ImmunoglobulinG (IgG) N-glican è caratterizzato utilizzando l'interazione idrofila cromatografica UPLC. Inoltre, la struttura di IgG N-glycan è chiaramente separata. Presentato qui è un'introduzione a questo metodo sperimentale in modo che possa essere ampiamente utilizzato nelle impostazioni di ricerca.
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Articolo metodologico
Immunoglobulin G N-Glycan Analisi di Ultra-Performance Liquid Chromatoography
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Il glicomics è una nuova sottospecializzazione nella ricerca sul sistema omico che offre un potenziale significativo nella scoperta di biomarcatori di nuova generazione per la suscettibilità alle malattie, la scoperta di bersagli farmacologici e la medicina di precisione. I iggini alternativi IgG Nsono stati riportati in diverse malattie croniche comuni e hanno suggerito di avere un grande potenziale nelle applicazioni cliniche (ad esempio, biomarcatori per la diagnosi e la previsione delle malattie). IgG N-glicani sono ampiamente caratterizzati utilizzando il metodo di cromatografia di interazione idrofila (HILIC) cromatografia liquida ad altissima prestazione (UPLC). UPLC è una tecnologia di rilevamento stabile con una buona riproducibilità e un'elevata precisione quantitativa relativa. Inoltre, la struttura di IgG N-glycan è chiaramente separata, e la composizione glicana e l'abbondanza relativa nel plasma sono caratterizzati.
Introduzione
N-glicosilazione delle proteine umane è una modifica post-traduzionale comune ed essenziale1 e può aiutare a prevedere l'insorgenza e lo sviluppo di malattie in modo relativamente accurato. A causa della complessità della sua struttura, si prevede che ci siano più di 5.000 strutture glicane, fornendo un grande potenziale come biomarcatori diagnostici e predittivi per le malattie2. N-glicani attaccati all'immunoglobulina G (IgG) hanno dimostrato di essere essenziali per la funzione di IgG, e IgG N-glycosylation partecipa all'equilibrio tra i sistemi pro e antinfiammatori3. La legatura IgG Ndifferenziale è coinvolta nello sviluppo e nella progressione della malattia, che rappresenta sia una predisposizione che un meccanismo funzionale coinvolto nella patologia della malattia. Il ruolo infiammatorio di IgG N-glycosylation è stato associato con l'invecchiamento, malattie infiammatorie, malattie autoimmuni, e cancro4.
Con lo sviluppo della tecnologia di rilevamento, i seguenti metodi sono più ampiamente utilizzati nei licoli ad alta produttività: cromatografia ad interazione idrofila (HILIC) cromatografia liquida ad altissima prestazione con rilevamento della fluorescenza (UPLC-FLR), elettroforesi gelpillara multiplalesa con fluorino indotto dal laser rilevamento dell'escenza (xCGE-LIF), spettrometria di massa di desorption/ionizzazione del tempo di ionizzazione del tempo di volo (MALDI-TOF-MS) e spettrometria di massa elettrospray a matrice (LC-ESI-MS) . Questi metodi hanno superato le precedenti carenze di basso flusso, risultati instabili e scarsa specificità di sensibilità5,6.
UPLC è ampiamente usato per esplorare l'associazione tra IgG N-glicosilazione e alcune malattie (ad esempio, invecchiamento7, obesità8, dislipidemia9, tipo II diabete10, ipertensione11, ictus ischemico12, e morbo di Parkinson13). Rispetto agli altri tre metodi di cui sopra, UPLC ha i seguenti vantaggi5,14. In primo luogo, fornisce un metodo di analisi quantitativa relativa e l'analisi dei dati che comporta la normalizzazione totale delle aree migliora la comparabilità di ogni campione. In secondo luogo, il costo delle attrezzature e le competenze richieste sono relativamente bassi, il che rende più facile implementare e trasformare i biomarcatori della glicosilazione in applicazioni cliniche. Presentato qui è un'introduzione a UPLC in modo che possa essere più ampiamente utilizzato.
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Protocollo
Tutti i soggetti inclusi nel protocollo sono stati approvati dal Comitato Etico della Capital Medical University, Pechino, Cina12. Il consenso informato scritto è stato ottenuto da ogni materia all'inizio dello studio.
1. Isolamento IgG
- Preparare le sostanze chimiche, tra cui il buffer di legatura (fosfato buffer saline, PBS): 1x PBS (pH - 7,4), neutralizzazione del buffer: 10x PBS (pH - 6,6-6,8), eluente: 0,1 M di acido formica (pH - 2,5), soluzione neutralizzante per eluente: 1 M di bicarbonato di ammonio, memorizzato nel buffer: 20% etanolo - 20 mM Tris - 0,1 M NaCl (pH - 7,4), soluzione di pulizia per la proteina G: 0,1 M NaOH - 30% propan-2-ol.
