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Articolo metodologico

Misurazione specifica del ciclo cellulare di zH2AX e Apoptosis Dopo lo stress genotossico da citometria di flusso

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DOI:

10.3791/59968

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1 settembre 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1CCU Molecular and Radiation Oncology, German Cancer Research Center, 2Department of Radiation Oncology, Heidelberg University Hospital, 3Department of Radiation Oncology, Freiburg University Medical Center

In questo articolo

Sommario

Il metodo presentato combina l'analisi quantitativa delle interruzioni del DNA a doppio filamento (DSB), la distribuzione del ciclo cellulare e l'apoptosi per consentire la valutazione specifica del ciclo cellulare dell'induzione e della riparazione di DSB, nonché le conseguenze del fallimento della riparazione.

Abstract

Il metodo presentato o versioni leggermente modificate sono state ideate per studiare risposte specifiche al trattamento e gli effetti collaterali di vari trattamenti anti-cancro utilizzati nell'oncologia clinica. Consente un'analisi quantitativa e longitudinale della risposta al danno del DNA dopo lo stress genotossico, come indotto dalla radioterapia e da una moltitudine di farmaci anti-cancro. Il metodo copre tutte le fasi della risposta al danno del DNA, fornendo endpoint per l'induzione e la riparazione di rotture a doppio filamento del DNA (DSB), l'arresto del ciclo cellulare e la morte cellulare per apoptosi in caso di guasto di riparazione. La combinazione di queste misurazioni fornisce informazioni sugli effetti di trattamento dipendenti dal ciclo cellulare e consente quindi uno studio approfondito dell'interazione tra la proliferazione cellulare e i meccanismi di coping contro il danno al DNA. Poiché l'effetto di molte terapie contro il cancro, tra cui agenti chemioterapici e radiazioni ionizzanti, è limitato o varia fortemente in base a specifiche fasi del ciclo cellulare, le analisi correlate si basano su un metodo robusto e fattibile per valutare gli effetti del trattamento sul DNA in modo specifico per il ciclo cellulare. Questo non è possibile con i saggi a endpoint singolo e un importante vantaggio del metodo presentato. Il metodo non è limitato a nessuna linea cellulare particolare ed è stato accuratamente testato in una moltitudine di linee tumorali e normali delle cellule tissutali. Può essere ampiamente applicato come un test completo di genotossicità in molti campi dell'oncologia oltre alla radio-oncologia, tra cui la valutazione del fattore di rischio ambientale, lo screening farmacologico e la valutazione dell'instabilità genetica nelle cellule tumorali.

Introduzione

L'obiettivo dell'oncologia è quello di uccidere o inattivare le cellule tumorali senza danneggiare le cellule normali. Molte terapie o direttamente o indirettamente inducono stress genotossico nelle cellule tumorali, ma anche ad alcuni si estendono nelle cellule normali. La chemioterapia o i farmaci mirati sono spesso combinati con la radioterapia per migliorare la radiosensibilità del tumore irradiato1,2,3,4, 5, che consente una riduzione di la dose di radiazioni per ridurre al minimo i normali danni ai tessuti.

Le radiazioni ionizzanti e altri agenti genotossici inducono diversi tipi di danni al DNA, tra cui modifiche alla base, collegamenti di filamento e rotture a singolo o doppio filamento. Le rotture del doppio filamento del DNA (DSB) sono le lesioni più gravi del DNA e la loro induzione è fondamentale per l'effetto di uccisione delle cellule delle radiazioni ionizzanti e di vari farmaci citostatici nella radiochemioterapia. I DSB non solo danneggiano l'integrità del genoma, ma promuovono anche la formazione di mutazioni6,7. Pertanto, diversi percorsi di riparazione DSB, e meccanismi per eliminare le cellule irreparabilmente danneggiate come l'apoptosi si sono sviluppati durante l'evoluzione. L'intera risposta al danno del DNA (DDR) è regolata da una complessa rete di percorsi di segnalazione che raggiungono il riconoscimento dei danni del DNA e l'arresto del ciclo cellulare per consentire la riparazione del DNA, la morte cellulare programmata o l'inattivazione in caso di guasto di riparazione8.

