ImmunoglobulinG (IgG) N-glican è caratterizzato utilizzando l'interazione idrofila cromatografica UPLC. Inoltre, la struttura di IgG N-glycan è chiaramente separata. Presentato qui è un'introduzione a questo metodo sperimentale in modo che possa essere ampiamente utilizzato nelle impostazioni di ricerca.
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Articolo metodologico
Immunoglobulin G N-Glycan Analisi di Ultra-Performance Liquid Chromatoography
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il glicomics è una nuova sottospecializzazione nella ricerca sul sistema omico che offre un potenziale significativo nella scoperta di biomarcatori di nuova generazione per la suscettibilità alle malattie, la scoperta di bersagli farmacologici e la medicina di precisione. I iggini alternativi IgG Nsono stati riportati in diverse malattie croniche comuni e hanno suggerito di avere un grande potenziale nelle applicazioni cliniche (ad esempio, biomarcatori per la diagnosi e la previsione delle malattie). IgG N-glicani sono ampiamente caratterizzati utilizzando il metodo di cromatografia di interazione idrofila (HILIC) cromatografia liquida ad altissima prestazione (UPLC). UPLC è una tecnologia di rilevamento stabile con una buona riproducibilità e un'elevata precisione quantitativa relativa. Inoltre, la struttura di IgG N-glycan è chiaramente separata, e la composizione glicana e l'abbondanza relativa nel plasma sono caratterizzati.
Introduzione
N-glicosilazione delle proteine umane è una modifica post-traduzionale comune ed essenziale1 e può aiutare a prevedere l'insorgenza e lo sviluppo di malattie in modo relativamente accurato. A causa della complessità della sua struttura, si prevede che ci siano più di 5.000 strutture glicane, fornendo un grande potenziale come biomarcatori diagnostici e predittivi per le malattie2. N-glicani attaccati all'immunoglobulina G (IgG) hanno dimostrato di essere essenziali per la funzione di IgG, e IgG N-glycosylation partecipa all'equilibrio tra i sistemi pro e antinfiammatori3....
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Protocollo
Tutti i soggetti inclusi nel protocollo sono stati approvati dal Comitato Etico della Capital Medical University, Pechino, Cina12. Il consenso informato scritto è stato ottenuto da ogni materia all'inizio dello studio.
1. Isolamento IgG
- Preparare le sostanze chimiche, tra cui il buffer di legatura (fosfato buffer saline, PBS): 1x PBS (pH - 7,4), neutralizzazione del buffer: 10x PBS (pH - 6,6-6,8), eluente: 0,1 M di acido formica (pH - 2,5), soluzione neutralizzante per eluente: 1 M di bicarbonato di ammonio, memorizzato nel buffer: 20% etanolo - 20 mM Tris - 0,1 M NaCl (pH - 7,4), soluzione di pulizia per l....
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Risultati
Come illustrato nella Figura 1, IgG N-glicani sono stati analizzati in 24 picchi iniziali di glicani (GP) in base alla posizione di picco e al tempo di ritenzione. Le strutture N-glicani sono disponibili attraverso il rilevamento della spettrometria di massa secondo uno studio precedente (Tabella 1)15. Per garantire che i risultati fossero comparabili, è stata applicata la normalizzazione totale dell'.......
