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Articolo metodologico

Modifica del genoma mediato da Lentiviral/Cas9 per lo studio delle cellule ematopoietiche nei modelli di malattia

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DOI:

10.3791/59977

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3 ottobre 2019

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1Hematovascular Biology Center, Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia School of Medicine

In questo articolo

Sommario

Descritto sono protocolli per l'editing genomico altamente efficiente di cellule staminali e progenitrici (HSPC) murine (HSPC) dal sistema CRISPR/Cas9 per sviluppare rapidamente sistemi di modelli murini con modifiche genetiche specifiche del sistema ematopoietico.

Abstract

La manipolazione dei geni nelle cellule staminali ematopoietiche utilizzando approcci convenzionali di transgenesi può essere dispendiosa in termini di tempo, costi e impegnativi. Approfittando dei progressi nella tecnologia di editing del genoma e nei sistemi di erogazione transgenici mediati da lentivirus, è descritto un metodo efficiente ed economico che stabilisce topi in cui i geni vengono manipolati specificamente nelle cellule staminali ematopoietiche. I lentivirus vengono utilizzati per trasdurre le cellule del midollo osseo con un'RNA guida (gRNA) mirato a geni specifici e a un gene di segnalazione della fluorescenza rossa (RFP), quindi queste cellule vengono trapiantate in topi C57BL/6 irradiati letale. I topi trapiantati con lentivirus che esprimono gRNA non mirati vengono utilizzati come controlli. L'innesto di cellule staminali ematopoietiche trasdotte viene valutato mediante analisi citometrica del flusso di leucociti RFP positivi al sangue periferico. Utilizzando questo metodo, è possibile ottenere la trasduzione di cellule mieloidi e il 70% delle cellule linfoidi a 4 settimane dopo il trapianto. Il DNA genomico è isolato dalle cellule del sangue RFP-positive e parti del DNA del sito mirato sono amplificate dalla PCR per convalidare l'editing del genoma. Questo protocollo fornisce una valutazione ad alto throughput dei geni regolatori dell'ematopoiesi e può essere esteso a una varietà di modelli di malattia dei topi con coinvolgimento delle cellule ematopoietiche.

Introduzione

Molti studi in ematologia e immunologia si basano sulla disponibilità di topi geneticamente modificati, tra cui topi transgenici/knock-out convenzionali e condizionali che utilizzano driver Cre specifici del sistema ematopoietico come Mx1-Cre, Vav-Cre e altri 1,2,3,4,5. Queste strategie richiedono la creazione di nuovi ceppi di topi, che possono richiedere molto tempo e gravare finanziariamente. Mentre i progressi rivoluzionari nella tecnologia di editing del genoma hanno permesso la generazione di nuovi ceppi di topi in appena 3-4 mesi con l'adeguata competenza tecnica6,7,8,9 , è necessario molto più tempo per amplificare la colonia di topi prima di condurre esperimenti. Inoltre, queste procedure sono costose. Ad esempio, Jackson Laboratory elenca il prezzo attuale dei servizi di generazione di topi knock-out a 16.845 dollari per ceppo (a partire da dicembre 2018). Pertanto, i metodi più economici ed efficienti rispetto agli approcci transgenici murini convenzionali sono più vantaggiosi.

La tecnologia CRISPR/Cas9, regolarmente interspaziata, ripete a breve ad occhiindromici/proteina CRISPR associata a ROF (CRISPR/Cas9) ha portato allo sviluppo di nuovi strumenti per un rapido ed efficiente editing del genoma basato su RNA e sequenza. Originariamente scoperto come meccanismo immunitario adattativo batterico per distruggere il DNA patogeno invasore, il sistema CRISPR/Cas9 è stato utilizzato come strumento per aumentare l'efficacia dell'editing del genoma nelle cellule eucariotiche e nei modelli animali. Sono stati adottati diversi approcci per trasmettere macchinari CRISPR/Cas9 in cellule staminali ematopoietiche (ad esempio, elettroporazione, nucleofezione, lipofezione, esodo virale e altri).

