU). L'incorporazione di EdU è rilevata dalla chimica del click, che ha diversi vantaggi rispetto a BrdU. In questa relazione, forniamo un protocollo per misurare la proliferazione con l'incorporazione di EdU. Questo protocollo include opzioni per varie letture, insieme ai vantaggi e agli svantaggi di ciascuna. Discutiamo anche dei luoghi in cui il protocollo può essere ottimizzato o modificato per soddisfare le esigenze specifiche dell'esperimento pianificato. Infine, tocchiamo i modi in cui questo protocollo di base può essere modificato per misurare altri metaboliti cellulari.
Introduzione
La proliferazione è una parte fondamentale della funzione cellulare1,2. Il controllo della proliferazione influenza i normali processi come lo sviluppo e i processi patologici come il cancro e le malattie cardiovascolari. La crescita iperplastica delle cellule muscolari lisce vascolari, per esempio, è pensata per essere un precursore dell'aterosclerosi3. I cambiamenti nella proliferazione cellulare sono utilizzati anche per valutare la potenziale tossicità di nuovi farmaci. Dato il suo impatto diffuso, la misurazione della proliferazione è un pilastro di molti laboratori basati sulla bi....
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Protocollo
1. Rilevamento di EdU utilizzando l'etichetta fluorescente
- Soluzioni stock
- Preparare una soluzione di stock EdU da 5 mM aggiungendo 12,5 mg di EdU a 10 mL di doppia distillazione H2O.
- Preparare i componenti della soluzione di etichettatura: 200 mM tris(3-hydroxyltriazolylmethyl)ammine(THPTA) (100 mg in 1,15 mL H2O), 100 mM CuSO4 (15,95 mg in 1 mL H2O; fare fresco), 10 mM Cy3 picolyl-azide (1 mg in 95 m.O.3 M. , conservato in 5 aliquote a -20 gradi centigradi) e 1 M di ascorbate di sodio (200 mg in 1 mL H2O; fare fresco).
- Preparare la soluzione di riserva retozurin....
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Risultati
Nella Figura 2viene illustrato i risultati di tre diversi esperimenti che misurano la proliferazione di VSMC in risposta a PDGF. Dopo aver coltivato le cellule nei media formulati per le SMC, abbiamo condotto l'esperimento nel DMEM senza siero, per eliminare eventuali effetti potenziali del siero o dei fattori di crescita sulla proliferazione. Nella Figura 2A confrontiamo i risultati, dallo stesso esperimento, utilizzando una lettura fluorescente vs luminescente.......
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Discussione
L'incorporazione di EdU è un modo semplice e diretto per misurare la proliferazione cellulare; è particolarmente utile per le cellule aderenti13. Il nostro protocollo utilizza cellule muscolari lisce, ma è applicabile a qualsiasi cellula aderente (epiteliale, endoteliale, ecc.). Anche se il protocollo non è complicato, l'unico passo critico è fare la soluzione di etichettatura - gli ingredienti devono essere aggiunti nell'ordine elencato. Inoltre, come le macchie occidentali chemiluminescenti, se .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Katie Carroll per l'assistenza tecnica. Ringraziamo anche il Dr. David Cool e il Laboratorio di Analisi Proteomics per l'istruzione e la fornitura del lettore di lastre di imaging Cytation. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione della Wright State Foundation (a L.E.W.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 5-etil-2'-deossiuridina | Carbosynth | NE08701 | |
| biotina picolil azide | Click Chemistry Tools | 1167-5 | |
| CuSO4 | Fisher Scientific | C1297-100G | |
| Cy3 picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1178-1 | |
| Lettore di piastre di citazione | Biotek | ||
| EVOS Microscopio | Thermo Fisher Scientific | ||
| Soluzione di perossido di idrogeno | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| Na ascorbato | Sigma-Aldrich | 11140-250G | |
| NucBlue Sonde pronte per la colorazione a celle fisse | Invitrogen | R37606 | DAPI colorazione nucleare |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | |
| Servizi | di microscopia elettronica | 15710 | |
| PBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Cloruro di sodio | Sigma Life Science | S3014-5kg | |
| Streptavidina Rafano perossidasi coniugato | Technologies | S911 | |
| Signal ELISA Femto | Thermo Scientific | PI137075 | substrato ELISA |
| Synergy Plate Reader | Biotek | ||
| THPTA | Click Chemistry Tools | 1010-100 | |
| Tris Idrossimetilamnometano cloridrato (Tris-HCl) | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Triton X 100 | Bio-Rad | 1610407 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
Riferimenti
- Fuster, J. J., et al. Control of cell proliferation in atherosclerosis: Insights from animal models and human studies. Cardiovascular Research. 86 (2), 254-264 (2010).
- Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell ....
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Ristampe e permessi
