Method Article

Etichettatura specifica dei nucleoidi mitocondriali per la microscopia dell'illuminazione strutturata time-lapse

DOI:

10.3791/60003

⸱

June 4th, 2020

 ,  , 
1Imaging Facility, Max Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il protocollo descrive l'etichettatura specifica dei nucleoidi mitocondriali con una macchia di gel di DNA disponibile in commercio, l'acquisizione di una serie di cellule con etichettatura live-lapse mediante microscopia di illuminazione strutturata super-risoluzione (SR-SIM) e tracciamento automatico del movimento nucleoide.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I nucleotidi mitocondriali sono particelle compatte formate da molecole di DNA mitocondriale rivestite di proteine. Il DNA mitocondriale codifica tRNA, rRNA e diversi polipeptidi mitocondriali essenziali. I nucleoidi mitocondriali si dividono e si distribuiscono all'interno della rete mitocondriale dinamica che subisce fissione/fusione e altri cambiamenti morfologici. La microscopia a fluorescenza dal vivo ad alta risoluzione è una tecnica semplice per caratterizzare la posizione e il movimento di un nucleoide. Per questa tecnica, i nucleoidi sono comunemente etichettati attraverso tag fluorescenti dei loro componenti proteici, vale a dire il fattore di trascrizione a (TFAM). Tuttavia, questa strategia ha bisogno di sovraespressione di un costrutto fluorescente con tag proteico, che può causare artefatti (riportati per TFAM) e non è fattibile in molti casi. I coloranti organici che legano il DNA non presentano questi svantaggi. Tuttavia, mostrano sempre una colorazione dei DNA nucleari e mitocondriali, mancando quindi di specificità ai nucleoidi mitocondriali. Tenendo conto delle proprietà fisico-chimiche di tali coloranti, abbiamo selezionato una macchia di gel acido nucleico (SYBR Gold) e ottenuto l'etichettatura preferenziale dei nucleoidi mitocondriali nelle cellule vive. Le proprietà del colorante, in particolare la sua elevata luminosità dopo il legame al DNA, permettono la successiva quantificazione del movimento nucleoideto mitocondriale utilizzando serie temporali di immagini di illuminazione strutturata super-risoluzione.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le molecole circolari di DNA da 16,5 kbp costituiscono il materiale genetico dei mitocondri, codificando 22 tRNA, 2 rRNA e 13 polipeptidi necessari per i complessi di fosforooostiami ossidriali mitocondriali. Il DNA mitocondriale legato al fattore trascrizione mitocondriale a (TFAM) e diverse altre proteine formano i nucleoidi mitocondriali1,2,3,4.4 I nucleoidi mitocondriali si spostano e si ridistribuiscono tra i componenti della rete mitocondriale5,6 durante il suo rimodellamento morfologico, fissione o fusione a seconda della fase del ciclo cellulare, dello stress e di altri fattori (rivisti in Pernas et al.7). Inoltre, il movimento dei nucleoidi mitocondriali, è implicato nellamalattia di 8 del lupus del lupus sistemico e può svolgere un ruolo in altre malattie. La microscopia a fluorescenza è una tecnica semplice per gli studi in cellule vive di organelli, ma la tecnica ha una risoluzione di >200 nm, che è maggiore delle dimensioni dei nucleoidi mitocondriali (100 nm9,10,11,12). Questo limite è stato aggirato con le cosiddette tecniche di "super-risoluzione", come l'esaurimento stimolato delle emissioni (STED) e la microscopia per la localizzazione a singola molecola (SMLM)13,14. Finora, i nucleoidi mitocondriali e altri DNA sono stati immagini nelle cellule vive mediante microscopia ottica stocastica diretta (dSTORM)15. Strutture sub-mitocondriali fini con posizioni correlate con mtDNA sono state osservate da STED nelle cellule vive16. Tuttavia, queste tecniche di super-risoluzione richiedono un'elevata intensità di illuminazione, che provoca effetti fototossici sulle cellule viventi17. Pertanto, l'imaging time lapse di nucleoids mitocondriali con risoluzione oltre il limite di diffrazione è impegnativo. Per risolvere questo problema, abbiamo utilizzato la microscopia di illuminazione strutturata a super-risoluzione (SR-SIM)18. SIM richiede una dose di potenza di illuminazione molto inferiore rispetto a STED e SMLM19. Inoltre, a differenza delle tecniche STED e SMLM, la SIM consente un semplice imaging tridimensionale multicolore (3D) e non richiede particolari proprietà fotofisiche dei fluorofori o della composizione del buffer di imaging19.