Qui, un sistema di lentivirus viene impiegato per traducire le cellule grazie alla sua capacità di infettare efficacemente le cellule staminali murine ematopoietiche di Cas9 e di confezionare insieme il costrutto guida per l'espressione dell'RNA, i promotori, le sequenze regolatorie e i geni che codificano proteine reporter fluorescenti (ad esempio, GFP, RFP). Utilizzando questo metodo, è stata ottenuta l'editing genico ex vivo delle cellule staminali ematopoietiche del topo, seguita da una ricostituzione di successo del midollo osseo in topi letali irradiati10. Il vettore lentivirus impiegato per questo studio esprime i geni dei reporter Cas9 e GFP del comune promotore di EF1a con un sito di ingresso ribosomico interno a monte del gene del reporter. La sequenza di RNA guida è espressa da un promotore U6 separato. Questo sistema viene quindi utilizzato per creare mutazioni di inserimento e delezione nei geni del driver di ematopoiesi clonale candidati Tet2 e Dnmt3a10. Tuttavia, l'efficienza della trasduzione con questo metodo è relativamente bassa (-5%-10%) a causa delle grandi dimensioni dell'inserto vettoriale (13 Kbp) che limita l'efficienza della trasduzione e riduce il titro del virus durante la produzione.

In altri studi, è stato dimostrato che la dimensione più grande dell'RNA virale influisce negativamente sia sulla produzione di virus che sull'efficienza della trasduzione. Ad esempio, un aumento di 1 kb nella dimensione dell'inserto è segnalato per ridurre la produzione di virus del 50%, e l'efficienza della trasduzione diminuirà a più del 50% nelle cellule staminali ematopoietiche del topo11. Pertanto, è vantaggioso ridurre il più possibile le dimensioni dell'inserto virale per migliorare l'efficienza del sistema.

Questa lacuna può essere superata impiegando topi transgenici Cas9, in cui la proteina Cas9 è espressa in modo flessibile o inducibile12. I topi knock-in CRISPR/Cas9 di tipo constitutivo escludano Cas9 endonuclease ed EGFP dal promotore CAG presso il locus Rosa26 in modo onnipresente. Così, un costrutto con sgRNA sotto il controllo del promotore U6 e del gene reporter RFP sotto il controllo del promotore core EF1a può essere consegnato utilizzando il vettore lentivirus per ottenere l'editing del genoma. Con questo sistema, i geni delle cellule staminali ematopoietiche sono stati modificati con successo, mostrando un'efficienza di trasduzione del 90%. Pertanto, questo protocollo fornisce un metodo rapido ed efficace per creare topi in cui nel sistema ematopoietico mirate vengono introdotte mutazioni genetiche mirate. Mentre il nostro laboratorio utilizza prevalentemente questo tipo di tecnologia per studiare il ruolo dell'ematopoiesi clonale nei processi di malattia cardiovascolare13,14,15, è applicabile anche agli studi di ematologica malignità16. Inoltre, questo protocollo può essere esteso all'analisi di come le mutazioni del DNA nell'HSPC influiscono su altri processi di malattia o di sviluppo nel sistema ematopoietico.

Per stabilire un robusto sistema vettoriale di lentivirus, sono necessari elevati titoli virali di titro e condizioni ottimizzate per la trasduzione e il trapianto di cellule ematopoietiche. Nel protocollo vengono fornite istruzioni sulla preparazione di uno stock virale ad alto titolo titer nella sezione 1, ottimizzando le condizioni di coltura delle cellule staminali ematopoietiche murine nel paragrafo 2, i metodi per il trapianto di midollo osseo nella sezione 3 e la valutazione l'innesto nella sezione 4.

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Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università della Virginia.

1. Generazione e purificazione delle particelle di lentivirus

NOTA: Le particelle di Lentivirus contenenti la guida ottimizzata RNA possono essere prodotte dai protocolli dettagliati forniti da Addgene: . I metodi ottimizzati per la preparazione e lo stoccaggio del lentivirus ad alto titro sono discussi altrove17,18. In breve, i lentivirus sono prodotti dalla co-trasfezione di un plasmide vettoriale di lentivirus, psPAX2 e pMD2.G nelle cellule HEK 293T. Il supernatante culturale viene raccolto a 48 h dopo la trasfezione e concentrato dall'ultracentrifugazione. Il titro lentivirale è determinato da un saggio basato su qPCR disponibile in commercio. Questa procedura deve essere eseguita in un mobile di classe biosafety II.

