Articolo metodologico

Estrazione di Cortisol da Sturgeon Fin e Matrici Jawbone

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DOI:

10.3791/59961

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10 settembre 2019

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1College of Animal Life Sciences, Kangwon National University, 2Team of An Educational Program for Specialists in Global Animal Science, Brain Korea 21 Plus Project, Konkuk University, 3Persian Gesture, 4Department of Animal Science and Technology, College of Animal Bioscience and Technology, Konkuk University, 5Department of Animal Science, Animal Physiology, AgResearch, 6Faculty of Agriculture, Animal Science Department, Ferdowsi University of Mashhad

In questo articolo

Sommario

In questo studio, presentiamo un protocollo per l'estrazione del cortisolo dalla pinna e mascella delle specie di storione. I livelli di cortisolo di pinna e mascella sono stati ulteriormente esaminati confrontando due solventi per il lavaggio seguiti dai saggi ELISA. Questo studio ha sperimentato la fattibilità del cortisolo mascellare come un nuovo indicatore di stress.

Abstract

Gli obiettivi di questo studio erano di sviluppare una tecnica per l'estrazione del cortisolo dalle pinne di storione utilizzando due solventi di lavaggio (acqua e isopropanolo) e quantificare eventuali differenze nei livelli di cortisolo tra tre specie di storione principali. Le pinne sono state raccolte da 19 storioni sacrificati tra cui sette beluga (Huso huso), sette siberiani (Acipenser baerii), e cinque sevruga (A. stellatus). Gli storioni sono stati raccolti nelle aziende agricole iraniane per 2 anni (2017-2018), e l'analisi dell'estrazione del cortisolo è stata condotta in Corea del Sud (gennaio-febbraio 2019). Le ossa della Mascella di cinque H. huso furono usate anche per l'estrazione del cortisolo. I dati sono stati analizzati utilizzando la procedura glM (General Linear Model) nell'ambiente SAS. I coefficienti di variazione intra-e inter-saggio sono stati rispettivamente di 14,15 e 7,70. In breve, la tecnica di estrazione del cortisolo prevedeva il lavaggio dei campioni (300 x 10 mg) con 3 mL di solvente (acqua ultrapura e isopropanolo) due volte, rotazione a 80 giri/ per 2,5 min, asciugatura d'aria dei campioni lavati a temperatura ambiente (22-28 gradi centigradi) per 7 giorni, ulteriore i campioni che utilizzano un battitore di perline a 50 Hz per 32 min e li macinano in polvere, applicando 1,5 mL di metanolo alla polvere essiccata (75 x 5 mg) e una rotazione lenta (40 giri/) per 18 h a temperatura ambiente con miscelazione continua. Dopo l'estrazione, i campioni sono stati centrifugati (9.500 x g per 10 min), e 1 supernatante mL è stato trasferito in un nuovo tubo di microcentrifuga (1,5 mL), incubato a 38 gradi centigradi per far evaporare il metanolo e analizzato tramite l'analisi immunosorante legata agli enzimi (ELISA) . Non sono state osservate differenze nei livelli di cortisolo delle pinne tra le specie o nei livelli di cortisolo a pinna e mascella tra i solventi di lavaggio. I risultati di questo studio dimostrano che la matrice della mascella dello storione è un indicatore di sollecitazione alternativa promettente alle matrici solide.

Introduzione

Cortisolo è un indicatore affidabile dello stress animale. L'estrazione del cortisolo fornisce un quadro valido per i ricercatori per monitorare i livelli di stress e modelli generali nei fattori di stress. Ad esempio, studi precedenti hanno condotto la convalida metodologica delle misurazioni del cortisolo dei capelli utilizzando vari metodi in esseri umani1,2, scimmie3,4, bovini5, pecore6, e pesce rosso7,8. Nelle specie ittiche, le misurazioni del cortisolo in matrici come squame, muco cutaneo, feci e sangue9 hanno dimostrato di fornire informazioni sulla salute dei pesci. Quando il campionamento del sangue è problematico o mancano le scale, sono necessarie matrici alternative per l'estrazione del cortisolo. Nei pesci, matrici alternative possono includere la mascella, un tessuto duro simile al dente umano10.

