Presentazione di un Gene Knockout direttamente nello stadio Amastigote di Trypanosoma cruzi Utilizzando il sistema CRISPR/Cas9

Sommario

Qui, descriviamo un protocollo per introdurre un knockout genico nell'amastigote extracellulare di Trypanosoma cruzi, usando il sistema CRISPR/Cas9. Il fenotipo della crescita può essere seguito sia dal conteggio cellulare della coltura degli amastigote axenico, sia dalla proliferazione degli amastigoti intracellulari dopo l'invasione delle cellule ospiti.

Abstract

Trypanosoma cruzi è un parassita protozoo patogeno che causa la malattia di Chagas principalmente in America Latina. Al fine di identificare un nuovo bersaglio farmacologico contro T. cruzi, è importante convalidare l'essenzialità del gene bersaglio nello stadio dei mammiferi del parassita, l'amastigote. Gli amastigoti di T. cruzi si replicano all'interno della cellula ospite; quindi, è difficile condurre un esperimento ad eliminazione diretta senza passare attraverso altre fasi di sviluppo. Recentemente, il nostro gruppo ha segnalato una condizione di crescita in cui l'amastigote può replicare axenically per un massimo di 10 giorni senza perdere le sue proprietà amastigote-like. Utilizzando questa coltura amastigote ascia temporale, abbiamo introdotto con successo i gRNA direttamente nell'amastigote che esprime Cas9 per causare eliminazioni genetiche e analizzato i loro fenotipi esclusivamente nella fase di amastigote. In questo rapporto, descriviamo un protocollo dettagliato per produrre amastigoti extracellulari derivati in vitro e per utilizzare la coltura ascia in un esperimento di knockout mediato da CRISPR/Cas9. Il fenotipo di crescita degli amastigoti knockout può essere valutato sia dai conteggi cellulari della coltura axenica, sia dalla replicazione dell'amastigote intracellulare dopo l'invasione delle cellule ospiti. Questo metodo bypassa la differenziazione dello stadio parassita normalmente coinvolto nella produzione di un amastigote transgenico o knockout. L'utilizzo della cultura amastigote ascia temporale ha il potenziale per espandere la libertà sperimentale di studi specifici dello stadio in T. cruzi.

Introduzione

Trypanosoma cruzi è l'agente causale della malattia di Chagas, prevalente principalmente in America Latina¹. T. cruzi ha fasi del ciclo di vita distintive mentre viaggia tra un vettore di insetti e un ospite di mammiferi². T. cruzi si replica come un epimastigote nel midgut di un insetto di triatomina succhiasangue e si differenzia in una trypomastigote metaciclica infettiva nel suo intestino posteriore prima di essere depositato su un ospite umano o animale. Una volta che il trypomastigote entra nel corpo ospite attraverso il sito del morso o attraverso una membrana mucosa, il parassita invade....

Protocollo

NOT: Una panoramica dell'intero flusso sperimentale è illustrata nella Figura 1.

Figura 1: Panoramica dell'esperimento a eliminazione diretta tramite EA. I trypomastigoti derivati dalla coltura dei tessuti vengono raccolti e differenziati in EA. gRNA viene trafitto in amastigoti che esprimono Cas9 per elettroporazione, e il fenotipo di crescita dell'amastigote knockout viene valutato mediante la replica axenica o mediante la r....

Risultati

Isolamento dei trypostigotes con la procedura di swim-out

Per raccogliere nuove prove da contaminanti vecchi EA con procedura di nuoto fuori, pellet cellulari devono essere incubati almeno per 1 h. Incubare i pellet per più di 2 h non aumenta significativamente il numero di trypostigotes nuotare nella soluzione ( Figura 2B). In questo particolare esperimento, la percentuale di trypomastigote nella miscela iniziale era del 38% e la percentuale dopo.......

Discussione

Abbiamo dimostrato che la cultura ascia di T. cruzi amastigotes può essere utilizzata nel knockout genico mediato da CRISPR/Cas9, elettropolando gRNA direttamente nell'EA che esprime Cas9. In questo modo, l'essenzialità del gene bersaglio specificamente nella fase amastigote può essere valutata senza passare attraverso altre fasi di sviluppo.

Un altro aspetto benefico della trasfezione dell'amastigote è la convenienza nel test di un gran numero di geni bersaglio. Una volta stabilita l.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzione di formalina al 20%	FUJIFILM Wako Pure Chemical	068-03863	celle di fissaggio
25 cm2 tappo a doppia tenuta pallone di coltura	AGC Techno Glass	3100-025
75 cm2 tappo a doppia tenuta pallone	di coltura AGC Techno Glass	3110-075
Microscopio a fluorescenza all-in-one	Keyence	BZ-X710
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (per il controllo)	IDT		sequenza target personalizzata = GGACGGCACCTTCATCTACAAGG
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (per TcCGM1)	IDT		sequenza target personalizzata = TAGCCGCGATGGAGAGTTTATGG
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (per TcPAR1)	IDT		sequenza target personalizzata = CGTGGAGAACGCCATTGCCACGG
Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA	IDT	1072532	per ricottura con crRNA
Amaxa Dispositivo nucleofector	LONZA	AAN-1001	elettroporazione
Basic Parasite Nucleofector Kit 2	LONZA	VMI-1021	elettroporazione
BSA	Sigma-Aldrich	A3294	componente del mezzo per l'amastigogenesi in vitro
Emocitometro monouso Burker-Turk	Watson	177-212C
Coster Piastre a pozzetti multipli trasparenti trattate con TC a 12 pozzetti	Corning	3513
DMEM	FUJIFILM Wako Pure Chemical	044-29765	terreno di coltura
Siero bovino fetale, definito	Hyclone	SH30070.03	inattivato a caldo prima dell'uso
Soluzione di solfato G-418	FUJIFILM Wako Pure Chemical	077-06433	selezione del trasformante
Cloruro di eme	Sigma-Aldrich	H-5533	componente del mezzo LIT
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570	colorazione dei nuclei
Brodo per infusione di fegato, Difco	Becton Dickinson	226920	componente del mezzo LIT
MES	FUJIFILM Wako Pure Chemical	349-01623	componente del mezzo per l'amastigogenesi in vitro
PBS (–)	FUJIFILM Wako Pure Chemical	166-23555
Ioduro di propidio	Sigma-Aldrich	P4864-10ML	colorazione di cellule morte
RPMI 1646	Sigma-Aldrich	R8758	terreno per metaciclogenesi