La strategia convenzionale per l'etichettatura dei nucleoidi mitocondriali nelle cellule vive è l'etichettatura fluorescente di una proteina nucleoide mitocondriale, come TFAM20. Tuttavia, in molti casi, questa strategia non è adatta. Inoltre, la sovraespressione del TFAM fluorescente con tag proteici produce un grave artefatto21. L'etichettatura del DNA con coloranti organici presenta vantaggi rispetto a una strategia basata su proteine fluorescenti (FP). I coloranti organici sono privi di vincoli legati all'etichettatura fp: possono essere utilizzati per qualsiasi tipo di cellule o tessuti e possono essere applicati in qualsiasi momento di un esperimento. L'imaging cellulare vivo dei nucleoidi mitocondriali è stato segnalato con diversi coloranti leganti il DNA: DAPI22, SYBR Green23, Vybrant DyeCycle24e picoGreen15,25,26.26 Un sostanziale inconveniente della maggior parte dei coloranti che legano il DNA per l'etichettatura dei nucleoidi è che macchiano tutto il DNA all'interno della cellula. Puntare un tintura esclusivamente al DNA mitocondriale è altamente auspicabile. Per raggiungere questo obiettivo, è necessaria un'attenta selezione di un colorante che possiede proprietà fisico-chimiche adeguate. I coloranti lipofilici che possiedono una carica positiva delocalizzata, come la rhodamina 123, sono noti per accumularsi nei mitocondri vivi, che conservano il loro potenziale di membrana negativa. Inoltre, un colorante ideale per l'etichettatura specifica dei nucleoidi mitocondriali dovrebbe legare il DNA con un'alta affinità ed emettere fluorescenza luminosa durante il legame del DNA. Considerando questi requisiti, alcune cianine sono promettenti (ad esempio, picoGreen), ma il DNA nucleare è abbondantemente macchiato da questi coloranti contemporaneamente con DNA mitocondriale15,25,26. Il protocollo attuale descrive l'etichettatura specifica dei nucleoidi mitocondriali nelle cellule vive con un altro colorante cianino, SYBR Gold (SG), e il monitoraggio dei nucleoidi nei video SIM a super-risoluzione time lapse. Inoltre, le cellule vive macchiate di SG possono essere immagini da qualsiasi tipo di microscopio fluorescente invertito (confocale, disco rotante, epifluorescenza, ecc.) adatto per le cellule viventi e dotato di una fonte di luce fluorescente invertita.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Tutte le linee cellulari qui menzionate sono state coltivate nel mezzo dell'aquila modificata di alto glucosio (DMEM) integrato con 10% siero bovino fetale (FBS), glutammina, penicillina / streptomicina, e pyruvate. Erizza tutti i mezzi e gli integratori da utilizzare il giorno dell'etichettatura e dell'imaging riscaldandoli fino a 37 gradi centigradi in un'incubatrice impostata al 5% di CO2. Tutte le colture cellulari, compresa l'etichettatura, si svolgono in condizioni sterili sotto una cappa di flusso laminare.

1. Etichettatura delle celle vive

  1. Un giorno prima della procedura di etichettatura, coltura 4 x 105 cellule HeLa in 2 mL di media in un piatto Petri 35 mm con fondo di vetro #1,5. Possono essere utilizzati vetrini multi-ben camerati, ma i volumi devono essere regolati proporzionalmente al volume del pozzo. Diluire la sospensione cellulare per avere circa 50.000 cellule / mL e seme 2 mL della sospensione cellulare in una parabola Petri 35 mm.
  2. Preparare le seguenti diluizioni della soluzione commerciale SYBR Gold (SG): 1:5.000. Preparare Mitotracker Deep Red (macchia rossa lontana) o Mitotracker CMXRos Rosso (macchia rossa) (Tabella dei materiali; stock commerciale diluito 1:2,000) in mezzo di cultura senza rosso fenolo. Preparare le stesse diluizioni set di picoGreen come per SG.
    NOT: Le soluzioni descritte nel passaggio 1.2 sono le soluzioni di etichettatura 2x. Proteggere tutte le soluzioni contenenti coloranti fluorescenti dalla luce il più possibile.
  3. Lavare le cellule aderenti con 2 mL PBS una volta. Aggiungere 1 ml di fenolo senza coltura rossa al piatto Petri da 35 mm. Per uno scivolo a 8 pozze, utilizzare un volume pari a 1/2 della capacità totale del pozzo (ad esempio, aggiungere 125 l se la capacità totale del pozzo è di 250 .
  4. Aggiungere 1 mLdella soluzione di etichettatura 2x preparata al punto 1.2-35 mm piatto Petri. Per uno scivolo a 8 camere, utilizzare un volume pari a 1/2 della capacità totale del pozzo. Incubare le cellule per 30 min a 37 s C sotto il 5% di CO2.
    NOT: Non incubare le cellule con soluzione di etichettatura SG per più di 1 h, perché l'incubazione più lunga causerà l'etichettatura del DNA nucleare.
  5. Aspirare con attenzione il mezzo contenente i coloranti fluorescenti e lavare le cellule una volta con PBS.
  6. Aggiungere il mezzo di coltura delle cellule senza macchie e mantenere le cellule al buio in un'incubatrice di CO2 a 37 gradi centigradi fino all'imaging.
  7. Cellule viventi di immagini su un microscopio SR-SIM dotato di un'unità di incubazione (vedi sotto).

