Questo articolo presenta un metodo per studiare il recettore del glutammato (GluR) nel traffico di cellule ippocampali primarie dissociate. Utilizzando un approccio anticorpale-alimentazione per etichettare i recettori endogeni o sovraespressi in combinazione con approcci farmacologici, questo metodo consente l'identificazione di meccanismi molecolari che regolano l'espressione della superficie di GluR modulando processi di internalizzazione o riciclaggio.
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Articolo metodologico
Un approccio di alimentazione anticorpale per studiare il traffico di recettori del glutammato nelle culture ippocampali primarie dissociate
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le risposte cellulari agli stimoli esterni si basano fortemente sull'insieme di recettori espressi sulla superficie cellulare in un dato momento. Di conseguenza, la popolazione di recettori espressi in superficie è costantemente adattandosi e soggetta a rigidi meccanismi di regolazione. L'esempio paradigmatico e uno degli eventi di traffico più studiati in biologia è il controllo regolato dell'espressione sinaptica dei recettori del glutammato (GluRs). I GluR mediano la stragrande maggioranza della neurotrasmissione eccitatoria nel sistema nervoso centrale e controllano i cambiamenti funzionali e strutturali dipendenti dall'attività fisiologica a livello sinaptico e neuronale (ad esempio, plasticità sinaptica). Le modifiche nel numero, posizione, e la composizione delle sottounità di superficie espressi GluRs influenzano profondamente la funzione neuronale e, infatti, le alterazioni in questi fattori sono associate a diverse neuropatie. Presentato qui è un metodo per studiare il traffico di GluR nei neuroni primari ippocampali dissociati. Un approccio di "alimentazione anticorpale" viene utilizzato per visualizzare in modo differenziale le popolazioni di GluR espresse nelle membrane superficiali e interne. Etichettando i recettori di superficie sulle cellule vive e fissandoli in momenti diversi per consentire l'endocitosi e/o il riciclaggio dei recettori, questi processi di traffico possono essere valutati e studiati in modo selettivo. Questo è un protocollo versatile che può essere utilizzato in combinazione con approcci farmacologici o sovraespressione di recettori alterati per ottenere informazioni preziose sugli stimoli e sui meccanismi molecolari che influenzano il traffico di GluR. Allo stesso modo, può essere facilmente adattato per studiare altri recettori o proteine espresse dalla superficie.
Introduzione
Le cellule utilizzano il processo attivo di traffico per mobilitare le proteine a specifiche localizzazioni subcellulari ed esercitare una rigorosa regolazione spatiotemporale sulla loro funzione1. Questo processo è particolarmente importante per i recettori transmembrani, poiché le risposte cellulari a diversi stimoli ambientali si basano su cascate intracellulari innescate dall'attivazione del recettore. Le cellule sono in grado di modificare queste risposte alterando la densità, la localizzazione e la composizione delle sottounità dei recettori espressi sulla superficie cellulare tramite il regolamento del traffico subcellulare del recettore....
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Protocollo
Il lavoro per la preparazione della cultura primaria dell'ippocampo è stato esaminato e approvato dal Northwestern University Animal Care and Use Committee (protocollo #IS00001151).
1. Preparazione prima dell'etichettatura
-
Preparazione e manutenzione delle colture primarie dell'ippocampo
- Preparare colture primarie di ippocampali ad una densità di 150.000 cellule placcate su bicchieri di copertura rivestiti in poli-D-lysina (0,1 mg/mL). Eccellenti guide per la preparazione della cultura neuronale dissociata sono disponibili7,8.
NOT:
- Preparare colture primarie di ippocampali ad una densità di 150.000 cellule placcate su bicchieri di copertura rivestiti in poli-D-lysina (0,1 mg/mL). Eccellenti guide per la preparazione della cultura neuronale dissociata sono disponibili7,8.
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Risultati
Questo protocollo per studiare il traffico dei recettori del glutammato si basa sull'etichettatura differenziale dei recettori espressi sulla superficie cellulare e su quelli espressi nelle membrane interne. La segregazione si ottiene etichettando i recettori prima e dopo la permeabilizzazione della membrana, utilizzando lo stesso anticorpo primario ma un anticorpo secondario coniugato a un fluoroforo diverso. Come delineato dalle fasi facoltative incluse il protocollo, questo è un metodo.......
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Discussione
L'interazione tra una cellula e il suo ambiente (ad esempio, la comunicazione con altre cellule, la risposta a diversi stimoli, ecc.), si basa fortemente sulla corretta espressione dei recettori sulla superficie cellulare. La regolazione rapida e messa a punto nel contenuto del recettore espresso in superficie consente una risposta cellulare adeguata a un ambiente in continua evoluzione. Nel caso particolare dei neuroni, le alterazioni del numero, la localizzazione e la composizione delle sottounità di recettori sinatici.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Northwestern Center for Advanced Scopy per l'uso del microscopio Nikon A1 Confocal e la loro assistenza nella pianificazione e nell'analisi degli esperimenti. Questa ricerca è stata supportata da NIGMS (T32GM008061) (A. M. C.), e NIA (R00AG041225) e da un NARSAD Young Investigator Grant della Brain & Behavior Research Foundation (#24133) (A. S. -C.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Occhiali copritutto spessi 18 mm Ø #1,5 | Neuvitro | GG181.5 | |
| Alexa 555-capra coniugata anti-topo secondaria | Life Technologies | A21424 | |
| Alexa 555-capra coniugata anti-coniglio secondaria | Life Technologies | A21429 | |
| Alexa 647-capra coniugata anti-topo secondaria | Life Technologies | A21236 | |
| Alexa 647-capra coniugata anti-coniglio secondario | Life Technologies | A21245 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| Corning Costar Piastre per colture cellulari a fondo piatto | Corning | 3513 | |
| Dynasore | Tocris | 2897 | |
| Glucosio | Sigma | G8270 | |
| Glycine | Tocris | 0219 | |
| Capra anti-coniglio Fab frammenti Sigma | SAB3700970 | ||
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| L-Glutammina | Sigma | G7513 | |
| Lipofectamina 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Topo anticorpo anti-GluA1 | Millipore | MAB2263 | |
| NaCl | Sigma | S6546 | |
| Neurobasal Media | Gibco | 21103049 | |
| NGS | Abcam Ab7481 | ||
| Parafilm | Bemis | PM999 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| Pelco BioWave | Ted Pella | 36500 | |
| PFA | Alfa Aesar | 43368 | |
| Picrotossina | Tocris | 1128 | |
| Bromidrato di poli-D-lisina | Sigma | P7280 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36934 | |
| Anticorpo anti-GFP di coniglio | Invitrogen | A11122 | |
| Anticorpo anti-PSD-95 di coniglio | Segnalazione cellulare | 2507 | |
| Strychnine | Tocris | 2785 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Superfrost plus vetrini per microscopio | Fisher | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| TTX | Tocris | 1078 |
Riferimenti
- Enns, C. Overview of protein trafficking in the secretory and endocytic pathways. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 15, Unit 15 11 (2001).
- Bedford, F. K. Encyclopedia of Neuroscience. Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. , Springer Berlin Heidelberg. 3385-3389 (2009).
- Diering, G. H., H....
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Ristampe e permessi