  1. Preparare una soluzione 1:200 di collagene (0,0005%) in 1x PBS.
  2. Rivestire un piatto 6 con soluzione di collagene e incubare a 37 gradi centigradi, 5% CO2 per 30 min.
  3. Seme 293T cellule ad una densità di 1 x 106 cellule per pozzo e incubare a 37 C, 5% CO2 per 2 h.
  4. Per preparare la miscela di tre plasmidi di trasfezione per un pozzo, unire 0,9 g di vettore di lentivirus, 0,6 g di psPAX2 e 0,3 g di pMD2.G, quindi raggiungere un volume totale di 10 gradi aggiungendo acqua deionizzata. Regolare gli importi di conseguenza a seconda del numero di pozzi. La quantità e il rapporto di ogni plasmide potrebbe essere necessario ulteriormente ottimizzato per soddisfare le esigenze dei ricercatori.
  5. Aggiungere con attenzione 50 gradi l di 1x PBS e 5 -L del PEI MAX diluito (1,0 mg/mL) alla miscela di plasmide e incubare per 15 min a temperatura ambiente (RT) (Tabella 1).
  6. Aggiungere 1 mL di DMEM alla miscela.
  7. Aspirare i supporti della piastra 6, aggiungere 1 mL di miscela di plasmide, e incubare a 37 c, 5% CO2 per 3 h.
  8. Sostituire i supporti con 2 mL di DMEM fresco e incubare a 37 , 5% CO2 per 24 h.
  9. Aggiungere 1 mL di DMEM fresco e incubare a 37 c, 5% CO2 per un ulteriore 24 h (il tempo totale di incubazione è 48 h).
  10. Trasferire il supernatante di coltura in un tubo da 50 mL e centrifugare a 3.000 x g per 15 min per rimuovere eventuali cellule galleggianti libere.
  11. Filtrare il supernatante con un filtro da 0,45 m.
  12. Trasferire il filtrato in tubi di centrifuga di polipropilene.
  13. Ultracentrifuga a 4 gradi centigradi e 72.100 x g almassimo r per 3 h.
  14. Aspirare con cura il supernatante, lasciando dietro di sé il pellet bianco.
  15. Risospendere il pellet con 100 l di mezzo di espansione delle cellule ematopoietiche senza sèiliasenza di aerazione.
  16. Mantenere un'aliquota di 10 l- per misurare il titro virale e conservare tutti gli aliquote rimanenti a -80 gradi fino a quando richiesto.
  17. Dititta il virus con un saggio basato su qPCR secondo le istruzioni del produttore usando l'aliquota virale da 10 l.

2. Isolamento e trasduzione delle cellule lignaggio-negativo dal midollo osseo del topo (Figura 1A)

NOTA: In genere, per isolare un numero sufficiente di cellule, coppie di tibi, femore e humeri vengono raccolti da ogni mouse. Le ossa pelviche e spinali possono anche essere raccolte come fonte di cellule lignaggio-negative.