2. Acquisizione di immagini SR-SIM

  1. Installare un incubatore stage-top sullo stadio del microscopio. Impostare la temperatura desiderata e la concentrazione di CO2 (ad es., 37 e 5% per le cellule dei mammiferi) e mantenere caldo per almeno 1 h prima di iniziare l'acquisizione dell'immagine.
  2. Accendere tutti i componenti del microscopio SR-SIM, compresi i laser, e lasciarli riscaldare per almeno 1 h.
  3. Scegliere un obiettivo di immersione ad alto ingrandimento, alta apertura numerica (NA) (ad esempio, 100x 1,46 NA olio) consigliato per SR-SIM dal produttore del microscopio.
  4. Installare uno scivolo a camera o un piatto da 35 mm con celle etichettate (dal punto 1.6) sullo stadio del microscopio incubato.
  5. Individuare l'area di interesse sul campione, preferibilmente con oculari. Per ottenere la migliore qualità di imaging SR-SIM, scegliere le celle che sono ben attaccate al vetro.
  6. Utilizzare una fotocamera EM-CCD (High-end Device) con tintura posteriore per acquisire immagini SR-SIM.
  7. Utilizzando il software di acquisizione delle immagini, impostare un elevato guadagno EM consigliato per la fotocamera utilizzata (ad esempio, 300).
  8. Prima di acquisire la serie time lapse per il tracciamento dei nucleoidi, acquisisci un'immagine SR-SIM a due colori dello stesso campo visivo: un canale per la colorazione mitocondriale e un altro per SG. Impostare il primo canale di colore appropriato per la macchia mitocondriale utilizzata (ad esempio, per una macchia mitocondriale di gran lunga rossa, impostare l'eccitazione a 633 nm o più a lungo e un filtro di emissione longpass di 650 nm). Per il segnale SG, impostare l'eccitazione a 488 nm e un filtro di emissione a passabanda da 500-550 nm.
  9. Utilizzando il software, impostare la potenza laser più bassa possibile sia per 488 nm e linee di macchia di gran lunga rosso.
    NOT: Un'impostazione tipica è l'1% di potenza di uscita laser regolata da un filtro regolabile acousto-ottico (AOTF).
  10. Se il microscopio SIM acquisisce i canali solo in sequenza (configurazione a telecamera singola), spegnere il canale di rilevamento delle macchie di granlungamento.
  11. Impostare l'acquisizione di un singolo piano focale disattivando l'acquisizione dello stack z deselezionando la casella di stack z nel software.
  12. Impostare il tempo di esposizione della fotocamera EM-CCD più breve possibile.
  13. Impostare tre rotazioni della griglia anziché cinque rotazioni.
  14. Per aumentare la frequenza fotogrammi, nella scheda Acquisizione del software, impostare la telecamera in modo che legga i dati solo dall'area centrale del sensore della fotocamera invece di "Full Chip".
    NOT: Ad esempio, il passaggio dalla lettura di un'area di 1.000 x 1.000 pixel di sensore completo alla lettura solo 256 x 256 pixel consente una riduzione del tempo di esposizione della fotocamera da 50 ms a 13,4 ms e il tempo totale del fotogramma da 1,8 s a 1,2 s. Se viene letta solo una parte centrale del sensore della fotocamera, il campo visivo sarà molto piccolo per un obiettivo 63x o 100x tipicamente utilizzato per SR-SIM. Un tempo di esposizione più breve ridurrà il rapporto segnale-rumore delle immagini.
  15. Ottimizzare la potenza laser e il tempo di esposizione della fotocamera: acquisire immagini bidimensionali SR-SIM (2D) di celle etichettate con diversi valori di potenza laser (ad esempio, 0,5%, 1%, 1,5%, 2%) e diversi tempi di esposizione (ad esempio, 13,4 ms, 25 ms, 50 ms).
  16. Elaborare i set di dati SIM non elaborati (vedere il passaggio 3.1).
  17. Scegli la potenza laser e i tempi di esposizione della fotocamera che producono immagini SIM con punti luminosi nei mitocondri (cioè i nucleoidi) con pochi o nessun artefatto generato dall'elaborazione della SIM. Esaminare le aree esterne ai mitocondri (ad esempio, l'1% del laser a stato solido da 488 nm e l'esposizione di 25 ms della telecamera EM-CCD).
  18. Avviare l'acquisizione della serie time lapse utilizzando le impostazioni ottimizzate nei passaggi 2.15–2.17.