Il metodo citometrico del flusso presentato è stato sviluppato per studiare la DDR dopo lo stress genotossico in un test completo che copre l'induzione e la riparazione di DSB, nonché le conseguenze del guasto alla riparazione. Combina la misurazione del marcatore DSB ampiamente applicato: HH2AX con l'analisi del ciclo cellulare e l'induzione dell'apoptosi, utilizzando l'analisi classica subG1 e una valutazione più specifica dell'attivazione della caspase-3.

La combinazione di questi endpoint in un'unica analisi non solo riduce le spese di tempo, manodopera e costi, ma consente anche la misurazione specifica del ciclo cellulare dell'induzione e della riparazione di DSB, nonché l'attivazione della caspase-3. Tali analisi non sarebbero possibili con i saggi condotti in modo indipendente, ma sono molto rilevanti per una comprensione completa della risposta al danno del DNA dopo lo stress genotossico. Molti farmaci anticancro, come i composti citostatici, sono diretti contro la divisione delle cellule e la loro efficienza è fortemente dipendente dallo stadio del ciclo cellulare. La disponibilità di diversi processi di riparazione DSB dipende anche dalla fase del ciclo cellulare e dalla scelta del percorso che è fondamentale per la precisione di riparazione, e a sua volta determina il destino della cella9,10,11, 12. Inoltre, la misurazione specifica del ciclo cellulare dei livelli di DSB è più accurata dell'analisi in pool, perché i livelli di DSB non dipendono solo dalla dose di un composto o radiazione genotosi, ma anche dal contenuto di DNA della cellula.

Il metodo è stato utilizzato per confrontare l'efficacia di diverse radioterapie per superare i meccanismi di resistenza nel glioblastoma13 e per analizzare l'interazione tra radiazioni ionizzanti e farmaci mirati nell'osteosarcoma14,15 e tumori teratoidi atipici16. Inoltre, il metodo descritto è stato ampiamente utilizzato per analizzare gli effetti collaterali della radio e della chemioterapia sulle cellule staminali mesenchymale17,18,19,20,21, 22,23,24, che sono essenziali per la riparazione del danno tissutale normale indotto dal trattamento e hanno una potenziale applicazione nella medicina rigenerativa.

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Protocollo

1. Preparazione

  1. Preparare 1 x 105 celle / campione in qualsiasi tipo di recipiente di coltura come materiale di partenza.
    1. Ad esempio, condurre un esperimento di percorso temporale dopo l'esposizione delle cellule glioblastoma U87 alle radiazioni ionizzanti: irradiare cellule U87 sub-confluenti in flaconi T25 in triplicati per ogni punto temporale. Scegliere i primi punti temporali (15 min fino a 8 h dopo l'irradiazione) per seguire la cinetica della riparazione di DSB (livello HH2AX) e i punti temporali tardivi (24 h fino a 96 h) per valutare i livelli residui di DSB, gli effetti del ciclo cellulare e l'apoptosi.
      NOT: Il protocollo non è limitato agli esperimenti di irradiazione o a qualsiasi linea cellulare specifica. È stato testato con numerose linee cellulari di tutti i tipi, di specie diverse e per varie condizioni di trattamento.
  2. Preparare le seguenti soluzioni, incluso il 10% di volume in eccesso.
    1. Preparare 2 mL per campione di soluzione di fissazione composta da 4,5% paraformaldeide (PFA) in salina con buffer fosfato (PBS). Preparare la soluzione fresco. Diluire la PFA in PBS riscaldando a 80 gradi centigradi con agitazione lenta sotto il cofano del fume. Coprire il pallone con un foglio di alluminio per evitare perdite di calore. Lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente e regolare il volume finale. Passare la soluzione attraverso un filtro di cellulosa piegato, grado 3hw (vedere la Tabella dei Materiali).
      ATTENZIONE: I fumi PFA sono tossici. Eseguire questo passaggio sotto un cofano di fumi e smaltire i rifiuti PFA in modo appropriato.
    2. Preparare 3 mL per campione di soluzione di permeabilizzazione composta da 70% etanolo in freddo ghiaccio H2O. Conservare a -20 gradi centigradi.
    3. Preparare 7 mL per campione di soluzione di lavaggio composta da 0,5% di albumina di siero bovino (BSA) in PBS.
    4. Preparare 100 L per campione del 3% di BSA in PBS come diluente anticorpo.
    5. Preparare 100-250 l per campione di soluzione di colorazione del DNA composta da 1 g/mL 4',6-diamidin-2-phenylindol (DAPI) in PBS.
  3. Impostare la centrifuga per tubi da 15 mL a 5 min a 200 x g e 7 gradi centigradi. Lasciare raffreddare la centrifuga e utilizzare queste impostazioni per tutte le fasi di centrifugazione.

