Presentato qui è un protocollo per l'effettiva soppressione della replicazione del virus dell'epatite B (HBV) nei topi utilizzando il trasferimento di cellule adottive (ACT) di antigeni virali (Ag) specifici di cellule staminali. Questa procedura può essere adattata per una potenziale immunoterapia basata su ACT dell'infezione da HBV.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Le cellule staminali derivate dall'ag virale specifico t linfociti sopprimeno la replica HBV nei topi
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'infezione da virus dell'epatite B (HBV) è un problema di salute globale. Con oltre 350 milioni di persone colpite in tutto il mondo, l'infezione da HBV rimane la principale causa di cancro al fegato. Si tratta di una delle principali preoccupazioni, soprattutto nei paesi in via di sviluppo. Il fallimento del sistema immunitario per montare una risposta efficace contro l'HBV porta a infezioni croniche. Anche se il vaccino HBV è presente e si stanno creando nuovi farmaci antivirali, l'eradicazione delle cellule del serbatoio del virus rimane un importante argomento sanitario. Qui è descritto un metodo per la generazione di antigene virale (Ag) specifico CD8- linfociti T citotossici (CTL) derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) (cioè iPSC-CTL), che hanno la capacità di sopprimere la replicazione HBV. La replicazione HBV è indotta in modo efficiente nei topi attraverso l'iniezione idrodinamica di un plasmide di espressione HBV, pAAV/HBV1.2, nel fegato. Quindi, i mouse specifici di HBV Ag iPSC-CTL vengono trasferiti adottivamente, il che sopprime notevolmente la replicazione dell'HBV nel fegato e nel sangue e previene l'espressione Di HbV surface Ag negli epatociti. Questo metodo dimostra la replicazione HBV nei topi dopo l'iniezione idrodinamica e che i CTL virali specifici di Ag- delle cellule staminali possono sopprimere la replicaHBV. Questo protocollo fornisce un metodo utile per l'immunoterapia HBV.
Introduzione
A seguito di infezione acuta, il sistema immunitario adattivo (cioè l'immunità umorale e cellulare) controlla la maggior parte dell'epatite acuta correlata all'HBV. Tuttavia, un certo numero di persone nelle regioni HBV-endemiche non può eliminare i virus e successivamente convertirsi come individui cronici. Più del 25% dei pazienti cronici (>250 milioni di persone) in tutto il mondo sviluppa malattie epatiche progressive, con conseguente cirrosi epatica e/o carcinoma epatocellulare (HCC)1. Di conseguenza, l'eradicazione delle cellule infettate insistenza rimane un problema generale di salubrità, anche se esiste un vaccino2
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono approvati dal Texas A&M University Animal Care Committee (IACUC; #2018-0006) e sono condotti in conformità con le linee guida dell'Associazione per la valutazione e l'accreditamento della cura degli animali di laboratorio. I topi vengono utilizzati durante 6-9 settimane di età.