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Discussione
UPLC funge da metodo di analisi quantitativa relativa5,15. I risultati indicano che UPLC è una tecnologia di rilevamento stabile con una buona riproducibilità e relativa precisione quantitativa. La quantità di glicani in ogni picco è espressa come percentuale dell'area totale integrata utilizzando UPLC, che è il valore relativo. La quantificazione relativa migliora la comparabilità dei campioni di prova. Inoltre, 96 piastre g di proteine sono utilizzate per purif.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dalla National Natural Science Foundation of China (81673247 & 81872682) e dalla australiana-Cina Collaborative Grant (NH & MRC - APP11112767 -NSFC 81561128020).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2-amminobenzamide, 2-AB | Sigma, Cina | ||
| Piastra di raccolta a 96 pozzetti | AXYGEN | ||
| Piastra filtrante a 96 pozzetti | Pol | 0,45 um GHP | |
| Separazioni | |||
| Rotore a piastra a 96 pozzetti | Eppendorf Co., Ltd, Germania | T_1087461900 | |
| Acido acetico | Sigma, Cina | ||
| Acetonitrile | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, Cina | ||
| Bicarbonato di ammonio | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Cina | ||
| Formiato di ammonio | Beijing Minruida Technology Co., Ltd. | ||
| Incubatore/bilanciere a scuotimento costante | Zhicheng strumento analitico manufacturing co., Ltd, Cina | ZWY-10313 | |
| Scala di calibrazione destrano/colonna glicopeptidica | Watts technology Co., Ltd, Cina | Colonna | |
| Dimetil solfossido (DMSO) | Sigma, Cina | ||
| Fosfato disodico | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Cina | ||
| Forni elettrici | Tester instruments Co., Ltd | 202-2AB | |
| Empower 3.0 | Waters technology Co., Ltd, America | ||
| Ethanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, Cina | ||
| Acido formico | Sigma, Cina | ||
| GlycoProfile 2-AB Kit di etichettatura | Sigma, Cina | ||
| HCl | Junrui Biotechnology Co., Ltd, Cina | ||
| Centrifuga ad alta velocità | Eppendorf Co., Ltd, Germania | 5430 | |
| Igepal | Sigma, Cina | ||
| Centrifuga a bassa temperatura | Eppendorf Co., Ltd, Germania | ||
| Frigorifero a bassa temperatura | Qingdao Haier Co., Ltd | ||
| Collettore a 96 pozzetti per piastre | Tecnologia Watt Co., Ltd, Cina | 186001831 | |
| metanolo | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, Cina | ||
| Milli-Q contatore di acqua pura | Millipore Co., Ltd, America | Advantage A10 | |
| NaOH | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Cina | ||
| PH tester | Sartorius Co., Ltd, Germania | PB-10 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato, PBS | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Cina | ||
| Pipetta | Eppendorf Co., Ltd, Germania | 4672100, 0,5-10 & mu; l & 10-100μ l & 20-200μ l & 1000μ | |
| PNGasi F enzima | Sigma, Cina | ||
| Potassio diidrogeno fosfato | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Cina | ||
| Propan-2-olo | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, Cina | ||
| SDS | Sigma, Cina | ||
| Cloruro di sodio | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Cina | ||
| Cianoboroidruro di sodio (NaBH3CN) | Sigma, Cina | ||
| Spettrofotometro | Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd | B-500 | |
| Pistola liquida di trasferimento | Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, Cina | 4672100 | |
| Tris | Amresco, America | ||
| Frigorifero a bassissima temperatura | Thermo Co., Ltd, America | MLT-1386-3-V; MDF-382E | |
| Cromatografia liquida ad alte prestazioni | Watts technology Co., Ltd, Cina | Acquity MLtraPerformance LC | |
| Vacuum Pump | Watts technology Co., Ltd, Cina | 725000604 | |
| Volatilizzatore / Essiccatore | Eppendorf Co., Ltd, Germania | T_1087461900 | |
| Vortex | Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, Cina | NP-30S | |
| Tester a bagno d'acqua | strumenti Co., Ltd | DK-98-IIA | |
| Bilancia | Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd. | MP200B |
Riferimenti
- Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214(2012).
- Cummings, R., Pierce, J. M. The Challenge and Promise of Glycomics. Chemistry Biology. 21 (1), (2014).
- Shade, K. T.....
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Ristampe e permessi
Tag
Analisi dei glicani N-legati delle IgGcromatografia a interazione idrofilaanalisi della composizione dei glicanipiastra monolitica con Proteina Genzima endoglicosidasi Fmarcatura con 2-aminobenzimidazolocalibrazione dello strumento UPLClunghezze d'onda per la rilevazione a fluorescenzaseparazione dei picchi dei glicani