3. Elaborazione e analisi dei dati

  1. Elabora set di dati SIM grezzi con il modulo di illuminazione strutturata di un software adatto (Tabella dei materiali): scegliere la casella di controllo Auto per i parametri di elaborazione della SIM. Per l'elaborazione automatica di più file, utilizzare lo strumento di elaborazione batch, deselezionare Usa corrente per Batch, fare clic su Esegui batch e selezionare più file per l'elaborazione SIM.
  2. Convertire i set di dati di serie temporali elaborati SIM in formato ims con il software Imaris file converter (cioè la versione corrispondente alla versione del software Imaris).
  3. Aprire un file convertito nel software (versione 8.4.1 o successiva) con una licenza per il modulo Lineage (o Track).
  4. Avviare la procedura guidata di creazione "Spots" facendo clic sull'icona Aggiungi nuovi spot. Verrà avviata una procedura guidata per la creazione.
  5. Scegliere la scheda Crea della procedura guidata.
  6. Nel primo passaggio della procedura guidata, fare clic su Track Spots (nel tempo) e procedere al secondo passaggio della procedura guidata.
  7. Impostare Diametro XY stimato su 0,1-0,15 m, fare clic su Sotrazione sfondo e procedere al terzo passaggio.
  8. Regolare la soglia nel filtro "Qualità" trascinando la linea verticale nell'istogramma in modo che la maggior parte dei nucleoidi venga rilevata come "punti", mentre gli artefatti non vengono rilevati (cioè, i punti rilevati sono contrassegnati come palline sovrapposte sull'immagine). Controllare se questo è il caso su ogni fotogramma e regolare la soglia, se necessario. Procedere al quarto e quindi al quinto passaggio della procedura guidata.
  9. Scegliere l'algoritmo Movimento automatico. Impostare Distanza massima su 0,5 m. Impostare Dimensione spazio massimo su 0.
  10. Guarda ogni fotogramma nelle serie temporali e controlla se vengono disegnate tracce false e se vengono introdotte delle tracce tra le tracce (le tracce create dalla procedura guidata con le impostazioni correnti sono immediatamente contrassegnate come linee sovrapposte sull'immagine). Regolare "Distanza massima", se necessario. Procedere al sesto passaggio della procedura guidata. Scegliere il filtro Durata traccia e impostare una soglia compresa tra 3 e 5 s.
  11. Se i punti o le tracce attualmente rilevati non sono ottimali, tornare ai passaggi precedenti della procedura guidata utilizzando i pulsanti di navigazione (nella parte inferiore della finestra della procedura guidata) necessari per ottimizzare qualsiasi parametro per la creazione di macchie o tracce.
  12. Quando i parametri perfezionati consentono al software di rilevare correttamente tutte le macchie e costruire le tracce, fare clic sul pulsante di navigazione freccia verde nella procedura guidata per confermare la creazione delle tracce.
  13. Estrarre le statistiche delle tracce facendo clic sulla finestra dell'icona Statistiche. Scegliere i parametri delle statistiche necessari (schedeValori dettagliati e Valori medi in Statistiche) ed esportare i valori come file csv facendo clic sull'icona Unità floppy per la quantificazione e la visualizzazione.
    NOT: La velocità massima della pista, la velocità della pista media, la lunghezza della pista e lo spostamento della pista sono esempi di parametri importanti.
  14. Se il set di dati dell'immagine deve essere presentato o pubblicato, creare istantanee e/o file video che rappresentano la serie time lapse con tracce sovrapposte facoltativamente sovrapposte utilizzando gli strumenti Istantanea o Animazione.