2. Collezione di campioni

  1. Se la lavorazione di cellule aderenti (ad es. cellule glioblastoma U87 coltivate in flaconi T25 con 5 mL del mezzo modificato di Dulbecco, integrato con siero bovino fetale del 10% a 37 gradi centigradi e 5% di atmosfera di anidride carbonica), proseguire con i passi 2.1.1. e 2.1.2. Per le celle di sospensione procedere direttamente al passaggio 2.1.2.
    1. Raccogliere il mezzo in un tubo di centrifugazione. Staccare le cellule utilizzando un metodo di coltura cellulare di routine, che può includere l'uso di trypsin, acido etilenediaminetraaceacetica (EDTA) o altri agenti di distacco cellulare.
      1. Per le cellule U87, prewarm PBS e trypsin/EDTA (vedi la Tabella deiMateriali) a 37 , lavare lo strato cellulare con 1 mL di PBS, incubare le cellule per 1-2 min con 1 mL di trypsin/EDTA e sostenere il distacco delle celle toccando il pallone. Raccogliere tutte le soluzioni di lavaggio e la sospensione cellulare nel tubo con il mezzo.
    2. Centrifugare le cellule, scartare il mezzo e risospendere le cellule in 1 mL di PBS.
  2. Convogliale più volte su e giù per garantire una sospensione a singola cella e trasferisci la sospensione cellulare in un tubo con 2 mL di soluzione di fissaggio (4,5% PFA/PBS, 3% di concentrazione finale).
    ATTENZIONE: I fumi PFA sono tossici. Eseguire questo passaggio sotto un cofano di fumi e smaltire i rifiuti PFA in modo appropriato.
  3. Incubare le cellule per 10 min a temperatura ambiente.
  4. Centrificare le cellule e scartare il supernatale con la decantazione.
  5. Allenta il pellet cellulare toccando il tubo e risospende nuovamente le cellule in 3 mL del 70% di etanolo. Procedere direttamente con il passo successivo o conservare i campioni a 4 gradi centigradi per un massimo di diverse settimane.

