Tecniche di spettrometria ione Mobilità-Massa per determinare la struttura e i meccanismi del riconoscimento degli ioni metallici e dell'attività di redox degli oligopeptidi di metal linciazione

Summary

La spettrometria di massa io-masse ionica e le tecniche di modellazione molecolare possono caratterizzare le prestazioni selettive di chelatura metallica di peptidi progettati e la metanobattina peptide legante al rame. Lo sviluppo di nuove classi di peptidi chelanti metallici contribuirà a portare alle terapie per le malattie associate allo squilibrio degli ioni metallici.

Abstract

La ionizzazione elettrospray (ESI) può trasferire un peptide a queous-fase o complesso di peptidi alla fase gassosa conservando la sua massa, carica complessiva, interazioni di legame metallico, e forma conformante. L'accoppiamento dell'ESI con la spettrometria di massa iosataria (IM-MS) fornisce una tecnica strumentale che consente di misurazione simultanea della massa di carico (m/z) di un peptide e della sezione trasversale di collisione (CCS) che si riferiscono alla sua stoichiometria, allo stato di e forma conformazionale. La carica complessiva di un complesso di peptidi è controllata dalla protonazione di 1) siti acidi e di base del peptide e 2) lo stato di ossidazione degli ioni metallici. Pertanto, lo stato di carica generale di un complesso è una funzione del pH della soluzione che influisce sull'affinità di legame ios metallico peptidi. Per le analisi ESI-IM-MS, le soluzioni per gli ioni di peptidi e metalli sono preparate da soluzioni acquose, con il pH regolato con acido acetico diluito aqueso o idrossido di ammonio. Ciò consente di determinare la dipendenza da pH e la selettività degli ioni metallici per un peptide specifico. Inoltre, l'm/z e il CCS di un complesso di peptidi possono essere utilizzati con la modellazione molecolare B3LYP/LanL2D per discernere i siti di legame del coordinamento degli ioni metallici e della struttura terziaria del complesso. I risultati mostrano come ESI-IM-MS possa caratterizzare le prestazioni di chelating selettivo di una serie di peptidi alternativi di metanobatteriteina e confrontarli con la metanobattina peptide legante in rame.

Introduction

Gli ioni di rame e zinco sono essenziali per gli organismi viventi e cruciali per i processi tra cui la protezione ossidativa, la crescita dei tessuti, la respirazione, il colesterolo, il metabolismo del glucosio e la lettura del genoma¹. Per abilitare queste funzioni, gruppi come il tiolati di Cys, imidazole del Suo^2,3, (più raramente) thioether di methionina, e carboxylate di Glu e Asp incorporano selettivamente i metalli come cofattori nei siti attivi di enzimi in metallo. La somiglianza di questi gruppi di coordinamento solleva una domanda intrigante riguardo al modo in cui i ligand....

Protocol

1. Preparazione dei reagenti

1. Cultura Methylosinus trichosporium OB3b, isolare il Mb-OB3b senza Cu(I)^18,22,23, congelare il campione e conservare a -80 gradi centigradi fino all'uso.
2. Sintetizzare i peptidi dell'amb (>98% purezza per amb₁, amb₂, amb₄; >70% purezza per amb₇), liofilizzare i campioni, e conservarli a -80 gradi centigradi fino all'uso.
3. Acquisto >98% di colcalo di purezza(II), cloruro di cobalto (II), cloruro nickle(II), cloruro di rame(II), nitrato di rame(II), nitrato d'argento(II)....

Results

Rilegatura metallica di amb₁
Lo studio IM-MS²⁰ di amb₁ (Figura 1A) ha mostrato che sia gli ioni di rame che quelli di zinco sono legati all'amb₁ in modo dipendente dal pH (Figura 2). Tuttavia, rame e zinco legati all'amb₁ attraverso diversi meccanismi di reazione in diversi siti di coordinamento. Ad esempio, l'aggiunta di Cu(II) all'amb₁ ha provoca.......

Discussion

Passaggi critici: conservazione dei comportamenti della fase della soluzione per l'esame tramite ESI-IM-MS
Devono essere utilizzate impostazioni strumentali ESI native che conservino la stoichiometria dei peptidi, lo stato di carica e la struttura conformazionale. Per le condizioni native, le condizioni nella sorgente ESI, come le tensioni del cono, le temperature e i flussi di gas, devono essere ottimizzate. Inoltre, le pressioni e le tensioni nella sorgente, nella trappola, nella mobilità degli ioni.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
acetonitrile HPLC idrossido	Fisher Scientific (www.Fishersci.com)	A998SK-4
(grado in tracce)	Fisher Scientific (www.Fishersci.com)	A512-P500
cloruro di cobalto (II) esaidrato 99,99%	Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)	255599-5G
cloruro di rame (II) 99,999%	Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)	203149-10G
nitrato di rame(II) idrato 99,99%	Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)	229636-5G
ha progettato i peptidi amb1,2,3,4,5,6,7 I peptidi	da Neo BioLab (neobiolab.com)		sono stati sintetizzati su ordinazione i peptidi
AMB5B,C,D,E,F	PepmicCo (www.pepmic.com)		sono stati sintetizzati su ordinazione
Driftscope 2.1 programma software	Waters (www.waters.com)		programma di analisi
software Liofilizzato, purificato, privo di Cu(I)-mb-OB3b			coltivato e isolato nel laboratorio del Dr. DongWon Choi (Dipartimento di Biologia, Texas A& M-Commerce)
acido acetico glaciale (grado Optima)	Fisher Scientific (www.Fishersci.com)	A465-250
Cloruro di ferro (III) anidro 98%+	Alfa Aesar (www.alfa.com)	12357-09
nitrato di piombo (II) grado ACS Avantor	(www.avantormaterials.com)	128545-50G
cloruro di manganese (II) tetraidrato 99,99%	Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)	203734-5G
MassLynx 4.1	Waters (www.waters.com)programma		di analisi software
cloruro di nichel esaidrato 99,99%	Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)	203866-5G
poli-DL-alanina	Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)	P9003-25MG
nitrato d'argento 99,9%+	Alfa Aesar (www.alfa.com)	11414-06
Waters Synapt G1 HDMS	Waters (www.waters.com)quadrupolo		- mobilità ionica - spettrometro di massa a tempo di volo
cloruro di zinco anidro	Alfa Aesar (www.alfa.com)	A16281