Lo sviluppo di nuove matrici e tecniche convalidate per determinare i livelli di stress del pesce è di particolare interesse per l'industria del caviale, dove lo storione può sperimentare un'esposizione prolungata a fattori di stress ambientale11. Il sesso di storione non può essere determinato prima dei 2 anni di età, e lo storione non ha squame. Poiché il cortisolo si accumula gradualmente in matrici solide durante la fase di crescita2,7,12, i dati di accumulo di cortisolo a lungo termine da matrici dure come pinne e mascelle potrebbero fornire informazioni sullo stress diverse fasi di crescita. Al contrario, i livelli di cortisolo nel sangue forniscono un'istantanea dei livelli di stress al momento della morte e non possono rappresentare con precisione lo stress durante le condizioni di allevamento a lungo termine13,14. Con l'aumento della concorrenza nel mercato dei caviale, nuovi approcci per migliorare le condizioni di stress per la produzione di ovuli più sani tra le specie di storione durante l'allevamento a lungo termine (8-12 anni o più) sono un'area di ricerca sempre più importante. A causa dell'elevato costo dello storione, i campioni raccolti sono estremamente costosi (8.000-15.000 dollari per pesce maturo a seconda delle specie e della fase di crescita), un fattore limitante per i progetti di ricerca. Tuttavia, lo sviluppo di una tecnica appropriata per l'estrazione del cortisolo dalle pinne di storione e dalle mascelle potrebbe essere utilmente applicato sia ai sistemi di allevamento ittico che ai pesci selvatici per migliorare la qualità e la raccolta delle uova di storione sia per il consumo che per conservazione.

Oltre a fornire risultati affidabili6, la selezione di un'adeguata tecnica di estrazione del cortisolo è di fondamentale importanza per garantire che altri composti presenti nella matrice durante la preparazione del campione non confondano l'output, il che potrebbe portare a risultati incoerenti. È altrettanto importante determinare se i livelli di cortisolo pinna e mascella sono influenzati dai livelli di ormone nell'acqua circostante. L'Heimbàrge et al.15 ha suggerito che una serie di fattori possono influenzare i livelli di cortisolo tra cui età, sesso, gravidanza, stagione, colore12e regione del corpo da cui il cortisolo viene estratto16. Tuttavia, sono disponibili poche informazioni sugli effetti dei solventi per il lavaggio sull'estrazione del cortisolo nelle matrici del corpo dei pesci8e nessuna su questi effetti nello storione, fatta eccezione per le uova di storione17.

Anche se l'analisi dei livelli di cortisolo di base dalle pinne e dalle ossa mascellari dello storione richiede che il pesce sia eutanasia, questo approccio non comporta le tecniche invasive necessarie per il campionamento del sangue nello storione vivo. I campioni di pinne e mascelle sono facilmente raccolti e l'estrazione da questi tessuti può essere eseguita rapidamente. Allo stesso modo, l'estrazione e l'analisi degli ormoni sono semplici e richiedono poche attrezzature specializzate.

In questo studio, presentiamo una nuova tecnica e facilmente applicata per l'estrazione, il lavaggio e la determinazione del cortisolo dalle pinne di pesce e dalle mascelle, con l'obiettivo di determinare se i livelli di cortisolo misurati da queste matrici possono essere utilizzati in modo affidabile come stress Indicatori. I vantaggi di questa tecnica includono un approccio8 facile e non invasivo, meno variazioni di dati e uscita affidabile1,6,8,17; la tecnica è applicabile alle specie ittiche senza squame come lo storione. La tecnica richiede la macellazione del pesce, la selezione di adeguati solventi di lavaggio2,4, corretta macinazione dei campioni3,5, saggio immunosorbente enzimatico professionale (ELISA) applicazione5,7, e una vasta conoscenza dell'incorporazione di fonti di cortisolo in matrici solide6.

Abbiamo applicato due diversi solventi per il lavaggio (acqua ultrapura e isopropanolo) per ottenere livelli di cortisolo basale nelle pinne da tre specie di storione: beluga (Huso huso), Siberian (Acipenser baerii), e sevruga (A. stellatussa ), in condizioni ambientali standard per ciascuna specie. Le ossa di H. huso furono usate anche per valutare lo stress nello storione. Questo è il primo studio per misurare i livelli di cortisolo nelle ossa mascellari di storione. I risultati di questo studio forniranno dati comparativi di cortisolo per le specie di storione nella fase di crescita precoce (1 anno) prima della determinazione del sesso.

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Protocollo

Le seguenti procedure e metodi sperimentali sono stati approvati dall'Autorità per il benessere e l'etica degli animali della Kangwon National University, Chuncheon, Repubblica di Corea.