3. Lavaggio e colorazione

  1. Centrificare le cellule e scartare il supernatale con la decantazione.
  2. Allentare il pellet cellulare toccando il tubo. Risospendere le cellule in 3 mL di soluzione di lavaggio (0,5% BSA/PBS), centrifugare e scartare il sovrinterrato.
  3. Ripetere il passaggio di lavaggio 1x con 3 mL, quindi 1x con soluzione di lavaggio da 1 mL. Nell'ultimo passaggio, scartare il supernatante con attenzione pipettando. Fare attenzione a non aspirare il pellet.
  4. Diluire gli anticorpi contro il diluente di anticorpi, il fosfo-histone H3 (Ser10) e la caspase-3 (si veda la Tabella deiMateriali) in 100
  5. Allentare il pellet cellulare toccando il tubo e risospendere le cellule a 100 gradi l della soluzione anticorpale preparata al punto 3.4. Tenere i campioni all'oscuro da questo passo in poi.
  6. Incubare i campioni per 1 h a temperatura ambiente.
  7. Centrifugare le cellule e scartare il supernatante con attenzione pipetting. Fare attenzione a non aspirare il pellet.
  8. Allentare il pellet cellulare toccando il tubo e risospendere le cellule in 100-250 - L di soluzione di colorazione del DNA (1 g/mL DAPI/PBS).
    1. Utilizzare 100 l se sono presenti 1-2 x105 celle e aumentare il volume per i numeri di cella più alti (250 -L per 1 x 106 celle). Procedere direttamente con il passo successivo o conservare i campioni al buio a 4 gradi centigradi per un massimo di 2 settimane.
      NOT: Per alcuni tipi di cellule ottimizzare la concentrazione DI DAPI può contribuire a migliorare la separazione delle fasi del ciclo cellulare.
  9. Pipet i campioni attraverso il tappo del colino cellulare di un tubo campione con una dimensione del poro di maglia di 35 m.