NOTA: il livello di pH è fondamentale in questo protocollo. L'eluzione di IgG richiede un pH molto basso, e c'è il rischio di perdita di acidi sialici a causa dell'idrolisi acida. Pertanto, l'eluizione avviene in pochi secondi e il pH viene rapidamente ripristinato alla neutralità, preservando l'integrità di IgG e degli acidi sialici. - Preparare i campioni: scongelare il campione di plasma congelato, quindi centrifugare a 80 x g per 10 min, e lasciare la proteina G piastra monolitica e le sostanze chimiche di cui sopra per 30 min a temperatura ambiente (RT).
- Trasferire un campione di 100 l (che può essere utilizzato per rilevare 2x per prevenire il primo guasto) in una piastra di raccolta da 2 mL (qui, un totale di sei campioni standard, un campione di controllo [acqua ultrapura] e 89 campioni di plasma sono stati progettati per 96 piastre di pozzo e assegnati in modo casuale al piatto).
- Diluire i campioni con 1x PBS di 1:7 (v/v).
- Pulire una piastra filtrante in polipropilene idrofilo (GHP) di 0,45 m con 200 l di acqua ultrapura (ripetere 2x).
- Trasferire i campioni diluiti nella piastra filtrante e filtrarli nella piastra di raccolta utilizzando una pompa a vuoto (pressione del vuoto di controllo a 266.6-399.9 Pa).
- Preparazione delle piastre monolitiche proteiche G
- Eliminare il buffer di archiviazione.
- Pulire le piastre monolitiche con 2 mL di acqua ultra-pura, 2 mL di 1x PBS, 1 mL di acido formica di 0,1 M, 2 mL di 10x PBS, 2 mL di 1x PBS (in sequenza) e rimuovere il liquido che scorre utilizzando una pompa a vuoto.
- Trasferire i campioni filtrati nella proteina G piastra monolitica per il legame IgG e la pulizia, quindi pulire le piastre monolitiche con 2 mL di 1x PBS (ripetere la pulizia 2x).
- Evitare L'IgG con 1 mL di acido formica da 0,1 M e filtrare i campioni nella piastra di raccolta con la pompa a vuoto, quindi aggiungere 170 l of 1 M di bicarbonato di ammonio nella piastra di raccolta.
- Rilevare la concentrazione di IgG utilizzando uno spettrometro di assorbimento (lunghezza d'onda ottimale - 280 nm).
- Aprire il software e selezionare la modalità proteina-CY3.
- Disegnare 2 - L di acqua ultra-pura e caricarlo nello schermo, quindi fare clic su Vuoto nel software per cancellare lo schermo (ripetere 1x).
- Disegnare 2 - L di acqua ultra-pura e caricarlo nello schermo, quindi fare clic su Campione nel software per rilevare l'acqua ultra-pura.
- Disegnare 2 l- di campione IgG e caricarlo nello schermo, quindi fare clic su Campione nel software per rilevare il campione.
- Disegnare 2 - L di acqua ultra-pura e caricarlo nello schermo, quindi fare clic su Vuoto nel software per cancellare lo schermo.
- Chiudere il software.
NOTA: La formula per calcolare la concentrazione di IgG è la seguente:
CIgG - coefficiente di assorbimento x estinzione (13,7) x 1.000 g/mL
- Mettete l'IgG estratto ad asciugare in forno a 60 gradi centigradi e conservate l'IgG estratto (300 gradi-L estratto IgG per 4 h).
- Rimuovere 300 l di IgG estratto se la concentrazione è maggiore di 1.000 g/mL.
- Rimuovere 350 l di IgG estratto se la concentrazione è compresa tra 500-1.000 g/mL.
- Rimuovere 400 l di IgG estratto se la concentrazione è compresa tra 200-500 g/mL.
- Rimuovere 600 l di IgG estratto se la concentrazione è inferiore a 200 g/mL.
NOTA: La concentrazione di IgG dovrebbe essere preferibilmente >200 g/mL per il rilevamento successivo. La quantità media di IgG dovrebbe essere preferibilmente >1.200 g, che può essere testato 2x nel caso in cui il primo test non riesce.
