Articolo metodologico

Misurazione della proliferazione delle cellule muscolari lustiche vascolari utilizzando la chimica dei clic

DOI:

10.3791/59930

⸱

30 ottobre 2019

 ,  , 
1Department of Neuroscience, Cell Biology, and Physiology, Wright State University, 2Department of Surgery, Boonshoft School of Medicine, Wright State University

In questo articolo

Sommario

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La proliferazione è una parte fondamentale della funzione cellulare e una lettura comune utilizzata per valutare la potenziale tossicità di nuovi farmaci. Misurare la proliferazione è, quindi, un saggio frequentemente usato nella biologia cellulare. Qui presentiamo un metodo semplice e versatile di misurazione della proliferazione che può essere utilizzato in cellule aderenti e non aderenti.

Abstract

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La capacità di una cellula di proliferare è parte integrante della normale funzione della maggior parte delle cellule, e la disregolazione della proliferazione è al centro di molti processi di malattia. Per questi motivi, la misurazione della proliferazione è uno strumento comune utilizzato per valutare la funzione cellulare. La proliferazione cellulare può essere misurata semplicemente contando; tuttavia, questo è un mezzo indiretto per misurare la proliferazione. Un mezzo comune per rilevare direttamente le cellule che si preparano a dividersi è l'incorporazione di analoghi nucleoside etichettati. Questi includono il nucleoside radioattivo analogico 3H-thymidine più analoghi nucleoside non radioattivi come la deossiuridina 5-bromo-2' (BrdU) e 5-ethynyl-2-deoxyuridina (EdU). L'incorporazione di EdU è rilevata dalla chimica del click, che ha diversi vantaggi rispetto a BrdU. In questa relazione, forniamo un protocollo per misurare la proliferazione con l'incorporazione di EdU. Questo protocollo include opzioni per varie letture, insieme ai vantaggi e agli svantaggi di ciascuna. Discutiamo anche dei luoghi in cui il protocollo può essere ottimizzato o modificato per soddisfare le esigenze specifiche dell'esperimento pianificato. Infine, tocchiamo i modi in cui questo protocollo di base può essere modificato per misurare altri metaboliti cellulari.

Introduzione

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La proliferazione è una parte fondamentale della funzione cellulare1,2. Il controllo della proliferazione influenza i normali processi come lo sviluppo e i processi patologici come il cancro e le malattie cardiovascolari. La crescita iperplastica delle cellule muscolari lisce vascolari, per esempio, è pensata per essere un precursore dell'aterosclerosi3. I cambiamenti nella proliferazione cellulare sono utilizzati anche per valutare la potenziale tossicità di nuovi farmaci. Dato il suo impatto diffuso, la misurazione della proliferazione è un pilastro di molti laboratori basati sulla biologia cellulare.

La proliferazione cellulare può essere misurata semplicemente contando le cellule se la popolazione cellulare di interesse si divide abbastanza rapidamente. Per le cellule a crescita più lenta, i conteggi delle cellule possono essere meno sensibili. La proliferazione è spesso misurata dall'incorporazione di analoghi nucleoside etichettati. Anche se il gold standard è di 3H-tiofina, molti laboratori si stanno allontanando da questo metodo data la disponibilità di alternative più recenti e non radioattive. Questi includono coloranti fluorescenti citoplasmici, rilevamento di proteine associate al ciclo cellulare e incorporazione di analoghi nucleoside non radioattivi come la deossiuridina 5-bromo-2' (BrdU) e 5-ethynyl-2-deoxyuridina (EdU)4.

I coloranti citoplasmici, come carboxyfluorescein diacetate succinimidil ester (CFSE), rilevano la proliferazione perché l'intensità del coloranti si dimezza ogni volta che la cellula si divide5. Questa tecnica è comunemente utilizzata nella citometria di flusso per le cellule non aderenti. Non è stato utilizzato molto per le cellule aderenti, ma con la nuova generazione di lettori di lastre di imaging questo può cambiare. La rilevazione delle proteine associate al ciclo cellulare attraverso tecniche basate su anticorpi (citometria di flusso, immunoistochimica, ecc.) è spesso utilizzata per tessuti o cellule non aderenti. Queste cellule/tessuti devono essere fissi e permeabilizzati prima della colorazione. Gli analoghi Nucleoside BrdU ed EdU sono simili nell'approccio a 3H-tiofina, ma senza l'inconveniente della radioattività. L'incorporazione di BrdU viene rilevata dagli anticorpi anti-BrdU, e quindi le cellule devono essere fisse e permeaabilizzate prima della colorazione. Inoltre, le cellule devono essere trattate con DNase per esporre l'epitopo BrdU.