4. Misurazione

  1. Posizionare i campioni sul ghiaccio, avviare il citometro di flusso (vedere la tabella dei materiali) configurato con una configurazione ottica secondo la tabella 1 e premere il pulsante Prime. Se necessario, accendere il laser laser ultravioletto (lunghezza d'onda 355 nm) separatamente e impostare la potenza a 10 mW utilizzando il software appropriato.
  2. Aprire il software di acquisizione (vedere Tabella dei materiali), accedere e creare un nuovo esperimento facendo clic sul pulsante Nuovo esperimento sulla barra degli strumenti del browser.
  3. Utilizzare la finestra Impostazioni per personalizzare il nome dell'esperimento e scegliere "5 Log Decades" per la visualizzazione del grafico.
  4. Fare clic sul pulsante Nuovo campione nella barra degli strumenti del browser ed espandere la nuova voce facendo clic sul simbolo ' ' sul lato sinistro per visualizzare il primo tubo. Selezionare l'icona e il tipo per rinominare l'specimen (ad esempio, il tipo di cella) e il tubo (identificatore del campione). Fate clic sul puntatore del tubo del primo tubo (simbolo a forma di freccia alla sua sinistra) per renderlo verde (attivo).
  5. Aprire la scheda Parametri nella finestra Cytometer e scegliere i parametri in base alla Tabella 1. Eliminare tutti i parametri non necessari.
    NOTA: i nomi dei parametri possono variare a seconda dei predefiniti personalizzati (ad esempio, Cy3 invece di Alexa555). Assicurarsi che la selezione corrisponda ai filtri ottici e ai rilevatori riportati nella Tabella1. I percorsi luminosi di tutti i fluorofori sono completamente indipendenti in questa configurazione e non è richiesta la compensazione della sovrapposizione spettrale; tuttavia, potrebbe essere necessario se viene utilizzata un'altra configurazione ottica.
  6. Aprire la finestra Foglio di lavoro e creare i grafici in base alla figura 1. Disegnare 2 grafici a punti e 4 istogrammi utilizzando i pulsanti della barra degli strumenti corrispondenti e fare clic sulle etichette degli assi per scegliere i parametri appropriati (a dispersione anteriore (FSC-A) rispetto a dispersione laterale (SSC-A), DAPI-W rispetto a DAPI-A e un istogramma per DAPI-A e ogni anticorpo accoppiato fluoroforo.
  7. Collegare un campione di controllo al citometro e premere il pulsante Esegui sullo strumento. Selezionare il primo tubo nella finestra Browser del software e fare clic sul pulsante Acquisisci dati nel Dashboard di acquisizione. Regolare il volume di iniezione del campione utilizzando i pulsanti Basso, Medio o Alto e la ruota di messa a punto sullo strumento. Preferibilmente lavorare con l'impostazione Bassa, ma provare ad acquisire almeno 100 eventi al secondo (vedere Dashboard di acquisizione).
  8. Regolare le tensioni del rivelatore per FSC, SSC e DAPI nella scheda Parametri della finestra Di impostazioni utilizzando i grafici a punti nella Figura 1 come linea guida. Passare alla scala logaritmica per i parametri FSC e SSC se la popolazione cellulare appare troppo dispersa su scala lineare.
  9. Premere il pulsante Standby sul citometro e continuare con la configurazione del foglio di lavoro nel software.
    1. Utilizzare lo strumento Porta poligonale per definire la popolazione di celle nel grafico FSC-A rispetto a SSC-A e lo strumento Rectangle Gate per definire la popolazione SingleCells nel grafico DAPI-W rispetto a DAPI-A. Premere i tasti Ctrl e G per visualizzare la Gerarchia della Popolazione e fare clic sui nomi dei cancelli predefiniti per rinominarli.
    2. Successivamente fare clic con il pulsante destro del mouse su tutti gli istogrammi e scegliere Mostra popolazioni SingleCells dal menu di scelta rapida.
  10. Ottimizzare le tensioni del rivelatore per i fluorofori accoppiati agli anticorpi per coprire l'intera gamma dinamica acquisendo successivamente il controllo e i campioni trattati. Massimizzare il rapporto segnale-rumore ed evitare la saturazione del rilevatore. Assicurarsi che il picco di Alexa488 nella popolazione SingleCells non viene troncato nel controllo né il campione trattato.
  11. Premere il pulsante Standby sul citometro ed eseguire facoltativamente i passaggi 4.11.1-4.11.3 nella finestra Worksheet del software per ottenere una stima approssimativa degli effetti del trattamento durante l'acquisizione del campione.
    1. Selezionare SingleCells nella Gerarchia del popolamento e utilizzare lo strumento Rectangle Gate per definire la popolazione G1 nel grafico DAPI-W rispetto a DAPI-A. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'istogramma di Alexa488 e scegliere Mostra popolazioni. G1 dal menu contestuale.
    2. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'istogramma di Alexa488 e scegliere Crea visualizzazione statistiche dal menu di scelta rapida. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla Visualizzazione statistiche e scegliere Modifica visualizzazione statistiche. Vai alla scheda Statistiche e attiva la casella di controllo per la mediana del segnale Alexa488 nella popolazione G1 (disattiva tutte le altre opzioni).
    3. Selezionare SingleCells nella Gerarchia del Popolamento e utilizzare lo strumento Interval Gate per definire le popolazioni subG1, M e Casp3 nel DAPI-A, Alexa555-A (Cy3-A nella Figura 1) e Istogrammi Alexa647-A.
  12. Premere il pulsante Esegui sul citometro e misurare i campioni utilizzando il Dashboard di acquisizione nel software. Impostare il cancello di arresto su Tutti gli eventi o sul cancello Celle (se sono presenti numerose piccole particelle) e sul numero di eventi da registrare a 10.000.
  13. Fare clic su Next Tube per creare un nuovo campione, rinominarlo nella finestra Browser, fare clic su Acquisisci dati per avviare l'acquisizione e Registrare i dati per avviare la registrazione.
  14. Selezionare il file Proprietà Export . Esperimenti dalla barra dei menu e scegliere Esportazione directory nella finestra di dialogo per salvare i dati come file '.fcs'. Facoltativamente, salvare l'esperimento come file zip aggiuntivo se abilitare la reimportingo in un secondo momento.
    NOT: L'impostazione degli esperimenti esistenti può essere facilmente riutilizzata con Modifica Duplica senza dati.

