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Articolo metodologico

Immunoterapia adottiva delle cellule iNKT in isomerasi indotta da glucosio (G6PI)

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DOI:

10.3791/60048

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31 gennaio 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Medical School of Hebei University, 2Key Laboratory of Pathogenesis Mechanism and Control of Inflammatory-Autoimmune Diseases in Hebei Province

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo utilizza peptidi misti G6PI per costruire modelli di artrite reumatoide che sono più vicini a quello dell'artrite reumatoide umana in CD4- cellule T e citochine. Cellule T killer naturali ad alta purezza (principalmente iNKT2) con fenotipi e funzioni specifiche sono state ottenute mediante induzione e purificazione in vitro per l'immunoterapia adottiva.

Abstract

L'artrite reumatoide (RA) è una malattia autoimmune infiammatoria cronica complessa. La patogenesi della malattia è correlata alle cellule T (iNKT) killer naturali invarianti. I pazienti con RA attiva presentano meno cellule iNKT, funzione cellulare difettosa e polarizzazione eccessiva di Th1. In questo studio, è stato stabilito un modello animale RA utilizzando una miscela di peptidi hGPI325-339 e hGPI469-483. Le cellule iNKT sono state ottenute mediante induzione e purificazione in vitro, seguite da infusione nei topi RA per immunoterapia adottiva. Il monitoraggio del sistema di imaging in vivo (IVIS) ha rivelato che le cellule iNKT sono state distribuite principalmente nella milza e nel fegato. Il giorno 12 dopo la terapia cellulare, la progressione della malattia ha rallentato in modo significativo, i sintomi clinici sono stati alleviati, l'abbondanza di cellule iNKT nel timo è aumentata, la proporzione di iNKT1 nel timo è diminuita e i livelli di TNF-z, IFN-e IL-6 in il siero è diminuito. L'immunoterapia adottiva delle cellule iNKT ha ripristinato l'equilibrio delle cellule immunitarie e corretto l'eccessiva infiammazione del corpo.

Introduzione

L'artrite reumatoide (RA) è una malattia autoimmune caratterizzata da invasività cronica e progressiva con incidenza dello 0,5-1%1,2. La patogenesi di fondo è attribuita alla proliferazione anomala di celluleCD4 autoattive e CD8, manifestata da un aumento della proporzione di celluleT cd4, IFN-eCD4, IL-17A, e al numero ridotto di cellule TCD4- IL-4e CD4- CD25 - FoxP3 . Pertanto, la secrezione di citochine infiammatorie è aumentata e una reazione infiammatoria eccessiva distrugge l'equilibrio nativo e la funzione di tolleranza del sistema immunitario del corpo. Inoltre, le cellule helper del linfocito T (Th) 1 che penetrano nell'articolazione aggravano la risposta infiammatoria e i danni articolari. Pertanto, l'inibizione dell'eccessiva risposta infiammatoria e il ripristino della tolleranza immunitaria e dell'equilibrio immunitario sono fondamentali per il trattamento dell'RA3,4.

