Presentato qui è un metodo di elettroporazione per la consegna di DNA plasmide e l'etichettatura delle cellule ependymoglial nel telecefalo di pesce zebra adulto. Questo protocollo è un metodo rapido ed efficiente per visualizzare e tracciare singole cellule ependymoglial e apre nuove possibilità di applicare l'elettroporazione a un'ampia gamma di manipolazioni genetiche.
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Articolo metodologico
Metodo di elettroporazione per in vivo Consegna del DNA plasmide nel Telencephalon del pesce zebra adulto
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'elettroporazione è un metodo di trasfezione in cui un campo elettrico viene applicato alle cellule per creare pori temporanei in una membrana cellulare e aumentarne la permeabilità, consentendo così l'introduzione di diverse molecole nella cellula. In questo documento, l'elettroporazione viene utilizzata per introdurre il plasmidia alle cellule ependymoglial, che allineano la zona ventricolare del telencephalon del pesce zebra adulto. Una frazione di queste cellule mostra le proprietà delle cellule staminali e genera nuovi neuroni nel cervello del pesce zebra; Pertanto, studiare il loro comportamento è essenziale per determinare i loro ruoli nella neurogenesi e rigenerazione. L'introduzione di plasmidi tramite elettroporazione consente l'etichettatura e il tracciamento a lungo termine di una singola cellula ependymoglial. Inoltre, plasmidi come Cre ricombinase o Cas9 possono essere consegnati a singole cellule ependymoglial, il che consente la ricombinazione genica o l'editing genico e fornisce un'opportunità unica per valutare la funzione genica autonoma della cellula in un l'ambiente. Infine, questo protocollo dettagliato di elettroporazione passo-passo viene utilizzato per ottenere l'introduzione di successo di plasmidi in un gran numero di singole cellule ependymoglial.
Introduzione
I pesci zebra sono eccellenti modelli animali per esaminare la rigenerazione cerebrale dopo una lesione da taglio. Rispetto ai mammiferi, sulla scala evolutiva, le specie meno evolute come il pesce zebra mostrano generalmente tassi più elevati di neurogenesi costitutiva e aree più ampie di residenza delle cellule staminali neurali adulte, portando a una generazione costante di nuovi neuroni in tutto la maggior parte delle aree cerebrali nella vita adulta. Questa caratteristica sembra correlare con una capacità rigenerativa significativamente più elevata del pesce zebra rispetto ai mammiferi1, poiché i pesci zebra hanno un notevole potenziale pe....
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Protocollo
Tutti gli animali utilizzati in questo protocollo sono stati tenuti in condizioni di allevamento standard, e gli esperimenti sono stati effettuati secondo le linee guida e i regolamenti di gestione dell'UE e del governo della Baviera superiore (Az 55.2-1-54-2532-0916).
1. Preparazione della miscela di plasmide per l'elettroporazione
- Diluire il plasmide di interesse per l'acqua sterile e aggiungere veloce soluzione di scorta di macchie verdi [1 mg/mL]. Assicurarsi che la concentrazione finale del plasmipro sia di 1 g/l. Aggiungere la macchia ad una concentrazione non superiore al 3%, poiché il suo unico scopo è colorare la soluzion....
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Risultati
Il metodo di elettroporazione descritto consente la consegna di DNA plasmide in cellule ependymogliali, che si trovano superficialmente nel telecefalo del pesce zebra e appena sotto lo strato cellulare ependymal dorsale (Figura 1A).
Se il risultato dell'elettroporazione è positivo, è possibile osservare le singole celle ependymoglial (cellule rosse nella figura 2A,B) tra le altre ce.......
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Discussione
Questo protocollo di elettroporazione è un metodo affidabile in vivo per etichettare le singole cellule ependymoglial. Il protocollo potrebbe essere necessario un ulteriore adattamento per etichettare altri tipi di cellule come neuroni o oligodendrociti. Per ottenere un'etichettatura di successo, è possibile utilizzare plasmidi contenenti diversi promotori. Pollo-beta actin promotore, eF1alpha, CMV e promotore di ubiquitina sono stati precedentemente utilizzati per guidare l'espressione di diversi transgeni in ependymogl.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Un ringraziamento speciale a James Copti per la modifica del manoscritto. Ringraziamo anche i finanziamenti a JN della Fondazione tedesca per la ricerca (DFG) da parte dell'SFB 870 e dell'SPP "Integrative Analysis of Olfaction" e SPP 1738 "Ruoli emergenti di RNA non codificanti nello sviluppo di sistemi nervosi, plasticità e malattie", SPP1757 " L'eterogeneità gliale", e la strategia di eccellenza nell'ambito del Cluster di Monaco per la Neurologia dei Sistemi (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagent/Material | |||
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258-25G | Per la colorazione della soluzione plasmidica |
| MS222 | Sigma-Aldrich | A5040-25G | MS222 deve essere conservato in RT (fino a due settimane) e protetto dalla luce |
| Gel per ultrasuoni | SignaGel, Parker laboratories INC. | 15-60 | Elettrodo Gel |
| Attrezzatura | |||
| Pompa ad aria | TetraTec APS 50, 10l-60l | Può essere acquistato nei negozi di animali | |
| BTX Pinzetta Tweezertrodes Elettrodi | Platino Pinzetta, BTX Harvard Apparatus | 45-0486 | |
| Dispositivo di elettroporazione | BTX ECM830 Sistema di elettroporazione a onda quadra, BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | |
| Dispositivo di iniezione | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | |
| Capillare in vetro borosillicato a parete standard | Warner Instruments | 64-0766 | Modello: G100-4 |
| Punte per microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micro-coltello | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Micromanipolatore | a joystickNarishige Japan | MN - 151 | |
| Porta aghi | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | Il supporto per aghi viene fornito con il dispositivo di iniezione |
| Dispositivo di estrazione dell'ago | Narishige Japan | Modello: PC-10 | Il PC-10 è stato interrotto da Narishige nel 2017 e sostituito dalle |
| piastre di Petri | Greiner Bio-One International | 633161 |
Riferimenti
- Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).
- Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J.
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Ristampe e permessi