  1. Isolamento delle cellule del midollo osseo
    1. Eutanasia 8-10 settimana maschio CRISPR / Cas9 knock-in topi da 5% isoflurane seguiti da lussazione cervicale, quindi disinfettare la loro pelle con 70% etanolo.
    2. Utilizzando forbici dissettive, fare un'incisione trasversale nella pelle appena sotto la gabbia toracica e sbucciare la pelle distay in entrambe le direzioni per esporre le gambe e le braccia.
    3. Separare con cura gli arti inferiori dall'osso dell'anca dislocando l'articolazione dell'anca. Tagliare lungo la testa del femore per rimuovere completamente il femore dall'anca. Slocare il ginocchio e tagliare l'articolazione per separare il femore e la tibia, mantenendo intatta l'epifisi ossea. Dislocare l'articolazione della caviglia e staccare il piede e il muscolo in più.
    4. Utilizzando forbici dissecipanti, tagliare sopra la spalla per staccare gli arti superiori. Slocare la spalla, quindi tagliare l'articolazione del gomito per raccogliere l'osso omero.
    5. Utilizzare salviette di cellulosa-fibra per rimuovere con attenzione i muscoli dai femore, tibie, e humeri. Prendere ulteriori precauzioni per assicurarsi che le ossa non si rompano durante questo processo.
    6. Collocare le ossa isolate in un tubo conico da 50 mL contenente RPMI e metterle sul ghiaccio.
      NOTA: i seguenti passaggi devono essere effettuati in un mobile di classe biosafety II.
    7. Trasferire le ossa in un piatto sterile di 100 mm.
    8. Afferra l'osso con pinze smussate e usando forbici dissetanti, taglia con cura entrambe le epifisi.
      NOTA: Un taglio insufficiente porterà ad un colore incompleto del midollo osseo, mentre il taglio eccessivamente aggressivo comporterà la perdita di cellule.
    9. Riempire una siringa da 10 mL con RPMI ghiacciata e, utilizzando un ago da 22 G, lavare il midollo osseo dall'albero in un nuovo piatto di coltura da 100 mm.
      NOTA: Le ossa diventeranno bianche e traslucide se l'albero osseo è stato ben lavato. In caso contrario, ri-tagliare le estremità dell'osso e lavare di nuovo.
    10. Dopo che tutto il midollo osseo è stato raccolto, effettuare una sospensione a singola cella passando il midollo osseo più volte attraverso una siringa da 10 mL con un ago da 18 G. Ripetere 10 volte per garantire una sospensione a cella singola.
    11. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino cellulare da 70 m in un tubo conico da 50 mL.
    12. Centrifuga a 310 x g per 10 min a 4 gradi centigradi.
    13. Aspirare il supernatante e risospendere i pellet cellulari in un volume appropriato di buffer di separazione ottimizzato per il seguente processo di separazione cellulare.
  2. Isolamento e trasduzione di lentivirus delle cellule lignaggio-negative
    NOTA: Le cellule lignaggio-negative del topo sono isolate dal midollo osseo dei topi transgeniciCas9 3o da altri ceppi di topi, utilizzando un kit di deplezione del lignaggio secondo le istruzioni del produttore. Tipicamente, le cellule lignaggio-negativo rappresentano il 2%-5% delle cellule nucleate del midollo osseo intero, e la purezza è di solito maggiore del 90% dopo l'isolamento. Le cellule lignaggio-negativi isolate sono coltivate in misura di espansione delle cellule ematopoietiche senza siero, integrata con 20 ng/mL ricombinante murine TPO e 50 ng/mL ricombinante murine SCF, poi tradusse con il vettore lentivirus per 16 h ad una molteplicità di infezione (MOI) - 100.
    1. Per isolare le cellule lignaggio-negative, utilizzare il kit di esaurimento delle cellule di lignaggio secondo le istruzioni del produttore.
    2. Dopo l'isolamento rimettere in sospensione le cellule lignaggio-negativo in 1 mL di mezzo di espansione delle cellule ematopoietiche senza siero.
    3. Semina le cellule in una piastra di 6 pozze a una densità di 1,5 x 106 cellule / mL (5 x 105 cellule negative di lignaggio / mouse.)
    4. Aggiungere murine TPO e SCF ricombinanti in pozzi a concentrazioni finali di 20 ng/mL e 50 ng/mL, rispettivamente.
    5. Cellule pre-incubate a 37 gradi centigradi nel 5% di CO2 per 2 h.
    6. Aggiungete la lentivirus a MOI: 100, 4 g/mL di polibrene e penicillina/streptomicina ai pozze e incubate a 37 gradi centigradi, 5% di CO2 per 16-20 h (Figura 1B).
    7. Il giorno seguente, raccogliere le cellule trandotte dal lentivirus in un tubo conico da 15 mL e centrifugare a 300 g per 10 min.
    8. Aspirare con attenzione il supernatante e risospendere il pellet in 200 -L di RPMI per mouse. Mantenere le cellule a RT fino al trapianto nei topi (sezione 3).