4. Acquisizione di immagini confocali

  1. Installare un'incubatrice stage-top sullo stadio del microscopio, impostare la temperatura desiderata e la concentrazione di CO2 (cioè 37 e 5% per le cellule dei mammiferi) e tenersi caldo per almeno 1 h prima di iniziare l'acquisizione dell'immagine.
  2. Accendere tutti i componenti di un microscopio a scansione laser confocale, compresi i laser, e lasciarli riscaldare per almeno 1 h.
  3. Scegliere l'obiettivo di ingrandimento medio-alto desiderato e il campionamento spaziale in base ai criteri Nyquist.
  4. Per il canale SG, impostare l'eccitazione su 488 nm e un intervallo di rilevamento di 500-550 nm. Per il canale di macchie mitocondriali, impostare su 561 nm e 570–630 nm per un coloranti rosso, o 633 nm eccitazione e >650 nm emissione per un coloranti lontano rosso.
  5. Impostare la potenza laser più bassa possibile (in genere 1% o meno) che consente l'acquisizione dei segnali con rilevatori PMT guadagni di 700 mV.
  6. Acquisire immagini confocali a due colori delle cellule, dove i nucleoidi mitocondriali vengono rilevati nel "canale SG" e i mitocondri vengono rilevati nel canale "rosso" o "molto rosso".

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caratterizzazione dell'etichettatura delle cellule vive con SG
In primo luogo, la distribuzione di SG nelle cellule su incubazione con il tinrito a varie diluizioni è stata caratterizzata da microscopia confocale. Dopo l'incubazione con alte concentrazioni di SG o picoGreen, entrambi i coloranti per lo più etichettavano i nuclei e hanno mostrato una colorazione puntato nel citoplasma (Figura 1), analogamente ai dati pubblicati per un altro...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ci sono diversi componenti critici per il protocollo: per ottenere un'etichettatura preferenziale del DNA mitocondriale, la concentrazione del tinaccio di legame del DNA durante l'incubazione dovrebbe essere mantenuta molto bassa (ad esempio, una diluizione di 1:10.000 di un tipico stock commerciale), e il tempo di incubazione dovrebbe essere di 30 min. Il tempo di incubazione non deve mai essere superiore a 1 h. si deve usare un tinrio d'oro SYBR; altri coloranti che legano il DNA non sono abbastanza luminosi da generar...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori riconoscono Asifa Akhtar e Angelika Rambold (sia Max Planck Institute for Immunobiology and Epigenetics) per la fornitura di cellule HeLa.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Elyra PS1Carl Zeissmicroscopio multimodale a super-risoluzione con modulo per microscopia a illuminazione strutturata a super-risoluzione (SR-SIM)
DMEM ad alto glucosioGIBCO/ThermoFisher31966021
ibidi 35 mm piatto, fondo di vetroIbidiGmbh 81158
ibidi 8-well microSlide, fondo di vetroIbidi Gmbh80827
Pacchetto software per la visualizzazione e la ricerca di immaginiImaris 8.4.1Bitplane/Oxford Instruments
iXon 885Andor Technologiescon sensore retroilluminato
LSM880 AiryscanMicroscopio confocale a scansione laser Carl Zeisscon rivelatore
array Mitotracker CMXRos RedThermoFischerM7512mitocondriale a cellule vive rosse macchia
Mitotracker Deep Red FMThermoFischerM22426macchia mitocondriale a cellule vive rosso
lontano picoGreenThermoFischerP7581macchia di DNA permutata a cellule
Plan Apochromat 100x/1.46 Obiettivo dell'olioCarl Zeiss
SYBR GoldThermoFischerS11494macchia di DNA permeant cellulare
Zen Black 2012 softwareCarl ZeissSoftware di acquisizione ed elaborazione delle immagini
Telecamera EMCCD

