Le pompe di efflusso xenobiotico sono altamente attive nelle cellule staminali esemiche e progenitrici (HSPC) e causano l'estrusione di TMRM, una membrana mitocondriale potenziale disfunzione fluorescente. Qui, presentiamo un protocollo per misurare con precisione il potenziale della membrana mitocondriale negli HSPC da TMRM in presenza di Verapamil, un inibitore della pompa di efflusso.
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Articolo metodologico
Migliorare l'accuratezza del flusso Valutazione citometrica del potenziale della membrana mitocondriale nelle cellule staminali ematopoietiche e progenitrici attraverso l'inibizione delle pompe di efflusso
In questo articolo
Sommario
Abstract
Poiché il metabolismo cellulare è un regolatore chiave dell'autorinnovamento delle cellule staminali ematopoietiche (HSC), i vari ruoli svolti dai mitocondri nell'omeostasi ematopoietica sono stati ampiamente studiati dai ricercatori dell'HSC. I livelli di attività mitocondriale si riflettono nei loro potenziali della membrana, che possono essere misurati da coloranti cationici per meant delle cellule come TMRM (tetramethylrhodamine, ester metilico). La capacità di pompe di efflusso di estrudere questi coloranti dalle cellule può limitare la loro utilità, tuttavia. La distorsione di misurazione risultante è particolarmente critica nella valutazione degli HSC, poiché i trasportatori xenobiotici presentano livelli di espressione e attività più elevati nelle HSC rispetto alle cellule differenziate. Qui, descriviamo un protocollo che utilizza Verapamil, un inibitore della pompa di efflusso, per misurare con precisione la z -m in più popolazioni di midollo osseo. L'inibizione risultante dell'attività della pompa è indicato per aumentare l'intensità TMRM nelle cellule staminali ematopoietiche e progenitrici (HPC), lasciandolo relativamente invariato in frazioni mature. Ciò evidenzia la particolare attenzione all'attività di tinge-efflux che è necessaria quando si utilizzano coloranti dipendenti da zm, e come scritto e visualizzato, questo protocollo può essere utilizzato per confrontare con precisione diverse popolazioni all'interno del midollo osseo, o la stessa popolazione diversi modelli sperimentali.
Introduzione
Le cellule staminali ematopoietiche (HSC) sono auto-rinnovanti, multi-potenti e in grado di dare origine a tutte le cellule del sangue1,2. Il metabolismo cellulare è un regolatore chiave della manutenzione HSC, insieme a fattori trascrizionali, segnali intrinseci e il microambiente3,4,5. Il corretto controllo della funzione mitocondriale e della qualità è quindi fondamentale per la manutenzione HSC6,7.
Il potenziale della membrana m....
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Protocollo
Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Albert Einstein College of Medicine.
1. Preparazione delle soluzioni
- Coloring Buffer (PBS) con buffer di fosfato - siero bovino fetale (FBS) del 2%: aggiungere 10 mL di FBS in 500 mL di una soluzione PBS sterile.
NOT: Questa soluzione può essere conservata a 4 gradi centigradi per almeno un mese in condizioni sterili. Prima di iniziare le seguenti procedure, mettere una di questa soluzione (50 mL) sul ghiaccio. - Cuscinetto liscivia ACK (cloruro-potassio-potassio): mettere una macchia ....
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Risultati
Il protocollo descritto in precedenza consente di semplificare l'isolamento dei BM-MNC da un modello di mouse. La figura 1 riassume i passaggi principali del protocollo: isolamento osseo, fuoriscono dal midollo osseo, lisi dei globuli rossi e colorazione degli anticorpi seguita dalla colorazione TMRM per misurare il potenziale della membrana mitocondriale in una popolazione ematopoietica specifica .
BM-MNC contengono diverse popolazioni di cellule, tra cui HSC. I .......
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Discussione
La misurazione potenziale della membrana mitocondriale è una pietra angolare dell'analisi e della valutazione dei mitocondri, che sono fondamentali per lo stato metabolico della cellula. In questo caso, descriviamo un protocollo per l'analisi della colorazione TMRM. TMRM è un colorante fluorescente per meant cellulare che si accumula nei mitocondri attivi a causa di m, e i suoi rispettivi livelli rimangono in equilibrio tra i compartimenti extracellulari, citoplasma e mitocondriali10. Questo proto.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano tutti i membri del laboratorio Ito, in particolare K Ito e H Sato, e l'Einstein Stem Cell Institute per i commenti e le strutture centrali di Einstein Flow Cytometry and Analytical Imaging (finanziate dalla sovvenzione P30 CA013330 del National Cancer Institute) per contribuire a condurre gli esperimenti. K.I. è supportato da sovvenzioni del National Institutes of Health (R01DK98263, R01DK115577 e R01DK100689) e del Dipartimento della Salute dello Stato di New York come direttore centrale di Einstein Single-Cell Genomics/Epigenomics (C029154). K.I. Ito è uno studioso di ricerca della Leucemia e della Lymphoma Society.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| tampone di lisi ACK | Life Technologies | A1049201 | |
| B220-biotina | BD Bioscience | 553086 | |
| CD3e-biotina | Life Technologies | 13-0031-85 | |
| CD4-biotina | Fischer Scientific | BDB553782 | |
| CD8-biotina | Life Technologies | 13-0081-85 | |
| CD11b-biotina | BD Bioscience | 553309 | |
| CD19-biotina | BD Bioscience | 553784 | |
| CD34-FITC | eBioscience | 11-0341-85 | |
| CD48-APC | eBioscience | 17-0481-82 | |
| CD135-biotina | eBioscience | 13-1351-82 | |
| CD150-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 115922 | |
| c-kit-APC/Cy7 | Biolegend | 105826 | |
| Ciclosporina H | Millipore Sigma | SML1575-1MG | |
| Soluzione DAPI (1 mg/mL) | Life Technologies | 62248 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Denville | FB5001-H | |
| FCCP | Millipore Sigma | C2920-10MG | |
| Gr1-biotina | Biolegend | 108404 | |
| IgM-biotina | Life Technologies | 13-5790-85 | |
| Il7R&alfa;-biotina | eBioscience | 13-1271-85 | |
| Nk1.1-biotina | Fischer Scientific | BDB553163 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Life Technologies | 10010023 | |
| Sca-1-PE/Cy7 | eBioscience | 25-5981-81 | |
| SCF murino | PEPROTECH | 250-03-10UG | |
| StemSpan SFEM medium | STEMCELL technologies | 9605 | |
| Streptavidina-Blu Pacifico | eBioscience | 48-4317-82 | |
| Ter119-biotina | Fischer Scientific | BDB553672 | |
| TMRM | Millipore Sigma | T5428-25MG | |
| TPO | PEPROTECH | 315-14-10UG | |
| Verapamil cloridrato | Millipore Sigma | V4629-1G |
Riferimenti
- Weissman, I. L., Anderson, D. J., Gage, F. Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 387-403 (2001).
- Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J.
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Ristampe e permessi
