I cloroplasti sono gli organelli che definiscono lepiante 1. Insieme a molte altre funzioni metaboliche, di sviluppo e di segnalazione, i cloroplasti sono responsabili della fotosintesi – il processo attraverso cui l'energia solare viene sfruttata per alimentare le attività cellulari della vita. Di conseguenza, i cloroplasti sono essenziali, non solo per le piante ma anche per la miriade di ecosistemi che dipendono dalle piante e per l'agricoltura. I cloroplasti sono composti da migliaia di proteine diverse, la maggior parte delle quali è codificata nel nucleo e importata dal citosolo prima di essere inviata internamente in uno dei numerosi compartimenti intraorganellari chiaramentedistinti. Per raggiungere una comprensione più completa dello sviluppo e delle funzioni dei cloroplasti, e per abilitare strategie biotecnologiche che coinvolgano la manipolazione dei cloroplasti che affrontino sfide globali legate alla sicurezza alimentare o alla bioenergia, sarà essenziale determinare il targeting, la localizzazione e le interazioni di importanti proteine dei cloroplasti. Questa raccolta di metodi descrive un insieme di tecniche criticamente importanti e complementari che possono essere utilizzate per raggiungere questi obiettivi. La collezione si concentra principalmente sulla pianta modello molto utilizzata Arabidopsis thaliana (crescione thale), ma i metodi possono essere adattati e applicati anche ad altri organismi.
La collezione include descrizioni di due diverse tecniche per analizzare l'importazione di proteine codificate nel nucleo nei cloroplasti attraverso l'involucro a doppia membrana. L'articolo di Ling eJarvis 2 descrive un metodo in vitro in cui i cloroplasti isolati vengono incubati con una proteina precursore marcata radioattivamente. La misura in cui i cloroplasti assorbono la proteina precursore è determinata monitorando il cambiamento di dimensione della proteina che avviene come risultato della scissione del peptide di transito (sequenze leader di indirizzo), utilizzando SDS-PAGE e immagini al fosforo. Il metodo presentato è uno sviluppo di un approccio utilizzato per studiare l'importazione di proteine di cloroplasti in vitro da diversi decenni 3,4, e incorpora ulteriori passaggi che permettono di valutare la reattività dei macchinari d'importazione alle condizioni di stress vistedall'impianto 5. D'altra parte, l'articolo di Lee et al.6 descrive un metodo in vivo basato sull'espressione transitoria di una proteina precursore chimerica, che trasporta un dominio proteico fluorescente, in cellule intatte (protoplasti). In questo saggio, l'entità dell'importazione di proteine di cloroplasti può essere seguita in due modi diversi: monitorando la localizzazione e l'intensità del segnale di fluorescenza tramite microscopia a fluorescenza; e analizzando il cambiamento di dimensione della proteina che avviene come risultato della scissione peptidica in transito tramite immunoblotting. Questi due metodi sono altamente complementari e possono offrire risultati convincenti se usati insieme inparallelo 5.
Una volta che una proteina è stata importata attraverso l'involucro nel cloroplasto e il suo peptide di transito è stato rimosso, può assumere la sua conformazione finale nello stroma (il principale compartimento acquoso interno dell'organello), oppure attivare una delle numerose vie interne di selezione1. Essendo il sito dei complessi fotosintetici altamente abbondanti, le membrane tilacoidi rappresentano una destinazione importante per questo tipo di selezione interna; In effetti, il targeting delle proteine tilacoidi coinvolge vie multiple e meccanicicamente distinte. L'articolo di Asher et al.7 descrive una serie di metodi in vitro che permettono di studiare diverse vie di traslocazione delle proteine tilacoidi. Questi metodi prevedono l'incubazione di tilacoidi isolati con proteine precursori marcate radioattivamente e, in alcuni casi, un estratto stromaico concentrato. La misura in cui la proteina viene assorbita dai tilacoidi viene monitorata valutando la clivagatura del segnale di puntamento e la protezione della proteina contro la termolisina proteasi applicata esogenamente, utilizzando SDS-PAGE e immagini al fosforo. Naturalmente, i tilacoidi non sono l'unico sottocompartimento del cloroplasto, e spesso è auspicabile avere la capacità di valutare anche altri compartimenti. A questo proposito, l'articolo di Bouchnak et al.8 è particolarmente importante, poiché descrive metodi per la subfrazionazione dei cloroplasti al fine di produrre campioni altamente puri corrispondenti alle membrane dell'involucro, allo stroma e ai tilacoidi. Una volta preparate, queste frazioni possono essere analizzate tramite immunoblotting e/o spettrometria di massa, al fine di fornire una ricca quantità di informazioni sulla localizzazione suborganellare delle proteine deicloroplasti 9.
Per quanto riguarda l'analisi delle interazioni proteina-proteina e degli assemblaggi multiproteici complessi, nella raccolta sono descritte due metodologie diverse. L'articolo di Shanmugabalaji et al.10 presenta un metodo per la purificazione di affinità dei complessi multiproteici cloroplastici. Questa tecnica prevede l'analisi di piante transgeniche che esprimono una componente del complesso di interesse progettata per portare un tag di affinità (il cosiddetto tag tandem di purificazione dell'affinità, o tag TAP). La capacità di questo tag di legarsi fortemente a una matrice altrimenti inerte viene sfruttata come parte della strategia di purificazione. Il metodo presentato si concentra specificamente sulla purificazione del meccanismo di importazione di proteine di cloroplasti (che comprende complessi multiproteici chiamati TOC e TIC incorporati nelle membranedell'involucro 1), ma in linea di principio può essere adattato per studiare qualsiasi altro gruppo multiproteico presente nei cloroplasti11. L'articolo di Rantala et al.12 descrive un approccio complementare alla caratterizzazione complessa basato sull'elettroforesi in condizioni native. La tecnica, come presentata qui, prevede la liberazione di complessi fotosintetici da tilacoidi purificati utilizzando detersivi morbidi e non ionici, seguita dalla loro separazione tramite blue native (BN)-PAGE. La risoluzione primaria dei complessi può essere seguita da una seconda dimensione di elettroforesi in condizioni di denaturazione, permettendo la visualizzazione dei singoli componenti di ciascun complesso identificato nella prima dimensione. Come per il metodo TAP, questo approccio nativo PAGE può essere adattato con successo per studiare altri complessi proteici all'internodell'organello 13,14. Con entrambi gli approccio, i complessi purificati possono essere analizzati in vari modi, tra cui immunoblotting e spettrometria di massa.
Insieme, gli articoli inclusi in questa raccolta di metodi presentano un potente insieme di tecniche complementari che, in combinazione con le risorse esistenti15,16, possono essere impiegate per migliorare notevolmente la nostra comprensione dei diversi aspetti della biogenesi e della funzione dei cloroplasti, in particolare quelli strettamente collegati al proteoma organellare. Poiché i cloroplasti sono responsabili della maggior parte della produzione primaria fotosintetica terrestre e hanno inoltre ruoli vitali nelle risposte delle piante all'ambiente (inclusi sia gli stress biotici che abiotici), questi straordinari organelli rimarranno inevitabilmente un importante fulcro della ricerca fondamentale e applicata a livello globale per gli anni a venire.