Qui, presentiamo un protocollo basato sulla meccanica per interrompere la giunzione gap connexin 43 e misurare l'impatto successivo che questo ha sulla biomeccanica endoteliale attraverso l'osservazione di trazioni e sollecitazioni intercellulari.
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Articolo metodologico
Biomeccanica edonteliale perturbatrice tramite Connexin 43 Disgregazione strutturale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Sono state create cellule endoteliali per generare sollecitazioni e trazioni intercellulari, ma il ruolo delle giunzioni gap giocate nella generazione di stress e trazione intercellulare endoteliale è attualmente sconosciuto. Pertanto, presentiamo qui un protocollo basato sulla meccanica per sondare l'influenza della giunzione gap connexin 43 (Cx43) ha sulla biomeccanica endoteliale esponendo monostrati endoteliali confluenti a un noto inibitore Cx43 2,5-dihydroxychalcone (chalcone) e misurando l'impatto di questo inibitore sulle trazioni e sulle sollecitazioni intercellulari. Vi presentiamo risultati rappresentativi, che mostrano una diminuzione sia delle trazioni che delle sollecitazioni intercellulari sotto un alto dosaggio di chalcone (2 g/mL) rispetto al controllo. Questo protocollo può essere applicato non solo a Cx43, ma anche ad altre giunzioni di gap, supponendo che venga utilizzato l'inibitore appropriato. Crediamo che questo protocollo sarà utile nei campi della ricerca cardiovascolare e meccanobiologia.
Introduzione
Il campo che si riferisce allo studio degli effetti delle forze fisiche e delle proprietà meccaniche sulla fisiologia e patologia cellulare e tissutale è noto come meccanobiologia1. Alcune tecniche utili che sono state utilizzate nella meccanobiologia sono la microscopia a stress monostrato e la microscopia a forza di trazione. La microscopia a forza di trazione consente il calcolo delle trazioni generate nell'interfaccia del substrato cellulare, mentre la microscopia a sollecitazione del monostrato consente il calcolo delle sollecitazioni intercellulari generate tra celle adiacenti all'interno di un monostrato2 ,<....
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Protocollo
1. Produrre gel poliacrilammide (PA)
-
Preparazione del piatto Petri
- Preparare la soluzione legare la soluzione silarante mescolando 200 mL di acqua ultrapura con 80 .L acido acetico e 50 .L di 3-(trimethoxysilyl)methacrylato. Bind silane è una soluzione utilizzata per funzionalizzare la superficie della piastra Petri fondo di vetro per l'attacco idrogel.
- Mescolare la soluzione di sbarramento su una piastra di mescolare per almeno 1 h.
- Trattare il pozzo centrale della piastra Petri con soluzione silano a scalo per 45 min.
- Rimuovere la soluzione silaceri di rilegamento e sciacquare la piastra Petri co....
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Risultati
Le immagini a contrasto di fase del controllo, 0,2 g/mL e 2 monostrati di chalcone trattati con chalcone di fase sono state scattate 30 minuti prima del trattamento dei chalcone (Figura 1A-C) e 2 ore dopo il trattamento dei chalcone (Figura 1D-F). Sono stati osservati spostamenti di perline indotta da cellule (m) diminuire sia nelle condizioni di chalcone a bassa dose che in condizioni di chalcon.......
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Discussione
Il nostro gruppo, così come altri, ha utilizzato con successo TFM e MSM per sondare l'influenza delle giunzioni cellula-cellula in vari processi cellulari patologici e fisiologici in vitro7,15,18,27 . Per esempio, Hardin e altri hanno presentato uno studio molto approfondito che suggerisce guide di trasmissione intercellulare della trasmissione della stress la formazione di gap paracellulare ne.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi di start-up dell'Università della Florida centrale e dal National Heart, Lung, And Blood Institute del National Institute of Health sotto il premio K25HL132098.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Vetrino coprioggetti da 18 mm | ThermoFisher | 18CIR-1 | Essenziale per appiattire i gel di poliacrilammide |
| 2% bis-acrilammide | BIO-RAD | 1610143 | Componente del gel di poliacrilammide |
| 2′,5′-Diidrossicalcone | SIGMA | IDF00046 | Per interrompere la struttura Cx43 |
| 3-(Trimetossisilil)metacrilato di propile | SIGMA | 2530-85-0 | Soluzione madre per legare la miscela di silani con acido acetico e acqua ultrapura |
| 40% Acrilammide | BIO-RAD | 1610140 | Componente del gel di poliacrilammide |
| Acido acetico | Fisher-Sceintific | 64-19-7 | Essenziale per legare la soluzione salina |
| Alexa Fluro 488 capra anti-topo IgG; | ThermoFisher | Catalog # A-11001 | Anticorpo secondario |
| Persolfato di ammonio | BIO-RAD | 1610700 | Agente polimerizzante su gel di poliacrilammide |
| Albumina sierica bovina (BSA) | SIGMA | 9048-46-8 | Per realizzare una soluzione bloccante |
| di atelo-collagene bovino di tipo I, 3 mg/mL, 100 mL | Advance Biomatrix | 5005-100ML | Utilizzare come matrice |
| extracellulareCorning Cell Culture Soluzione salina tamponata con fosfato (1x) | Fisher-Sceintific | 21040CV | Soluzione salina tampone necessaria per la coltura cellulare |
| Dimetilsolfossido, Fisher BioReagents | Fisher-Sceintific | 67-68-5 | Per sciogliere il calcone e fare la soluzione madre |
| Fluoromount-G con DAPI | ThermoFisher | 00-4959-52 | Terreno di montaggio per immunostaing utilizzato per colorare per DAPI |
| Microsfera fluorescente Perle modificate con carbossilato | ThermoFisher | F8812 | Perle modificate con carbossilato da 0,5 micron (rosso), 2% di solidi Soluzione tampone |
| HEPES 1 M | SIGMA | 7365-45-9 | Essenziale per |
| LVES | ThermoFisher | A1460801 | Integratore essenziale di terreni HUEVC 200 |
| Terreno 200 ThermoFisher | M200500 | Terreni essenziali per colture | |
| cellulari HUVECAnticorpo monoclonale di topo Cx43 (CX - 1B1) | ThermoFisher | Catalog #13-8300 | Anticorpo primario per piastra di Petri Cx43 |
| (diametro 35 mm) | CellVis | D35-20-1.5H | Piastra di Petri da 35 mm con pozzetto centrale da 20 mm |
| Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg | Proteochem | 102568-43-4 | Essenziale per funzionalizzare la superficie del gel di poliacrilammide |
| Kit di elastomeri siliconici SYLGARD 184 | DOW corning | 2646340 | Elastomero siliconico con agente indurente per la produzione di PDMS |
| TEMED | BIO-RAD | Agente polimerizzante su gel di poliacrilammide | |
| Triton-X 100 | SIGMA | 9002-93-1 | Per permeabilizzare le cellule |
| Tripsina -EDTA | ThermoFisher | 25300054 | Utilizzato per il distacco delle cellule |
Riferimenti
- Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. Mechanobiology and developmental control. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).
- Schwarz, U. S., Soine, J. R. Traction force microscopy on soft elastic substrate....
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Ristampe e permessi