1. Collezione Fin

  1. Catturare delicatamente lo storione usando una rete per ridurre al minimo le lesioni e lo stress.
  2. Sciacquare il pesce con attenzione con acqua dolce e quindi pulire la superficie del corpo con un asciugamano assorbente prima dell'eutanasia.
  3. Colpisci la testa del pesce usando un martello di plastica in modo che il pesce sia stordito o perda conoscenza. Rimuovere la testa con un coltello.
  4. Misurare il peso corporeo (g) e la lunghezza (cm).
  5. Dopo l'eutanasia, raccogliere i campioni di pinna tagliando il più vicino possibile al corpo utilizzando forbici chirurgiche sterilizzate.
    NOTA: per ogni pesce devono essere utilizzati asciugamani assorbenti singoli e non riciclati. Le statistiche descrittive per le specie utilizzate in questo studio sono state le seguenti: storione beluga (H. huso): età : 18 2,1 mesi, peso corporeo , 2.700 x 300 g, e lunghezza del corpo 55 , 5 cm; Storione siberiano(A. baerii): età: 9,6 x 2,4 mesi, peso corporeo , 1.750 x 250 g, e lunghezza del corpo: 45 x 5 cm; Storione di sevruga(A. stellatus): età : 14 x 1,3 mesi, peso corporeo 1.000 x 100 g, e lunghezza del corpo 65 x 5 cm.

2. Preparazione fin per l'estrazione del cortisolo

  1. Collocare i campioni di pinne (un campione per tessuto: 3 g) su carta da pesatura di laboratorio (107 mm e 210 mm) e asciugarli a temperatura ambiente per alcuni giorni fino all'asciutto.
  2. Avvolgere i campioni in fogli di foglio di alluminio, mettere in sacchetti di plastica etichettati, e trasferire al laboratorio.
  3. Conservare i campioni in frigorifero per un ulteriore utilizzo, tra cui lavaggio, estrazione del cortisolo, essiccazione e analisi ELISA (Figura 2).

3. Fin cortisolo analisi

  1. Calibrare la bilancia analitica digitale (precisione: 0.0001) e pesare campioni da 300 x 10 mg con carta di pesatura sulla teglia della bilancia.
  2. Lavare i campioni.
    1. Trasferire ogni campione in un tubo di polipropilene conico da 15 L. Aggiungere 3 mL di isopropanolo ad ogni tubo utilizzando una pipetta a canale singolo da 5.000 l.
    2. Ruotare i tubi a 80 giri per 2,5 min per lavare il cortisolo e rimuovere qualsiasi potenziale contaminazione esterna. Ripetere questa procedura due volte.
    3. Asciugare all'aria i campioni lavati a temperatura ambiente (22-28 gradi centigradi) per 7 giorni.
    4. Ripetere la procedura di lavaggio utilizzando acqua ultrapura come agente di lavaggio.
  3. Estrarre l'osso mascellare dal tessuto corporeo utilizzando pinze di taglio osseo. Applicare i passaggi da 1.5 a 3.2.4 ai campioni della mandibola.
  4. Pesare i campioni di pinna o mascella essiccati (75 x 5 mg) e macinare con un battitore di perline a 50 Hz per 32 min.
    1. Fornire 1,5 mL di metanolo in ogni tubo contenente pinna o mascella in polvere utilizzando una pipetta da 1000 L. Posizionare i campioni su un rotatore tubo a rotazione lenta (40 giri/) per 18 h a temperatura ambiente per estrarre il cortisolo con miscelazione continua.
  5. Dopo l'estrazione del cortisolo, centrifugare i campioni a 9.500 x g per 10 min a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, raccogliere lo strato organico superiore contenente cortisolo (1 mL) da ogni campione e collocarlo in un tubo di microcentrifuga separato da 1,5 mL.
    1. Asciugare i campioni per incubazione a 38 gradi centigradi per far evaporare il metanolo. Tenere i campioni di cortisolo estratti sotto una cappa di fumi durante la notte per consentire al metanolo di dissiparsi.
      NOTA: Lo strato contenente cortisolo è di solito di colore giallastro.