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaufman, B. A., et al. The mitochondrial transcription factor TFAM coordinates the assembly of multiple DNA molecules into nucleoid-like structures. Molecular Biology of the Cell. 18 (9), 3225-3236 (2007).
  2. Farge, G., et al. Protein sliding and DNA denaturation are essential for DNA organization by human mitochondrial transcription factor A. Nature Communications. 3, 1013(2012).
  3. Bogenhagen, D. F. Mitochondrial DNA nucleoid structure. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 914-920 (2012).
  4. Kang, D., Kim, S. H., Hamasaki, N. Mitochondrial transcription factor A (TFAM): roles in maintenance of mtDNA and cellular functions. Mitochondrion. 7 (1-2), 39-44 (2007).
  5. Tauber, J., et al. Distribution of mitochondrial nucleoids upon mitochondrial network fragmentation and network reintegration in HEPG2 cells. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (3), 593-603 (2013).
  6. Garrido, N., et al. Composition and dynamics of human mitochondrial nucleoids. Molecular Biology of the Cell. 14 (4), 1583-1596 (2003).
  7. Pernas, L., Scorrano, L. Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function. Annual Review of Physiology. 78, 505-531 (2016).
  8. Caielli, S., et al. Oxidized mitochondrial nucleoids released by neutrophils drive type I interferon production in human lupus. Journal of Experimental Medicine. 213 (5), 697-713 (2016).
  9. Okayama, S., Ohta, K., Higashi, R., Nakamura, K. Correlative light and electron microscopic observation of mitochondrial DNA in mammalian cells by using focused-ion beam scanning electron microscopy. Microscopy (Oxf). 63 (Suppl 1), i35(2014).
  10. Alan, L., Spacek, T., Jezek, P. Delaunay algorithm and principal component analysis for 3D visualization of mitochondrial DNA nucleoids by Biplane FPALM/dSTORM. European Biophysics Journal. 45 (5), 443-461 (2016).
  11. Kukat, C., et al. Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).
  12. Kukat, C., Larsson, N. G. mtDNA makes a U-turn for the mitochondrial nucleoid. Trends in Cell Biology. 23 (9), 457-463 (2013).
  13. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  14. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  15. Benke, A., Manley, S. Live-cell dSTORM of cellular DNA based on direct DNA labeling. ChemBioChem. 13 (2), 298-301 (2012).
  16. Ishigaki, M., et al. STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells. Mitochondrion. 28, 79-87 (2016).
  17. Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348(2015).
  18. Gustafsson, M. G., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
  19. Hirano, Y., Matsuda, A., Hiraoka, Y. Recent advancements in structured-illumination microscopy toward live-cell imaging. Microscopy (Oxf). 64 (4), 237-249 (2015).
  20. Brown, T. A., et al. Superresolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction. Molecular and Cellular Biology. 31 (24), 4994-5010 (2011).
  21. Lewis, S. C., Uchiyama, L. F., Nunnari, J. ER-mitochondria contacts couple mtDNA synthesis with mitochondrial division in human cells. Science. 353 (6296), aaf5549(2016).
  22. Dellinger, M., Geze, M. Detection of mitochondrial DNA in living animal cells with fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 204 (Pt 3), 196-202 (2001).
  23. Ban-Ishihara, R., Ishihara, T., Sasaki, N., Mihara, K., Ishihara, N. Dynamics of nucleoid structure regulated by mitochondrial fission contributes to cristae reformation and release of cytochrome c. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11863-11868 (2013).
  24. Zurek-Biesiada, D., et al. Localization microscopy of DNA in situ using Vybrant((R)) DyeCycle Violet fluorescent probe: A new approach to study nuclear nanostructure at single molecule resolution. Experimental Cell Research. 343 (2), 97-106 (2016).
  25. He, J. Y., et al. The AAA(+) protein ATAD3 has displacement loop binding properties and is involved in mitochondrial nucleoid organization. Journal of Cell Biology. 176 (2), 141-146 (2007).
  26. Ashley, N., Harris, D., Poulton, J. Detection of mitochondrial DNA depletion in living human cells using PicoGreen staining. Experimental Cell Research. 303 (2), 432-446 (2005).
  27. Jevtic, V., Kindle, P., Avilov, S. V. SYBR Gold dye enables preferential labeling of mitochondrial nucleoids and their time-lapse imaging by structured illumination microscopy. PLoS One. 13 (9), e0203956(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial NucleoidsSYBR GoldStructured Illumination MicroscopyLive Cell ImagingTime lapse ImagingFluorescent DyeMitochondrial DNASuper resolution MicroscopyNucleoid TrackingCell Culture

Related Articles