Le celle iNKT hanno funzioni e caratteristiche sia della cellula NK che di cellule T. Le cellule iNKT ospitano una catena di z distinta e invarianti con repertori a catena TCRlimitati 5 e riconoscono l'antigene glicolipido presentato dalla principale molecola CD1d del complesso di istocompatibilità (MHC) sulla superficie delle cellule che presentano l'antigene. Mitsuo et al.6 ha rilevato un gran numero di cellule iNKT e difetti funzionali in molte malattie autoimmuni, tra cui ra. Aurore et al.7 ha dimostrato che le cellule iNKT hanno un effetto positivo sul mantenimento della tolleranza autoimmune e che quando il numero e la funzione delle cellule iNKT vengono ripristinate, la malattia viene alleviata. Inoltre, Miellot-Gafsou et al.8 ha scoperto che le cellule iNKT non solo abrogavano la malattia, ma aumentavano anche la progressione della malattia. Questi risultati contraddittori suggeriscono che le cellule iNKT sono cellule T eterogenee e la funzione di diversi sottoinsiemi può essere invertita. In uno studio clinico di RA, la frequenza delle cellule iNKT è correlata al punteggio dell'attività della malattia9. I risultati hanno anche confermato che la frequenza di iNKT è stata diminuita nei pazienti affetti da rappare, il numero di sottoinsiemi di cellule TCD4- IFN-z-s è aumentato, e i livelli secretorici di citochine infiammatorie IFN-e TNF-aumentati di10,11. Inoltre, Sharif et al.12 ha studiato il diabete di tipo 1 (T1D) e ha scoperto che l'infusione selettiva di cellule iNKT regolava l'espressione della citochina infiammatoria IL-4, manteneva la tolleranza immunitaria e impediva lo sviluppo del diabete di tipo 1. Pertanto, l'infusione adottiva di specifiche cellule iNKT o l'attivazione mirata di cellule iNKT aumenta il livello delle cellule iNKT nei pazienti affetti da RA, che può essere una svolta nel trattamento dell'AR.

L'immunoterapia cellulare è attualmente di grande interesse ed è stata ampiamente utilizzata nella terapia del cancro. Tuttavia, le cellule iNKT sono cellule immunoregolatorie rare ed eterogenee (solo lo 0,3% del numero totale di PBMC)13, il che limita le potenziali applicazioni cliniche. Queste cellule sono principalmente suddivise in tre sottopopolazioni: 1) cellule iNKT1, che hanno un'alta espressione di proteina leucemia promielocitica zinco-dita (PL-F) e fattore di trascrizione T-box (T-bet); 2) cellule iNKT2 con espressione intermedia della proteina legante PL-F e GATA 3 (GATA3); 3) cellule iNKT17 con bassa espressione di PL-F e recettore orfano legato ai retinoidi (ROR) - che secernono IFN-z, IL-4, e IL-1714. Le cellule iNKT attivate secernono Th1, Th2 e Th17-come citochine, che determinano i diversi effetti immunomodulatori delle cellule iNKT15. Gli effetti immunomodulatori e immunoterapeutici dell'attivazione specifica di varie sottopopolazioni di cellule iNKT sono diversi. Pertanto, la selezione di fenotipi specifici delle cellule iNKT (principalmente iNKT2) con funzioni antinfiammatorie per regolare la risposta immunitaria del corpo può correggere lo squilibrio immunitario e i disturbi immunitari nell'AR.

L'istituzione di un modello animale ideale è di grande importanza per il trattamento e lo studio della patogenesi ra. Attualmente, i modelli animali più comunemente utilizzati e maturi includono artrite indotta dal collagene, artrite adiuvante, artrite indotta da zymiosan e artrite indotta dal polisaccoro16–17. Tuttavia, non esiste un modello in grado di simulare completamente tutte le caratteristiche dell'AR umana. L'artrite indotta dal collagene di tipo II (CIA) è un modello classico di artrite. La CIA è indotta dall'immunizzazione dei topi con anticorpi monoclonali specifici del collagene di tipo II, che riflettono la dipendenza da anticorpi di questo modello di malattia. Benurs et al. ha descritto un modello con una risposta immunitaria sistemica all'isomerassia del glucosio-6-fosfato (G6PI), che induce la poliartrite simmetrica periferica nei ceppi di topo sensibili18,19. In questo modello, lo sviluppo dell'artrite dipende dalle cellule T, cellule B e dall'immunità innata18,19,20. Horikoshi21 ha scoperto che i modelli RA risultanti dall'immunizzazione dei topi DBA/1 con frammenti di polipeptide G6PI sono più simili all'AR umana in termini di CD4- cellule T e citochine (cioè IL-6 e TNF-z) rispetto ai modelli della CIA. Al fine di aumentare l'effetto stimolante sul sito di riconoscimento TCR, i frammenti misti di polipeptide di G6PI (hGPI325-339 e hGPI469-483) sono stati utilizzati per immunizzare i topi DBA/1 per costruire il modello murino RA. Il tasso di successo di questo approccio può essere elevato perché hGPI325-339 e hGPI469-483 sono immunodominanti per le risposte delle cellule T con restrizioni I-A q. Pertanto, questo modello può simulare la proliferazione di CD4- cellule T e difetti cellulari iNKT nei pazienti RA22. La ricerca di base dell'immunopatologia dell'AR ha gettato le basi per la nostra ulteriore indagine approfondita.