4. Rilevamento cortisolo fin

  1. Scongelare i campioni di pinna secca o mascella a temperatura ambiente per 1,5 h prima di utilizzare il kit ELISA.
  2. Aggiungere 400 l di tampone di fosfato, vortice e centrifugaa a 1.500 x g per 15 min.
  3. Eseguire ogni campione (25 l) in duplicato per migliorare la precisione e l'affidabilità del saggio. Rimuovere tutti i dati al di fuori della curva standard come outlier.
  4. Impostare un lettore di micropla a 450 nm, quindi impostare su .g dL-1 e leggere la densità ottica della piastra.
    1. Utilizzare il software microplacca con una curva di regressione non lineare a quattro parametri. Convertire i livelli di cortisolo dei campioni ottenuti dal software in pg mg-1 utilizzando la seguente equazione:
      F - 10.000E (A/B) (C/D),
      dove F - il valore finale del livello di cortisolo pinna in (pg mg-1), E - il volume (mL) del buffer di prova utilizzato per ricostituire l'estratto essiccato, A - la concentrazione (g dL-1) fornita dall'uscita del saggio, B - il peso (mg) della pinna sottoposta a extra Ction, C - il volume (mL) del metanolo aggiunto alla pinna in polvere, e D - il volume (mL) del metanolo recuperato dall'estratto e successivamente essiccato3.

5.Analisi statistica

  1. Dividere ogni campione in due sottocampioni prima della procedura di lavaggio e quindi eseguire in duplicato durante il test del kit ELISA (2 x 2 x 4 osservazioni per campione) per migliorare la potenza del test e l'affidabilità dei risultati.
  2. Confrontare gli effetti dei due solventi di lavaggio e le loro interazioni applicando la procedura del modello lineare generale (GLM) nell'ambiente software SAS ai dati di misurazione18.
  3. Verificare le differenze tra i mezzi utilizzando il test di Tukey a un livello di significatività di p < 0.05. Accettare 0,05 < p < 0,10 come prova di una tendenza anziché come differenza significativa.

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Risultati

La tecnica di estrazione del cortisolo pinna presentata è stata sviluppata e confermata in questo studio utilizzando tre specie di storione. I livelli di cortisolo ottenuti utilizzando acqua ultrapura e isopropanolo come solventi per il lavaggio sono stati confrontati (Figura 2). Cortisolo da H. huso mascella ossa è stato esaminato per determinare se gli storioni possono essere utilizzati come matrice alternativa alle pinne. Gli effetti del solvente ...

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Discussione

Sturgeon è talvolta chiamato un "fossile vivente" perché ha mostrato pochi adattamenti nel corso dei millenni passati. Il genere storione Acipenser contiene 27 specie che producono caviale; tuttavia, tre specie (beluga, baerii e sevruga) producono la maggior parte dell'approvvigionamento di caviale globale. Gli storioni sono vulnerabili alla pesca eccessiva e alle interferenze nel loro habitat naturale e sono quindi più a rischio di estinzione di qualsiasi altro gruppo di specie. Sturgeon appartiene al più antic...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato condotto con il supporto del Programma di Ricerca Cooperativa per l'Agricoltura Scienza & Sviluppo Tecnologico (titolo del progetto: Analisi della produttività del bestiame con il cambiamento climatico, Progetto n. PJ012771), Amministrazione dello sviluppo rurale, Repubblica di Corea. Inoltre, questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione (No. PJ01344604) dell'Animal Nutrition & Physiology Team, Istituto Nazionale di Scienze Animali, RDA, Seoul, Repubblica di Corea. Gli autori riconoscono con gratitudine il CEO dei gesti persiani Mohammad Hassan Salmanzadeh e il suo team, che ha fornito pesce delle tre specie di storione esaminate in questo studio.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Guanti chirurgici in lattice per lo smaltimentoAnsell63754090
Bilancia a piattaforma-pesatura elettronica 100kgBaskoolnikoo101 EM
Pipetta sierologica per erogare fino a 24 mLBecton Dickinson Falcon35-7550
Micro lettore di piastre con filtri di riferimento da 450 nm e da 490 a 492 nmSerbatoi8041000
BrandTech703459
Sacchetto di plastica per la conservazione con cerniera Cleanwrap30cm x100m
Alcool isopropilicoDaejung prodotti chimici & Metalli 5035-4400
Alcool metilicoDaejung prodotti chimici & Metalli 5558-4100
Rotatore per tubi - MX-RL-ProDLAB Scientific 824-222217777
Pipetta di precisione per erogare 1,5 e 10 mLEppendorf Research PlusM21518D
  Pipetta di precisione per erogare 15 e 25 μ LEppendorf Research PlusR25623C
Carta per pesare (107 x 210 mm)Fisherbrand09-898-12B
Battitore di perline, 50/60 Hz 2AGeneReach Biotechnology Corptp0088
Rotatore a piastre con orbita in grado di raggiungere 500 giri/minHangzhou Miu Instrument MU-E30-1044
Provette monouso in polipropilene per contenere almeno 24 mLHyundai MicroH20050
Cappa aspiranteKwang Dong IndustrialKD 901-22128175
Micro-centrifuga capace di 1500 x gLabo Gene  9.900.900.729
Mini miscelatore a vorticeLMSVTX-3000L 
Rotolo di foglio di alluminio Lotte Lotte AluminiumB0722X5FK5
Bilancia digitaleMettler Toledo   ME204
Acqua ultrapuraMDMMDM-0110
Puntali per pipetteNeptuneScientific REF 2100.N
Rete per pesci grandeLaghetto H2OHoz135 
Kit cortisolosalivare Salimetrics1-3002-4
Pinze per taglio osseoSankyo26-188A
Pipetta multicanale di precisione per erogare 50 μ L e 200 μ LVITLAB18A68756
AsciugamanoYuhan Kimberly1707921546
Carta velina (107 &volte; 210)Yuhan Kimberly41117
di reagenti BioTek

