Modulazione della localizzazione subcellulare Tau come strumento per studiare l'espressione dei geni correlati alla malattia

Sommario

Il Tau è una proteina neuronale presente sia nel citoplasma, dove lega i microtubuli, sia nel nucleo, dove esercita funzioni non convenzionali tra cui la modulazione dei geni correlati alla malattia di Alzheimer. Qui, descriviamo un metodo per studiare la funzione del Tau nucleare escludendo eventuali interferenze provenienti da citoplasmatica Tau.

Abstract

Il Tau è una proteina legante di microtubuli espressa nei neuroni e la sua principale funzione nota è legata al mantenimento della stabilità citoscheletrica. Tuttavia, prove recenti hanno indicato che Tau è presente anche in altri compartimenti subcellulari, tra cui il nucleo in cui è implicato nella protezione del DNA, nella trascrizione del rRNA, nella mobilità dei retrotrasposoni e nell'organizzazione strutturale del nucleolus. Recentemente abbiamo dimostrato che il Tau nucleare è coinvolto nell'espressione del gene VGluT1, suggerendo un meccanismo molecolare che potrebbe spiegare l'aumento patologico del rilascio del glutammato nelle prime fasi del morbo di Alzheimer. Fino a poco tempo fa, il coinvolgimento del Tau nucleare nella modulazione dell'espressione dei geni bersaglio è stato relativamente incerto e ambiguo a causa di limitazioni tecniche che impedivano l'esclusione del contributo di Tau citoplasmico o dell'effetto di altri fattori a valle non correlati al Tau nucleare. Per superare questa incertezza, abbiamo sviluppato un metodo per studiare l'espressione di geni bersaglio specificamente modulati dalla proteina Nucleare Tau. Abbiamo impiegato un protocollo che afcoppia l'uso di segnali di localizzazione e la frazione subcellulare, consentendo l'esclusione dell'interferenza dalle molecole citoplasmiche Tau. In particolare, il protocollo è facile ed è composto da metodi classici e affidabili che sono ampiamente applicabili per studiare la funzione nucleare di Tau in altri tipi di cellule e condizioni cellulari.

Introduzione

Le funzioni della proteina Tau nel nucleo hanno suscitato un notevole interesse negli ultimi anni, in quanto è stato dimostrato essere strettamente associato agli acidi nucleici^1,2,3,4,5,6. Ineffetti, un recente studio a livello di genoma ha dimostrato che Tau lega sequenze di DNA genico e intergenico in vivo⁷. Un ruolo nell'organizzazione nucleolare è stato suggerito^8,9,

Protocollo

1. Cultura cellulare

1. Cellule SH-SY5Y di coltura (linea cellulare del neuroblastoma umano, CRL-2266) nel mezzo completo (Dulbecco's modified Eagle medium:miscela nutritiva F12 [DMEM/F-12] completata con 10% di siero bovino fetale [FBS], 2 mM L-glutamina, 100 U/mL penicillina e 100 streptonomici). Mantenere le cellule in un'incubatrice a 37 e 5% di CO₂. Crescere le cellule in piastre 10 cm e dividere quando confluente.

2. Differenziazione cellulare

1. Per differenziare le cellule SH-SY5Y, il giorno dopo la placcatura, aggiungere 10 -M di acido retinoico (RA) per completare il mezzo per 5 giorni.
2. Il ....

Risultati

La strategia utilizzata per sezionare l'impatto del Tau nucleare nell'espressione genica evitando il contributo delle proteine Tau citoplasmiche è stata descritta nella Figura 1. In breve, le proteine Tau etichettate con NLS o NES vengono accumulate o escluse rispettivamente dal compartimento nucleare. L'effetto funzionale di questo squilibrio è l'alterazione dell'espressione genica misurata come prodotto del gene VGluT1.