5. Valutazione dei dati

  1. Trascinare i file '.fcs' nel browser di esempio del software di analisi citometrica del flusso (vedere Tabella dei materiali). Applicare la strategia di gating illustrata nella Figura 2. Assicurarsi che i cancelli si adattino alla popolazione corrispondente in tutti i campioni prima di procedere con il cancello della figlia successiva.
    1. Per applicare le modifiche a tutti i campioni, selezionare il gate modificato nel browser di esempio, copiarlo premendo Ctrl , C, selezionare il gate padre, premere Ctrl s Maiusc e E per selezionare i nodi equivalenti in tutti i campioni e premere Ctrl il cancello. Non utilizzare cancelli di gruppo.
    2. Fare doppio clic sul primo campione nel browser per aprire il grafico SSC-A vs FSC-A. Utilizzare lo strumento Poligono nella barra degli strumenti per definire la popolazione di celle (Figura 2, stampa 1), escludendo i detriti dall'analisi. Assicurarsi che il cancello sia sufficientemente largo verso l'angolo superiore destro per accogliere i cambiamenti relativi al trattamento, ma limitare il bordo rivolto verso l'angolo inferiore sinistro del grafico per escludere in modo affidabile la cella.
    3. Fare doppio clic sul cancello Celle per aprire una nuova finestra di stampa e modificare gli assi in DAPI-W (verticale) rispetto a DAPI-A (orizzontale) facendo clic sulle etichette degli assi. Utilizzare lo strumento Rettangolo per definire la popolazione SingleCells (Figura 2, stampa 2), esclusi i doppietti cellulari o i grumi dall'analisi (i doppietti delle celle G1 hanno la stessa intensità DAPI-A delle celle G2 e M, ma un DAPI-W notevolmente superiore valore).
      NOT: Variare il numero di cellule in campioni diversi causerà cambiamenti nella potenza complessiva del segnale DAPI-A a causa del legame di equilibrio di DAPI al DNA. Ciò non influirà sull'analisi del ciclo cellulare, ma potrebbe essere necessario regolare il bordo destro del campione della porta a cella singola per campione per tenere conto di questi turni.
    4. Fare doppio clic sul cancello SingleCells per aprire una nuova finestra di stampa e modificare gli assi per visualizzare l'istogramma DAPI-A. Utilizzare lo strumento Bisector per distinguere singole cellule con contenuto di DNA normale (popolazioneCellCycle) da cellule apoptotiche con DNA degradato ( popolazionesubG1). Successivamente selezionare i nuovi gate nel browser e premere Ctrl e R per rinominarli di conseguenza ( Figura2, stampa 3).
    5. Selezionare il cancello CellCycle nel browser e scegliere Strumento La biologia Ciclo cellulare... dalla barra dei menu per aprire lo strumento di modellazione del ciclo cellulare. Scegliere Dean-Jett-Fox25,26 nella sezione Modello per stimare la frequenza delle celle nella fase G1, S e G2/M (Figura2, stampa 4). Utilizzare i vincoli solo in caso di scarse prestazioni di modellazione (ridurre al minimo la deviazione square della media radice tra il modello e i dati).
    6. Creare cancelli per G1 (strumentoEllisse), S (strumentoPoligono) e G2 ( strumentoEllisse) nella fase DAPI-W rispetto a DAPI-A della popolazione CellCycle per abilitare la misurazione specifica del ciclo cellulare - Figura 2, traccia 5). Non utilizzare lo strumento di modellazione per l'gating automatico del ciclo cellulare basato sull'istogramma DAPI-A, in quanto ciò può essere impreciso.