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Protocollo

Tutti i topi sperimentali (150 in totale) erano maschi sani di tipo DBA/1 topi, di 6-8 settimane (20,0 x 1,5 g), allevati in uno specifico ambiente privo di agenti patogeni (SPF). Non esiste un trattamento speciale prima della modellazione. L'esperimento è stato diviso in un gruppo di controllo sano (15 topi), un gruppo di controllo del modello (15 topi) e un gruppo di terapia cellulare (55 topi). Questo studio è stato approvato dall'Animal Welfare and Ethical Committee dell'Università di Hebei.

1. Costruzione del modello di malattia

  1. Duplicazione del modello animale RA
    1. Pesare 1,75 mg di entrambi hG6PI 325-339 e hG6PI 469-483 frammenti e scioglierli in 5,25 mL di 4 gradi centigradi di acqua distillata.
    2. Sciogliere l'adiuvante completo di Freund (CFA) in un bagno d'acqua a 50 gradi centigradi, disegnare 5,25 mL in un altro tubo centrifuga da 10 mL e raffreddarlo per l'uso.
    3. Mettere la miscela di soluzione hG6PI e soluzione CFA in un'unità di emulsione artificiale con due siringhe di vetro collegate.
    4. Spingere la siringa a una velocità costante e una frequenza di 10-20 volte al min per emulsionare completamente la soluzione mista di peptidi e la soluzione CFA. Eseguire l'operazione in un bagno di ghiaccio e conservare le goccioline di emulsione in acqua per 10 min dopo il completamento dell'emulsificazione senza disperdere.
    5. Iniettare 150 l di hG6Pi emulsionati nella radice di coda del mouse sottocutaneamente.
    6. Iniettare 200 mg di tossina pertosse nel topo intraperitonelmente a 0 h e 48 h dopo l'iniezione di hG6PI.
  2. Verifica sperimentale del modello RA
    1. Misurare lo spessore della zampa del mouse con una pinza Vernier (2 volte al giorno).
    2. Osservare e contrassegnare il grado di arrossamento e gonfiore del piede. Utilizzare i seguenti criteri di punteggio: 1) le ditiondate con gonfiore lieve; 2) dorsum pedis e foot pad con gonfiore rosso chiaro; 3) caviglia con gonfiore rosso.
    3. Eutanasia dei topi in anestesia profonda per iniezione intraperitoneale di 1% pentobarbital di sodio (50 mg/kg peso corporeo) 14 giorni dopo la modellazione e rimuovere le zampe per la colorazione HE.
    4. Determinare i livelli di secrezione del siero IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, TNF-z, e IFN-z utilizzando un saggio commerciale di perline citometriche (CBA) secondo il protocollo del produttore.