3. Trapianto di cellule trasdotte in topi immalari

  1. Il giorno del trapianto di midollo osseo, mettere i topi riceventi in una gabbia a torta a otto fette ed esporli a due dosi di irradiazione dell'intero corpo (550 Rad/dose, dose totale 1100 Rad), con circa 4 h tra ogni sessione di irradiazione.
  2. Dopo la seconda sessione di irradiazione, iniettare cellule transdotte dal lignaggio negativo a ciascun topo ricevente acuitotizzato tramite il plesso della vena retroorbitale (200 - L in totale) utilizzando una siringa di insulina (Figura 1C).
  3. Dopo l'irradiazione, i topi devono essere alloggiati in gabbie sterilizzate e dotati di una dieta morbida e acqua potabile integrata con antibiotici per 14 d.
  4. A 3-4 settimane dopo il trapianto di midollo osseo, analizzare il sangue periferico per verificare l'innesto di cellule donatrici trasdotte (sezione 4).

4. Valutare il chimerismo del sangue periferico

  1. Anestesizza i topi con il 5% di isoflurane e ottieni un campione di sangue da una vena retroorbitale usando tubi capillari e raccoglilo in tubi EdTA K2(il volume in un tubo capillare è sufficiente per il seguente assay).
  2. Trasferire 20 litri di sangue dai tubi K2EDTA nelle provette in polistirolo rotondo da 5 mL e mettere sul ghiaccio.
  3. Aggiungere 1,5 mL di tampone di lisi RBC per lise i globuli rossi. Incubare per 5 min sul ghiaccio.
  4. Per neutralizzare il buffer di lisi, lavare i campioni con buffer FACS (1,5 mL/campione).
  5. Centrifuga a 609 x g a rmax per 5 min a 4 gradi centigradi. Scartare il super-attardato.
  6. Incubare le cellule con un cocktail di anticorpi monoclonali (diluiti in 100 tamponati/campioni FACS) a RT per 20 min al buio. Un elenco completo degli anticorpi è disponibile nella sezione Materiali sopra riportata.
  7. Lavare le cellule una volta con buffer FACS (2 mL/campione). Centrifuga a 609 x g almassimo r (1.800 giri/ massimi) per 5 min a 4 gradi centigradi. Scarta reati il super-natante.
  8. Fissare le cellule con paraformaldeide contenente tampone di fissaggio (100 l/tubo) per 10 min a 4 gradi centigradi.
  9. Lavare le cellule una volta con il buffer FACS (3 mL/campione). Centrifuga a 609 x g almassimo r (1.800 giri/ massimi) per 5 min a 4 gradi centigradi. Scarta reati il super-natante.
  10. Sospendere il pellet in 400 l di buffer FACS.
  11. Conservare i campioni a 4 gradi centigradi fino all'analisi per citometria di flusso.

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Risultati

Utilizzando il protocollo sopra descritto, sono stati ottenuti circa 0,8-1,0 x 108 cellule del midollo osseo per topo. Il numero di cellule lignaggio-negativo che otteniamo è di circa 3 x 106 celle per mouse. Tipicamente, la resa delle cellule del lingaggio-negativo del midollo osseo è del 4%-5% di quella delle cellule nucleari totali del midollo osseo.

Il chimerismo delle cellule trasdotte (RFP-positivo) è...

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Discussione

Il vantaggio di questo protocollo è la creazione di modelli animali che ospitano mutazioni specifiche nelle cellule ematopoietiche in modo rapido e altamente economico rispetto agli approcci transgenici murini convenzionali. Si è scoperto che questa metodologia consente la generazione di topi con manipolazioni geniche delle cellule ematopoietiche entro 1 mese. Ci sono diversi passaggi critici in questo protocollo che richiedono ulteriore considerazione.