L'incorporazione di EdU viene rilevata dalla chimica del click, in cui i gruppi alkyne e azide "click" insieme in presenza di rame catalitico. Entrambi i gruppi possono servire come molecola biosinteticamente incorporata o molecola di rilevamento4. Gli analoghi nucleoside disponibili in commercio hanno il gruppo alchino attaccato. Per i test di proliferazione, quindi, l'analogo nucleoside funzionalizzato alkyne viene rilevato da un'azide coniugata a un colore fluorescente o a un altro marcatore. L'incorporazione di EdU ha diversi vantaggi rispetto a BrdU. In primo luogo, perché i gruppi di alchine e azide non si trovano nelle cellule dei mammiferi, questa interazione è altamente specifica con uno sfondo basso6. Poiché entrambi i gruppi sono piccoli, le cellule non hanno bisogno di sottoporsi alla denaturazione del DNA per esporre l'analogo nucleoside come richiesto per BrdU7. Infine, la chimica del clic è altamente versatile e può essere utilizzata per l'etichettatura metabolica di DNA, RNA, proteine, acidi grassi e carboidrati8,9,10,11. Se l'obiettivo metabolicamente etichettato di interesse è sulla superficie cellulare, le cellule vive possono essere etichettate12. Inoltre, le cellule possono essere ulteriormente elaborate per la colorazione immunofluorescente con anticorpi.

Il protocollo seguente descrive l'uso dell'incorporazione EdU e la chimica dei clic per misurare la proliferazione nelle cellule muscolari lussuriane vascolari umane (Figura 1). Mostriamo tre diversi modi in cui l'incorporazione di EdU può essere misurata, risultati rappresentativi da ciascuno, e i loro vantaggi e svantaggi. Misurare la proliferazione tramite la chimica dei clic è particolarmente utile per le cellule aderenti e a bassa crescita. Inoltre, la morfologia della cellula è ben mantenuta e può anche essere eseguita una colorazione basata su anticorpi.

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Protocollo

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1. Rilevamento di EdU utilizzando l'etichetta fluorescente

  1. Soluzioni stock
    1. Preparare una soluzione di stock EdU da 5 mM aggiungendo 12,5 mg di EdU a 10 mL di doppia distillazione H2O.
    2. Preparare i componenti della soluzione di etichettatura: 200 mM tris(3-hydroxyltriazolylmethyl)ammine(THPTA) (100 mg in 1,15 mL H2O), 100 mM CuSO4 (15,95 mg in 1 mL H2O; fare fresco), 10 mM Cy3 picolyl-azide (1 mg in 95 m.O.3 M. , conservato in 5 aliquote a -20 gradi centigradi) e 1 M di ascorbate di sodio (200 mg in 1 mL H2O; fare fresco).
    3. Preparare la soluzione di riserva retozurin ad una concentrazione di 0,15 mg/mL. Filtrare sterilizzare e conservare 1 mLs a 4 gradi centigradi.
      NOTA: l'azide Picolyl è disponibile coniugata a diversi fluor, biotina e perossidasi di rafano (HRP).
  2. Etichettare le cellule muscolari lisce vascolari (VSMC) con EdU.
    NOTA: I VSMC umani sono stati isolati dalle arterie iliac attraverso l'escrescenza da pezzi di tessuto espiantati. Quando coltivato in supporti senza siero con insulina, transferrin, selenio queste cellule esprimono marcatori VSMC smoothelin, muscolo liscio catena pesante della miosina (SM-MHC) e SMC13.
    1. Piastra vascolare cellule muscolari lisce a 2 x 104/ mL nel mezzo di Aquila modificato di Dulbecco (DMEM) in una piastra di 96 pozze.
      NOTA: Le cellule sono coltivate a 37 gradi centigradi in supporti di cellule muscolari lisce con il 2% del siero bovino fetale.
    2. (Facoltativo) Lasciare diverse ore a notte per l'aderenza. Aggiungete a ogni pozzo 20 stock di resazurin l.. Incubare a 37 gradi centigradi per 3 h. Leggere il segnale di fluorescenza in un lettore di lamiere (560ex, 594em). Sostituire i supporti con DMEM fresco.
      NOTA: questo passaggio è facoltativo. Resazurin viene utilizzato per normalizzare i numeri di cella e spiegare la variabilità ben a pozzo nella placcatura14.
    3. Aggiungere la salina tampone di fosfato (PBS) o il fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) 30 ng/mL a 3-6 pozzetti per trattamento all'inizio del periodo di coltura e incubare per 72 h.
    4. Diluire 5 mM di azioni EdU a 1 mM. Aggiungete 2 l ad ogni pozzo (concentrazione finale di 20 M) per le ultime 24 h del periodo culturale di 72 h. Non aggiungere EdU a un set di repliche. Questi pozzi saranno utilizzati per determinare la fluorescenza/luminescenza di fondo.
      NOTA: la durata della coltura e dell'etichettatura con EdU è ottimizzata per le cellule muscolari lisce, ma potrebbe essere necessario modificarla per tipo di cella.
  3. Fissare le cellule in paraformaldeide (PFA).
    1. Rimuovere i supporti e aggiungere 150 L del 4% PFA (in PBS) per 10 min a temperatura ambiente.
    2. Togliere la PFA e aggiungere 150 l una dell'1% di polietilene glicole tert-octilphenyl ether (TX-100) (in acqua) per pozzo per 30 min a temperatura ambiente.
    3. Rimuovere Il TX-100 lavando tre volte con PBS.
      AVVISO: PFA è tossico, gestire con cura.
      NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. Le celle fisse possono essere conservate in PBS a 4 gradi centigradi.
  4. Rileva EdU incorporato.
    1. Fare la soluzione di etichettatura (10 mL per 96 pozze, utilizzando 60 pozzetti interni) poco prima dell'uso aggiungendo reagenti dalle soluzioni di riserva nel seguente ordine: THPTA 20 -L, CuSO4 20 L, Cy3 picolyl azide 5 - Naastabe 100 -L a PBS per un volume totale di 10 mL.
    2. Rimuovere pbS dai pozze e aggiungere 150 l di soluzione di etichettatura a ciascun pozzo. Incubare 30 min a 37 . Per rilevare tutti i nuclei, aggiungere 4,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) ad ogni pozzo. Leggere su un lettore di piastra di fluorescenza (Cy3 550ex, 570em; DAPI 350ex, 470em) o immagine al microscopio.
      NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. Le celle fisse e colorate possono essere conservate in PBS a 4 gradi centigradi e imagetate in un secondo momento.