2. Ottenere cellule iNKT con terapia cellulare adottiva

  1. Induzione direzionale delle cellule iNKT
    1. Iniettare i topi normali intraperitamente con la z-GalCer (0,1 mg/kg di peso corporeo).
  2. Isolamento delle cellule iNKT
    1. Tre giorni dopo la modellazione, iniettare i topi intraperitonealmente con 1% pentobarbital di sodio (50 mg/kg di peso corporeo) per l'anestesizzazione. I topi adeguatamente anestesizzati non mostrano una risposta di ritiro della zampa posteriore a un pizzico di punta.
    2. Isolare la milza di un topo DBA/1 dopo averlo iniettato intraperitoneally con la z-GalCer. Preparare una sospensione a cella singola tagliando e macinando la milza in un setaccio a maglia 200.
    3. Lavare la sospensione cellulare con PBS, centrifugare a 200 x g per 5 min, e scartare il supernatante. Ripetere.
    4. Risospendere le cellule con 1 mL di soluzione di diluizione del sangue intero e dei tessuti. Aggiungere 3 mL di mezzo di separazione dei linfociti murini, quindi centrificare le cellule per 20 min a 300 x g a temperatura ambiente.
    5. Raccogliere lo strato di linfociti bianchi lattiginosi (cioè il secondo strato dall'alto), lavarlo 2x con PBS e contare con un contatore cellulare automatizzato.
  3. Strategia di selezione delle celle magnetiche attivate (MACS)positiva per la purificazione delle cellule iNKT
    NOTA: Per il pretrattamento dei tetrameri CD1d, 1 mg/mL di z-Galcer è stato diluito a 200 g/mL con lo 0,5% di Tween-20 e lo 0,9% di NaCl, e 5 l della soluzione risultante è stata aggiunta a 100 gradi l della soluzione tetramero CD1d. La miscela è stata incubata per 12 h a temperatura ambiente e posta a 4 gradi centigradi per l'uso. Il TCR è stato diluito 80 volte con acqua deionizzata. Tutti gli altri anticorpi sono stati utilizzati come soluzione di riserva.
    1. Risospendere 107 celle con 100 o L di 4 gradi centigradi PBS, aggiungere 10 L di CD1d Tetramer-PE caricato da z galCer e incubarle a 4 gradi centigradi per 15 min al buio.
    2. Lavare le celle 2x con PBS e sospenderle nuovamente in 80 gradi di PBS.
    3. Aggiungete 20 -L di anti-PE-MicroBeads e incubateli a 4 gradi centigradi per 20 min al buio.
    4. Lavarli 2x con PBS e risospendere le cellule con 500 .L di PBS.
    5. Posizionare la colonna di smistamento nel campo magnetico della selezionatrice MACS e risciacquare con 500 l- L di PBS.
    6. Aggiungere la sospensione della cella dal passaggio 2.3.4 alla colonna di ordinamento, raccogliere il flowthrough e risciacquare 3x con buffer PBS.
    7. Rimuovere il campo magnetico e raccogliere le celle dalla colonna di ordinamento. A questo punto, aggiungere 1 mL di buffer PBS alla colonna di ordinamento e spingere rapidamente lo stantuffo a una pressione costante per guidare le celle etichettate al tubo di raccolta e ottenere celle iNKT purificate. Contare con un contatore cellulare automatizzato.
  4. Identificazione del fenotipo della cellula iNKT
    1. Prendere 1 x 106 celle dai passi 2.2.5 e 2.3.7, rispettivamente, e rinvila di nuovo in 50 -L di PBS.