Riferimenti

  1. Meyer, J. S., Novak, M. A. Hair cortisol: a novel biomarker of hypothalamic-pituitary- adrenocortical activity. Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).
  2. Ghassemi Nejad, J., et al. A cortisol study: facial hair and nails. Journal of Steroids Hormonal Sciences. 7, 1-5 (2016).
  3. Meyer, J. S., Novak, M. A., Hamel, A., Rosenberg, K. Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair. Journal of Visualized Experiments. (83), e50882(2014).
  4. Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. General and Comparative Endocrinology. 147, 255-261 (2006).
  5. Ghassemi Nejad, J., Ataallahi, M., Park, H. K. Methodological validation of measuring Hanwoo hair cortisol concentration using bead beater and surgical scissors. Journal of Animal Science and Technology. 61, 41-46 (2019).
  6. Ghassemi Nejad, J., et al. Wool cortisol is a better indicator of stress than blood cortisol in ewes exposed to heat stress and water restriction. Animal. 8, 128-132 (2014).
  7. Brossa, A. C. Cortisol in skin mucus and scales as a measure of fish stress and habitat quality. Ph.D. dissertation. , Faculty of Veterinary Medicine, Universitat Autonoma de Barcelona. Ph.D. dissertation (2018).
  8. Carbajal, A., et al. Cortisol detection in fish scales by enzyme immunoassay: biochemical and methodological validation. Journal of Applied Ichthyology. 34, 1-4 (2018).
  9. Bertotto, D., et al. Alternative matrices for cortisol measurement in fish. Aquaculture Research. 41, 1261-1267 (2010).
  10. Ghassemi Nejad, J., Jeong, C., Shahsavarani, H., Sung, I. K., Lee, J. Embedded dental cortisol content: a pilot study. Endocrinology & Metabolic Syndrome. 5, 240(2016).
  11. Pankhurst, N. W. The endocrinology of stress in fish: an environmental perspective. General and Comparative Endocrinology. 170, 265-275 (2011).
  12. Ghassemi Nejad, J., Kim, W. B., Lee, B. H., Sung, K. I. Coat and hair color: hair cortisol and serotonin levels in lactating Holstein cows under heat stress conditions. Animal Science Journal. 88, 190-194 (2017).
  13. Baker, M. R., Gobush, K. S., Vynne, C. H. Review of factors influencing stress hormones in fish and wildlife. Journal of Nature Conservation. 21, 309-318 (2013).
  14. Aerts, J., et al. Scales tell a story on the stress history of fish. PLoS One. 10, e0123411(2015).
  15. Heimbürge, S., Kanitz, E., Otten, W. The use of hair cortisol for the assessment of stress in animals. General and Comparative Endocrinology. , 10-17 (2019).
  16. Ghassemi Nejad, J., et al. Comparing hair cortisol concentrations from various body sites and serum cortisol in Holstein lactating cows and heifers during thermal comfort zone. Journal of Veterinary Behavior: Clinical and Application Research. 30, 92-95 (2019).
  17. Bussy, U., Wassink, L., Scribner, K. T., Li, W. Determination of cortisol in lake sturgeon (Acipenser fulvescens) eggs by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B. 1040, 162-168 (2017).
  18. SAS. 1999. SAS. User's Guide (Version 8.01 Edition). , SAS Inst. Inc. Cary, NC, USA. (1999).
  19. Barton, B. A. Stress in fishes: a diversity of responses with particular reference to changes in circulating corticosteroids. Integrative and Comparative Biology. 42, 517-525 (2002).
  20. Ghassemi Nejad, J., et al. Measuring hair and blood cortisol in sheep and dairy cattle using RIA and ELISA assay: a comparison. Biological Rhythm Research. Accepted. , (2019).

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