2. Rilevamento di EdU mediante luminescenza

  1. Completare le sezioni 1.1–1.3.
  2. Preparare la salina con buffer DiS con 0,1% di polisoro20 (TBST).
  3. Bloccare i pozzi.
    1. Aggiungete 150 l di buffer di blocco (Tabella dei materiali) ad ogni pozzo e incubate per 90 min a temperatura ambiente.
    2. Rimuovere il buffer di blocco e lavare tre volte con 200 l- di PBS.
  4. Rileva EdU incorporato.
    1. Fare la soluzione di etichettatura come indicato nel passaggio 1.4.1, sostituendo l'azide biotina picolile con l'azide di Cy3 picolyl.
    2. Lavare i pozzi cinque volte con 200 l of TBST, con agitazione, 3 minuti per lavaggio.
    3. Quench perossidi con 150 -L di 0,3% H2O2 per 20 min a temperatura ambiente.
    4. Togliere H2O2 e lavare cinque volte con 200 l- di TBST, con agitazione di 3 minuti per lavaggio.
    5. Diluire la perosside streptavidina-rafano (SA-HRP; 1:200) in TBST e aggiungere 50 gradi all'altro a ogni pozzo. Incubare 1 h a temperatura ambiente.
    6. Lavare cinque volte con 200 gradi di TBST, con agitazione, 3 min per lavaggio.
    7. Aggiungete ad ogni pozzo 50 -L di assegno immunosorbena legata all'enzima chemiluminescente (ELISA).
    8. Leggere immediatamente nel lettore di piastre in grado di rilevare la luminescenza.

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Risultati

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Nella Figura 2viene illustrato i risultati di tre diversi esperimenti che misurano la proliferazione di VSMC in risposta a PDGF. Dopo aver coltivato le cellule nei media formulati per le SMC, abbiamo condotto l'esperimento nel DMEM senza siero, per eliminare eventuali effetti potenziali del siero o dei fattori di crescita sulla proliferazione. Nella Figura 2A confrontiamo i risultati, dallo stesso esperimento, utilizzando una lettura fluorescente vs luminescente...

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Discussione

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L'incorporazione di EdU è un modo semplice e diretto per misurare la proliferazione cellulare; è particolarmente utile per le cellule aderenti13. Il nostro protocollo utilizza cellule muscolari lisce, ma è applicabile a qualsiasi cellula aderente (epiteliale, endoteliale, ecc.). Anche se il protocollo non è complicato, l'unico passo critico è fare la soluzione di etichettatura - gli ingredienti devono essere aggiunti nell'ordine elencato. Inoltre, come le macchie occidentali chemiluminescenti, se ...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Katie Carroll per l'assistenza tecnica. Ringraziamo anche il Dr. David Cool e il Laboratorio di Analisi Proteomics per l'istruzione e la fornitura del lettore di lastre di imaging Cytation. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione della Wright State Foundation (a L.E.W.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
5-etil-2'-deossiuridinaCarbosynthNE08701
biotina picolil azideClick Chemistry Tools1167-5
CuSO4Fisher ScientificC1297-100G
Cy3 picolyl azideClick Chemistry Tools1178-1
Lettore di piastre di citazioneBiotek
EVOS MicroscopioThermo Fisher Scientific
Soluzione di perossido di idrogenoSigma-Aldrich216763
Na ascorbatoSigma-Aldrich11140-250G
NucBlue Sonde pronte per la colorazione a celle fisseInvitrogenR37606DAPI colorazione nucleare
Odyssey Blocking BufferLi-Cor927-40000
Servizidi microscopia elettronica15710
PBSFisher ScientificSH3002802
Cloruro di sodioSigma Life ScienceS3014-5kg
Streptavidina Rafano perossidasi coniugatoTechnologiesS911
Signal ELISA FemtoThermo ScientificPI137075substrato ELISA
Synergy Plate ReaderBiotek
THPTAClick Chemistry Tools1010-100
Tris Idrossimetilamnometano cloridrato (Tris-HCl)Fisher ScientificBP153-500
Triton X 100Bio-Rad1610407
Tween 20Fisher ScientificBP337-100
per paraformaldeide Life Super

Riferimenti

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