    2. Incubazione anticorpale: Non aggiungere l'anticorpo al tubo di controllo negativo, aggiungere 0,5 l di Tetramer z-GalCer-PE-CD1d o 10 -L di FITC-TCR - nel singolo tubo di controllo positivo. Aggiungete 0,5 di tetramero z-GalCer-PE-CD1d e 10 -L di FITC-TCR nel tubo campione. Incubarli a 4 gradi centigradi per 30 min al buio.
    3. Lavare le cellule in PBS e quindi centrifugare a 200 x g per 5 min.
    4. Scartare il supernatante, aggiungere 1 mL di Foxp3 Foxation/Permeabilization working solution, e incubare le cellule per 45 min a 4 gradi centigradi al buio.
    5. Aggiungere 1 mL di 1x Soluzione di lavoro permeabilizzazione Buffer e centrifugare le cellule a temperatura ambiente per 500 x g a temperatura ambiente per 5 min.
    6. Scartare il super-attardato. Aggiungete 1 l di Alexa Fluor 647 mouse Anti-PL-F e 1 L di PerCP-Cy 5.5 mouse anti-T-bet (o 1 L di PerCP-Cy 5.5 mouse anti-ROR)) per 30 min a temperatura ambiente al buio.
    7. Aggiungere a 2 mL di Permeabilization Buffer soluzione di lavoro per la pulizia.
    8. Scartare il supernatante, sospendere nuovamente le cellule in 500 - L di PBS e misurare per citometria di flusso.
  5. Identificazione funzionale delle cellule iNKT
    1. Prendere 3 x 106 celle iNKT dal passo 2.3.7 e risospende in 12 piastre ben con 1,5 mL di RPMI-1640 mezzo incompleto (cioè, senza siero).
    2. Aggiungere phorbol ester (PMA, 50 ng/mL) e calcio ionomycin (IO, 1 g/mL) e mettere in un'incubatrice di CO2 per 24 h.
    3. Raccogliere il supernatante cellulare e rilevare i livelli di secrezione di IL-2, IL-17A, TNF-z, IL-6, IL-4, IFN-e IL-10 utilizzando un saggio CBA commerciale secondo il protocollo del produttore.
  6. Studio sperimentale sul percorso di migrazione delle cellule iNKT nei topi RA
    1. Sciogliere il tinrito DiR (2,5 mg/mL) in DMSO.
    2. Risospendere le cellule iNKT in 6 piastre di pozzo con RPMI-1640 mezzo incompleto. La densità è di 1 x 106 celle/mL.
    3. Aggiungere la soluzione DiR (5 g/mL) e incubare in un'incubatrice di CO2 per 25 min.
    4. Lavare con PBS e risospendere nuovamente le celle (3 x 106/300 ) per ottenere celle iNKT con etichetta DiR (DiR-iNKT).
    5. Iniettare 1% pentobarbital di sodio (50 mg/kg di peso corporeo) intraperitinalmente per anestizzare i topi. I topi adeguatamente anestesizzati non mostrano un ritiro della zampa posteriore al pizzico. Applicare unguento veterinario agli occhi del mouse per evitare la secchezza durante l'anestesia per l'imaging.
    6. Iniettare le cellule DiR-iNKT 3 x 106 per mouse nella vena posteriore con il modello RA per 8 giorni. Monitorare le cellule iNKT nei topi dopo l'iniezione per 0 min, 10 min, 30 min, 60 min, e giorno 0 (dopo 3 h), 1, 3, 6, 12, 26, 34, 38, e 42 giorni utilizzando un piccolo animale in vivo sistema di imaging (IVIS). La lunghezza d'onda di eccitazione utilizzata era di 748 nm, la lunghezza d'onda di emissione di 780 nm e il tempo di esposizione era automatico.
    7. Posizionare ogni topo in una gabbia separata dopo ogni osservazione e mantenere la recumbency sternale. Osservare fino al recupero dall'anestesia.