Screening della sequenza di gRNA...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

S. S. è stato sostenuto da una borsa di studio post-dottorato dell'American Heart Association 17POST33670076. K. W. era supportato dalle sovvenzioni NIH R01 HL138014, R01 HL141256 e R01 HL139819.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
RPMI Medium 1640 (1X)Gibco11875-093
Medium Sulfamethoxazole e Trimetoprim iniezioneTEVA0703-9526-01
1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGEEXELINT26028fornitura generale
293T celluleATCCCRL-3216--Linea cellulare
APC-anti-topo Ly6C (Clone AL-21)BD Biosciences560599anticorpi
APC-Cy7-anti-mouse CD45R (RA3-6B2)BD Biosciences552094Anticorpi
Siringhe monouso BD Luer-Lok, 10 mldi309604provette per
la raccolta del sangue BD Microtainer, K2EDTA aggiuntoBD Bioscience365974l'ago
BD Precisionglide, 18 GBD305195
ago BD Precisionglide, 22 G BD305155fornitura generale
BV510-anti-topo CD8a (clone 53-6.7)Biolegend100752Anticorpi
BV711-anti-topo CD3e (clone 145-2C11)Biolegend100349Anticorpi
Collagene da pelle di vitelloSigma-Aldrich9007-34-5fornitura generale
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 pozzetti Millipore SigmaCLS3471fornitura generale
CRISPR/Cas9 topi knock-inThe Jackson Laboratory028555mouse
DietGel 76AClear H2O70-01-5022fornitura generale
Dulbecco' s Aquila modificata' s Medium (DMEM) - alto glucosioSigma AldrichD6429Medium
eBioscience 1X RBC Lisi BufferThermo fisher Scientific00-4333-57Soluzione
Falcon 100 mm Piatto per colture cellulari trattato con TC Scienzevita353003fornitura generale
Falcon 5 mL provetta in polistirene a fondo tondo LifeSciences352054alimentazione generale
Falcon 50 mL conico Provette per centrifugaFisher Scientific352098fornitura generale
Falcon 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate Scienze della vita353046fornitura generale
Provette capillari per microematocrito FisherbrandThermo Fisher Scientific22-362566fornitura generale
Filtri cellulari sterili Fisherbrand, 70 &; mFisher Scientific22363548fornitura generale
FITC-anti-mouse CD4 (clone RM4-5)Invitrogen11-0042-85Anticorpi
Fixation BufferBD Bioscience554655Solution
Guide-it Compete sgRNA Screening SystemsClontech632636Kit
Soluzione di isotesia (isoflurano)Henry Schein29404
Kit di titolazione Lenti-X qRT-PCR in soluzione Kit631235Takara
Kit di deplezione cellulare per lignaggio, topoMiltenyi Biotec130-090-858Kit
Millex-HV Unità filtro siringa, 0,45 mmMillipore SigmaSLHV004SLalimentazione generale
PBS pH7.4 (1X)GibcoSoluzione 10010023
PE-Cy7-anti-mouse CD115 (Clone AFS98)eBioscience25-1152-82Anticorpi
PEI MAXPolysciences24765-1Soluzione
Penicillina-Streptomicina MiscelaLonza17-602FSoluzione
PerCP-Cy5.5-anti-topo Ly6G (Clone 1A8)BD Biosciences560602Anticorpi
pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP Addgene57823Plasmide
pMG2DAddgene12259Plasmide
Polibrene Reagente di infezione/trasfezioneSigma AldrichTR-1003-GSoluzione
Polipropilene Provette per centrifugaBECKMAN COULTER326823fornitura generale
psPAX2 Addgene12260Plasmide
RadDisk – Disco Irradiatore RoditoriBraintree ScientificIRD-P Mfornitura generale
Murina Ricombinante SCFPeprotech250-03Soluzione
Murina Ricombinante TPO Peprotech 315-14Soluzione
StemSpan SFEMSTEMCELL Technologies09600Soluzione
Kit di clonazione TOPO TA per il sequenziamento con One Shot TOP10 Kit di K457501 scientifico E.coliThermo fisherdi vitalità
fissabile Zombie Aqua423102BioLegend 
BD della chimicamente competente Kit Soluzione di

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