Identificazione di RNA circolari mediante il sequenziamento dell'RNA

Shobana Sekar; Philipp Geiger; Lori Cuyugan; Annalee Boyle; Geidy Serrano; Thomas G. Beach; Winnie S. Liang

doi:10.3791/59981

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Articolo metodologico

Identificazione di RNA circolari mediante il sequenziamento dell'RNA

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DOI:

10.3791/59981

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14 novembre 2019

Shobana Sekar¹^,² , Philipp Geiger¹^,² , Lori Cuyugan¹^,² , Annalee Boyle¹^,² , Geidy Serrano²^,³ , Thomas G. Beach²^,³ , Winnie S. Liang¹^,²

¹Translational Genomic Research Institute, ²Arizona Alzheimer's Consortium, ³Banner Sun Health Research Institute

In questo articolo

Sommario

Gli RNA circolari (circRNA) sono RNA non codificanti che possono avere ruoli nella regolazione trascrizionale e nelle interazioni di mediazione tra proteine. A seguito della valutazione di diversi parametri per la costruzione di librerie di sequenziamento di circuitRNA, è stato compilato un protocollo che utilizza la preparazione della libreria totale di RNA spiaggiata con il pretrattamento di RNase R ed è presentato qui.

Abstract

Gli RNA circolari (circRNA) sono una classe di RNA non codificanti coinvolti in funzioni tra cui la regolazione del microRNA (miRNA), la mediazione delle interazioni proteina-proteina e la regolazione della trascrizione genica parentale. Nel sequenziamento dell'RNA di nuova generazione (RNA-seq) classico, i circolrRNA sono tipicamente trascurati come risultato della selezione poli-A durante la costruzione di librerie di mRNA, o si trovano a un'abbondanza molto bassa e sono quindi difficili da isolare e rilevare. In questo caso, un protocollo di costruzione della libreria di circRNA è stato ottimizzato confrontando kit di preparazione della libreria, opzioni di pretrattamento e varie quantità totali di ingresso di RNA. Sono stati testati due kit di preparazione della libreria di trascrittomi interi disponibili in commercio, con e senza RNase R pre-trattamento, e utilizzando quantità variabili di ingresso totale di RNA (da 1 a 4 g). Infine, più tipi di tessuto; tra cui fegato, polmone, linfonodo e pancreas; così come più regioni cerebrali; tra cui il cervelletto, il lobo parietale inferiore, il giro temporale medio, la corteccia occipitale e il giro frontale superiore; sono stati confrontati per valutare l'abbondanza di circRNA tra i tipi di tessuto. L'analisi dei dati generati in RNA-seq utilizzando sei diversi strumenti di rilevamento degli RNA (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC e CIRCexplorer) ha rivelato che un kit di preparazione della libreria di RNA totale infilato con pretrattamento RNase R e 4 g di ingresso in RNA è l'ottimale per identificare il numero relativo più elevato di circRNA. Coerentemente con i risultati precedenti, il più alto arricchimento dei circRNA è stato osservato nei tessuti cerebrali rispetto ad altri tipi di tessuti.

Introduzione

Gli RNA circolari (CircRNA) sono RNA endogeni e non codificanti che hanno guadagnato attenzione data la loro espressione pervasiva nel trascrittoma eucarotico¹^,²^,³. Si formano quando gli esoni si ricongiungino l'uno con l'altro e quindi sono stati inizialmente considerati artefatti di giunzione⁴^,⁵. Tuttavia, studi recenti hanno dimostrato che i circRNA presentano il tipo di cellula, il tessuto e l'espressione specifica dello stadio di sviluppo³^,⁶ e sono evolut....