3. Valutazione dell'immunoterapia adottiva dei topi RA con cellule iNKT

  1. immunoterapia adottiva cellulare iNKT per topi RA
    1. Iniettare 3 x 106 cellule cellule iNKT cellule per mouse attraverso la vena posteriore. Selezionare casualmente 15 topi che sono stati modellati 8 giorni prima e ottenere cellule iNKT senza etichettatura DiR dal passo 2.3.7 dall'infusione della vena della coda.
  2. Valutare l'efficacia dell'immunoterapia adottiva per le cellule iNKT.
    1. Misurare lo spessore della zampa del topo, quantificare il gonfiore dell'articolazione della caviglia e ottenere sistematicamente il punteggio dopo l'infusione di cellule iNKT come descritto nei passaggi 1.2.1–1.2.2.
    2. Osservare l'infiltrazione infiammatoria delle cellule e i cambiamenti articolari delle articolazioni del topo come descritto nel passaggio 1.2.3.
    3. Determinare i livelli di secrezione di IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, TNF-z, e IFN-z-4 come descritto nel passaggio 1.2.4.
  3. Determinare la frequenza delle celle e dei sottoinsiemi iNKT.
    1. Isolare il timo del topo e preparare una singola sospensione cellulare.
    2. Separare i linfociti con il liquido di separazione dei linfociti.
    3. Determinare la frequenza delle celle iNKT e la frequenza del sottogruppo come descritto nel passaggio 2.4.
  4. Analisi statistica
    NOTA: Tutti i dati sono presentati come media : i valori SD. di P < 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi.
    1. Utilizzare l'analisi a un fattore della varianza (ANOVA). Se la varianza è soddisfatta, utilizzare il test LSD per un ulteriore confronto.
    2. Se la varianza non è uniforme, utilizzare il test non parametrico. Utilizzare il test Kruskal-Wallis H per un ulteriore confronto31.

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Risultati

Il punteggio dell'indice di artrite e lo spessore della zampa sono aumentati dopo la modellazione. Rispetto al gruppo di controllo, le dite del gruppo di modelli RA hanno cominciato a mostrare gonfiore rosso a 6 giorni dopo la modellazione, con graduale aggravamento. A 14 giorni, il gonfiore rosso nell'articolazione della caviglia ha raggiunto il picco, seguito da un graduale sollievo. Lo spessore della zampa è cambiato in modo analogo (P < 0,05) (Figura 1).

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Discussione

Le cellule iNKT sono cellule T speciali che colmano l'immunità innata e adattiva e sono sviluppate principalmente a partire daCD4/CD8e timociti. Le cellule iNKT hanno diverse funzioni immunoregolatorie e interagiscono con altre cellule immunitarie per contatto diretto e secrezione di diverse citochine23, che interessano le cellule dendritiche (DC), macrofagi, neutrofili, cellule B, cellule T e differenziazione e sviluppo delle cellule NK

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Dichiarazioni

Gli autori non dichiarano alcun finanziamento o conflitto di interesse.

Ringraziamenti

Il nostro studio è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (NSFC) (81771755), Colleges e progetto di ricerca chiave di scienza e tecnologia dell'università della provincia di Hebei (D2017009) e l'Animal Lab del Medical Experiment Center, Hebei University. Siamo grati per il loro sostegno.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Alexa Fluor 647 Mouse Anti-PLZFBD563490
America Anti-PE MicroBeadsMiltenyi130-048-801Germania
ColonneMiltenyiMSGermania
Centrifuga criogenicaBeckmanAllegra X-15RAmerica
DiRThermo Fisher ScientificD12731
America Embedding CenterTianjin Aviation Electromechanical Co., Ltd.BMJ-1Cina
FITC Criceto Anti-Topo TCR & beta; CatenaBD553170America
Citometro a flussoBDAccuri C6America
Freund's adiuvante completoSigmaF5881America
hGPI325-339 (IWYINCFGCETHAML)Karebay Biochem18062202Cina
hGPI469-483 (EGNRPTNSIVFTKLT)Karebay Biochem18062203Cina
In Vivo Imaging SystemPerkinElmercalibro IVIS lumina II
America Ionomicina CalcioCayman10004974America
KRN7000AdipoGenAG-CN2-0013America
Mouse CD1d Tetramer-PEMBLTS-MCD-1Giappone
Mouse percollSolarbioP8620Cina
Microscopio otticoOlympusOlympus-IIGiappone
PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-ROR-ϒ tBD562683America
PerCP-CyTM5.5 Topo anti-T-betBD561316America
Tossina pertosseSigmaP7208America
esteri del forboloCayman10008014America
Tampone di lisi dei globuli rossiBD555899America
RPMI-1640Biological Industries01-100-1ACSIsraele
Kit citochine Th1/Th2/Th17BD560485America
UltramicrotomoLeicaEM UC6Germania

Riferimenti

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