1. Generazione di cellule virali specifiche dell'ag8- T da iPSC (iPSC-CD8- cellule T)
- Creazione dei costrutti retrovirali
N.B.: I geni TCR e - sono collegati alla sequenza di auto-fessura 2A. Il vettore retrovirale MSCV-IRES-DsRed (MiDR) èDsRed 23.- ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Come mostrato qui, HBV virale Ag-specifico iPSC-CD8- le cellule T sono generate da un sistema di coltura in vitro. Dopo l'ACT di questi iPSC-CD8 virali specifici di Ag8- Le cellule T sopprimono sostanzialmente la replica HBV in un modello murino (File supplementare 1). Mouse iPSC sono tradotti con il costrutto retrovirale MIDR codificando un gene ibrido HBV TCR umano-mouse (HBs183-191-specific,s183), quindi gli iPSC trandotti dal gene sono co-coltivati con cellule OP9-DL1.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Questo protocollo presenta un metodo per generare gli iPSC-CTL virali specifici di Ag da utilizzare come ACT per sopprimere la replica HBV in un modello murino. Nell'infezione cronica da HBV, il genoma virale forma un mini cromosoma stabile, il DNA circolare covalentmente chiuso (cccDNA) che può persistere per tutta la durata della vita dell'epatocito. Mirare alla clearance del mini cromosoma virale può provocare una cura dell'infezione cronica da HBV. L'attuale terapia antivirale si rivolge alla trascrizione inversa del.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano il Dr. Adam J Gehring del Toronto General Hospital Research Institute per aver fornito cDNA per HBs183-91 (s183) (FLLTRILTI) - specifici geni TCR umano-murine con restrizioni A2, e il Dr. Pei-Jer Chen della National Taiwan University per aver fornito pAAV/HBV 1.2. Questo lavoro è supportato dal National Institute of Health Grant R01AI121180, R01CA221867 e R21AI109239 a J. S.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Topi HHD | Institut Pasteur, Parigi, Francia | H-2 classe I knockout, topi HLA-A2.1-transgenici (HHD) | |
| iPS-MEF-Ng-20D-17 | RIKEN Cell Bank | APS0001 | |
| SNL76/7 | ATCC | SCRC-1049 | |
| OP9 | ATCC | CRL-2749 | |
| pAAV/HBV1.2 plasmide | Dr. Dr. Pei-Jer Chen (National Taiwan University Hospital, Taiwan) | Costrutto del DNA dell'HBV | |
| Geni TCR specifici per HBs183-91(s183) (FLLTRILTI) | Dr. Adam J Gehring (Toronto General Hospital Research Institute, Toronto, Canada) | Geni TCR ibridi umano-murino ristretti A2-specifici per FLLTRILTI (V&alfa; 34 e Vβ 28) | |
| OVA257– 264-specifici Geni TCR | Dr. Dario A. Vignali (Università di Pittsburgh, PA) | Geni SIINFEKL-specifici H-2Kb-restricted TCR Anticorpo | |
| Anti-IFN-γ (XMG1.2) anticorpo | Biolegend | 505810 | |
| Anti-TNF-a (MP6-XT22) anticorpo | Biolegend | 506306 | |
| α-MEM | Invitrogen | A10490-01 | |
| Anticorpo anti-HBs | Thermo Fisher | MA5-13059 | |
| ACK Tampone di lisi | Lonza | 10-548E | |
| Brefeldin A Sigma | B7651 | ||
| DMEM | Invitrogen | ABCD1234 | |
| FBS | Hyclone | SH3007.01 | |
| FACSAria Selezionatore cellulare di fusione | BD | 656700 | |
| Gelatina | MilliporeSigma | G9391 | |
| GeneJammer | Agilent | 204130 | |
| HLA-A201-HBs183-91-PE pentamero | Proimmune | F027-4A - 27 | |
| HRP Anticorpo secondario anti-topo | Invitrogen | A27025 | |
| mFlt-3L | Peprotech | 250-31L | |
| mIL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| Nucleasi S7 | Roche | 10107921001 | |
| Paraformaldeide | MilliporeSigma | P6148-500G | Attenzione: allergenico, cancerogeno, tossico |
| Tampone di permeabilizzazione | Biolegend | 421002 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | 107689 | |
| ProLong™ Mountant antisbiadimento in oro con DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| QIAamp MinElute Kit di rotazione del virus | Qiagen | 57704 |
Riferimenti
- Scaglione, S. J., Lok, A. S. Effectiveness of hepatitis B treatment in clinical practice. Gastroenterology. 142 (6), 1360-1368 (2012).
- Osiowy, C. From infancy and beyond... ensuring a lifetime of hepatitis B virus (HBV) vaccine....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
Tag
Cellule T derivate da cellule staminalilinfociti T specifici per l antigene viralesoppressione della replicazione di HBVcellule T CD8 positive derivate da iPSCconsegna idrodinamica di plasmidi HBVanalisi citometrica a flussomarcatura immunofluorescentetrasferimento cellulare adottivotrasduzione del recettore delle cellule Tproduzione di interferone gamma