      NOT: Potrebbe essere necessario spostare i cancelli lungo il campione dell'asse DAPI-A per campione per tenere conto dei suddetti cambiamenti nella potenza complessiva del segnale DAPI. Spostare solo i tre cancelli in gruppo e non modificare la forma delle singole porte per evitare pregiudizi.
    7. Utilizzare lo strumento Bisettore per distinguere le celle fosfo-istone H3 positivo (M ) e -negativo (M-) nell'istogramma Alexa555-A della popolazione di CellCycle (Figura 2, grafico 6). Tenere premuto Ctrl e selezionare i cancelli G2 e M e M-. Premete Ctrl (Windows) o Maiusc (Mac OS) per creare il cancello G2 (G2-M e M-).
    8. Utilizzare lo strumento Bisettore per distinguere le celle caspase-3-positive (Casp3) e -negative (Casp3-) nell'istogramma Alexa647-A della popolazione SingleCells (Figura 2, traccia7). Impostare la soglia in modo che la media della popolazione Casp3 o nei controlli non trattati sia pari allo 0,8% per assicurare un'elevata sensibilità e ridurre al minimo le variazioni di analisi-analisi.
    9. Premete Ctrl e T per aprire l'Editor tabelle e configurarlo in base alla Figura 3. Trascinare e rilasciare le diverse popolazioni dal browser di esempio nell'Editor tabelle e fare doppio clic sulle righe per modificare le impostazioni statistiche, parametri e nomi. Rimuovere le righe non necessarie che vengono aggiunte automaticamente dopo il trascinamento dell'icona di modellazione del ciclo di celle selezionando le righe e premendo CanC.
    10. Scegliere File, il formato e la destinazione nella sezione Output della barra multifunzione del menu e fare clic su Crea tabella per esportare i dati come file 'xlsx'.
  2. Utilizzare il software di calcolo delle tabelle (vedere Tabella dei materiali) per un'ulteriore analisi dei dati in base al file supplementare 1 (FACS_Analysis_Template_(1).xlsx).
    1. Correggere le frequenze delle cellule nelle diverse fasi del ciclo cellulare in modo che la loro somma sia pari al 100% applicando la formula X' X , X , 100 / (tutte le fasi del ciclo cellulare), con X': valore corretto, X: valore non elaborato, a ogni fase del ciclo cellulare.
    2. Normalizzare le intensità medianeH2AX al contenuto di DNA nelle diverse fasi del ciclo cellulare dividendo i valori nella fase S per 1,5 e in fase G2 e M per 2,0.
    3. Per calcolare il livello combinato normalizzato di H2AX nell'intera popolazione cellulare, utilizzare la formula IA , IG1 , G1 , I, S , I, G2 , IM , dove IA, IG1, I,IG2, IM sono normalizzate intensità medianeH2AX di tutti, G1, S, G2, M rispettivamente e G1, S, G2, M sono corrette frequenza delle cellule nella rispettiva fase del ciclo cellulare.
    4. Per i livelli normalizzati di zH2AX e la frequenza delle cellule subG1 e caspase-3-positive, sottrarre il valore medio dei controlli non trattati da ciascun campione.
    5. Calcolare la media e la deviazione standard di ogni parametro da tutti i campioni di replica e tracciare i risultati in diagrammi.