Discussione

Descriviamo un metodo per misurare l'impatto della proteina Tau nucleare sull'espressione genica. Con questo protocollo il contributo di Tau citoplasmatica è fortemente limitato. I passaggi critici di questo protocollo sono i seguenti: la differenziazione delle cellule umane del neuroblastoma SH-SY5Y, la frazione subcellulare e la localizzazione della proteina Tau nel compartimento nucleare.

In primo luogo, come mostrato nella sezione dei risultati rappresentativi, la differenziazione delle ce.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Alexa Fluor 633 capra anti-topo IgG	Life Technologies	A21050	IF 1:500
anti anti-actina anticorpo	BETHYL LABORATORIE	A300-485A	anti-coniglio WB 1:10.000
anti GAPDH Anticorpo	Fitzgerald Industries International	10R-G109a	anti-topo WB 1:10.000
anti H2B Anticorpo	Abcam	ab1790	anti-coniglio WB 1:15.000
anti Tau-13 Anticorpo	Santa Cruz Biotechnology	sc-21796	anti-topo WB 1:1.000; IF 1:500
anti Tubulina alfa Anticorpo	Thermo Fisher Scientific	PA5-16891	anti-topo WB 1:5.000
anti VGluT1 Anticorpo	Sigma-Aldrich	AMAb91041	anti-topo WB 1:500
BCA Protein Assay Kit	Euroclone	EMPO14500
BDNF	Alomone Labs	B-250
Blotting-Grade Blocker	Biorad	1706404	Latte scremato in polvere
BOVIN SIERO ALBUMINA	Sigma-Aldrich	A4503-50g
cOmplete Mini	Roche	11836170001	inibitore della proteasi
Criterio TGX 4-20% senza macchie, 10 pozzetti	Biorad	5678093
DAPI	Thermo Fisher Scientific	62247
DMEM/F-12	GIBCO	21331-020
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucosio	Euroclone	ECM0060L
EDTA	Sigma-Aldrich	0390-100ml	pH = 8, 0,5 M
Siero bovino fetale	Euroclone	EC50182L
glicerolo	Sigma-Aldrich	G5516-500ml
Capra anti-topo IgG-HPR	Santa Cruz	Biotechnology sc-2005	WB 1:1.000
Capra anti-coniglio IgG-HPR	Santa Cruz Biotechnology	sc-2004	WB 1:1.000
IGEPAL CA-630	Sigma-Aldrich	I8896-50ml	Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol
Immobilon Western	MERCK	WBKLS0500
Lab-Tech Chamber slide 8 well	slide nunc	177402
L-glutammina	Euroclone	ECB3000D	100X
Reagente di trasfezione Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	12566014	lipidi cationici
Metanolo	Sigma-Aldrich	322415-6X1L
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266-100G
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014-1kg
Opti-MEM siero ridotto mezzo	Gibco	31985070
PEI	Sigma-Aldrich	40.872-7
Penicillina/Streptomicina	Thermo Fisher Scientific 15140122		10.000 U/mL, 100 mL
Soluzione salina tamponata con fosfato (Dulbecco A)	OXOID	BR0014G
PhosStop	Roche	4906837001	inibitore della fosfatasi
QIAGEN Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12163	Passaggio 3.10
Acido retinoico	Sigma-Aldrich	R2625-100mg
Kit di frazionamento delle proteine subcellulari per cellule in coltura	Thermo Fisher Scientific	78840
Membrana di nitrocellulosa supportata	Biorad	1620097
TC-Plate 6well	SARSTEDT	833.920
TCS SP2 microscopio confocale a scansione laser	Leica	N/A
Triton x-100	Sigma-Aldrich	X100-500ml	Tensioattivo non ionico
Tripsina-EDTA	Thermo Fisher Scientific	15400054	0,50%
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416-100ml
VECTASHIELD mezzo di montaggio antisbiadimento	Vector Laboratories	H-1000
Wizard Plus SV Minipreps Sistemi	di purificazione del DNAPromega	A1330	Passaggio 3.5

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