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Risultati

Le cellule glioblastoma umane U87 o LN229 sono state irradiate con 4 Gy di radiazione fotonica o ionica di carbonio. I livelli e l'apoptosi specifici del ciclo cellulare sono stati misurati in diversi momenti fino a 48 h dopo l'irradiazione utilizzando il metodo citometrico del flusso , qui presentato (Figura 3). In entrambe le linee cellulari, gli ioni di carbonio indottero livelli di picco più alti di H2AX che diminuirono più lentamente e rimasero significativamente elevati a 24 a 48 h ris...

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Discussione

Il metodo in primo piano è facile da usare e offre una misurazione veloce, accurata e riproducibile della risposta al danno del DNA, tra cui l'induzione e la riparazione a doppio filamento (DSB), effetti del ciclo cellulare e morte delle cellule apoptotiche. La combinazione di questi endpoint fornisce un quadro più completo delle loro interrelazioni rispetto ai singoli saggi. Il metodo può essere ampiamente applicato come un test completo sulla genotossicità nei campi della biologia delle radiazioni, della terapia e dell...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo il team di Flow Cytometry Facility presso il German Cancer Research Center (DKF) per il loro supporto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1.000 µ L punte filtrantiNerbe plus07-693-8300
100-1.000 µ L pipettaEppendorf3123000063
provette da 12 mm x 75 mm con tappo filtrante per cellule, 35 &; micro; m dimensione dei pori a magliaBD Falcon352235
provette da 15 mLBD Falcon352096
200 µ L punte filtrantiNerbe plus07-662-8300
20-200 &; L pipettaEppendorf3123000055
4',6-Diamidin-2-fenilindol (DAPI)Sigma-AldrichD9542Sciogliere in acqua a 200 &; micro; g/mL e conservare le aliquote a -20 ° C
Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Anticorpo, RRID: AB_2248011BioLegend613406Diluire 1:20
Alexa Fluor 647 Anticorpo anti-caspasi-3 di coniglio, AB_1727414BD Pharmingen560626Diluire 1:20
BD FACSCleansolutionBD Biosciences340345Per la routine di pulizia del citometro dopo la misurazione
BD FACSRinse solutionBD Biosciences340346Per la routine di pulizia del citometro dopo la misurazione
Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)BiochromL 182Sciogliere in acqua fino a una concentrazione 1x
Dulbecco's Modified Eagle's Medium con glutammina stabileBiochromFG 0415Materiale di coltura cellulare di routine per la linea cellulare di esempio utilizzata nel protocollo
Etanolo assolutoVWR20821.330
Software ExcelMicrosoft
FBS Superior (siero fetale bovino)BiochromS 0615Materiale di coltura cellulare di routine per la linea cellulare di esempio utilizzata nel protocollo
FlowJo v10 softwareLLCordine
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01Terreno di inclusione per la preparazione opzionale di vetrini microscopici da campioni colorati
Filtri in cellulosa piegata, grado 3hwNeoLab11416
LSRII o LSRCitometro a baseacqua BD Biosciences
MG132Calbiochem474787farmaco opzionale per il controllo positivo dell'apoptosi
Multifuge 3SR+Heraeus
ParaformaldeideAppliChemA3813Preparare una soluzione fresca al 4,5%. Diluire in PBS riscaldando a 80 ° C con agitazione lenta sotto la cappa aspirante. Coprire il pallone con un foglio di alluminio per evitare la perdita di calore. Lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente e regolare il volume finale. Passare la soluzione attraverso un filtro di cellulosa.
Fosfo-istone H3 (Ser10) (D2C8) XP Coniglio mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639Cell Signaling Technology#3475Diluire 3:200
PIPETBOY acu 2Integra Biosciences155 016
Pipette sierologiche, 10 mLCorning4488
Pipette sierologiche, 25 mLCorning4489
Pipette sierologiche, 5 mLCorning4487
SuperKillerTRAIL (ligando modificato-induttore dell'apoptosi correlato al TNF)BiomolAG-40T-0002-C020farmaco opzionale per il controllo positivo dell'apoptosi
Fiasche per colture cellulari T25Greiner bio-one690160Materiale di coltura cellulare di routine per la linea cellulare di esempio utilizzata nel protocollo
Tripsina/EDTAPAN BiotechP10-025500Materiale di coltura cellulare di routine per la linea cellulare di esempio utilizzata nel protocollo
Cellule di glioblastoma U87 MGATCCATCC-HTB-14Linea cellulare di esempio utilizzata nel protocollo
online di

Riferimenti

  1. Jensen, A., et al. Treatment of non-small cell lung cancer with intensity-modulated radiation therapy in combination with cetuximab: the NEAR protocol (NCT00115518). BMC Cancer. 6, 122(2006).
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