- Pulizia della proteina G piastra monolitica per il riutilizzo
- Lavare la piastra con 2 mL di acqua ultra-pura, 1 mL di 0,1 M NaOH (per rimuovere le proteine precipitate), 4 mL di acqua ultra-pura e 4 mL di 1x PBS (sequenza), quindi rimuovere il liquido che scorre utilizzando una pompa a vuoto.
- Lavare la piastra con 2 mL di acqua ultra-pura, 2 mL del 30% propan-2-ol (per rimuovere le proteine idrofobiche legate), 2 mL di acqua ultra-pura e 4 mL di 1x PBS (in sequenza), quindi rimuovere il liquido che scorre utilizzando una pompa a vuoto.
- Lavare la piastra con 1 mL di tampone (20% etanolo , 20 Mm Tris e 0,1 M NaCl) e aggiungere la piastra di 1 mL di tampone (20% di etanolo , 20 Mm Tris , 0,1 M di NaCl) alla piastra, quindi lasciare la piastra a 4 gradi centigradi.
2. Rilascio di Glycan
- Preparare l'IgG essiccato e conservare le sostanze chimiche tra cui 1.33% SDS, 4% Igepal (negozio lontano dalla luce), e 5x PBS a RT.
- Preparare l'enzima PNGase F diluindo 250 U enzima con 250 l di acqua ultra-pura.
- Denaturazione di IgG
- Aggiungere 30 - L di 1,33% SDS e mescolare vortice, trasferire il campione in un forno a 65 gradi per 10 min, quindi toglierlo dal forno e lasciare riposare per 15 min.
- Aggiungere 10 L del 4% Igepal e posizionarlo sull'incubatrice agitazione per 5 min.
- Rimozione e rilascio di glicani
- Aggiungete 20 l di 5x PBS e 30-35 l l di 0,1 mol/L NaOH per regolare un pH di 8,0 e mescolate mediante vortice. Aggiungere 4 L di Enzima PNGase F e mescolare vortice. Quindi, incubare per 18-20 h in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi.
- Mettete i glitrali rilasciati ad asciugare in forno a 60 gradi centigradi per 2,5-3,0 h.
- Salvare i glicani rilasciati a -80 gradi centigradi fino a un'ulteriore misurazione.
NOTA: questo passaggio è fondamentale. La chiave per il rilascio di glicani è migliorare l'attività dell'enzima PNGase F per massimizzarne l'efficienza.
3. Etichettatura e purificazione del glicano
- Preparare il reagente di etichettatura 2-aminobenzamide (2-AB) con 0,70 mg di 2-AB, 10,50 l di acido acetico, 6 mg di cianoboboidride di sodio (NaBH3CN) e 24,50 - L di dimetilfossido di dimetilluso (DMSO) (volume totale 35 . Quindi, aggiungere acido acetico, 2-AB, e NaBH3CN nel DMSO in ordine.
- Etichettare i glicani utilizzando 35 gradi l di reagente di etichettatura 2-AB, trasferire i glicani etichettati all'oscillatore per 5 min, trasferire al forno per 3 h a 65 gradi centigradi, quindi trasferire a RT per 30 min.
NOTA: l'intero passaggio di etichettatura glican deve essere eseguito mentre è protetto dalla luce. - Pretrattare una piastra filtrante GHP da 0,2 m con 200 gradi l di 70% di etanolo, 200 l di acqua ultrapura e 200 luna del 96% acetonitrile (4 gradi), quindi rimuovere i rifiuti con una pompa a vuoto.
- Purificazione del glicano etichettato 2-AB
- Aggiungere 700 loffi del 100% di acetonitrile al glicano etichettato 2-AB e trasferirlo in un'incubatrice tremante per 5 min.
- Centrifuga a 134 x g per 5 min (4 gradi centigradi).
- Trasferire il campione su una piastra filtrante GHP di 0,2 m per 2 min e rimuovere il filtrato (liquido che scorre) utilizzando una pompa a vuoto.
- Lavare il glicano etichettato 2-AB con 200 -L of 96% acetonitrile (4 ) e rimuovere il filtrante (liquido scorrevole) utilizzando una pompa a vuoto 5x-6x.
- Glicano etichettato 2-AB eluito con 100 litri di acqua ultrapura 3x.
- Trasferire il glicano con etichetta 2-AB in forno ad asciugare a 60 gradi centigradi per 3,5 h.
- Salvare gli N-glicani con l'etichetta a -80 gradi centigradi fino a un'ulteriore misurazione.
4. Cromatografia e analisi dell'interazione idrofila
- Condizionamento degli strumenti UPLC e preparazione delle fasi mobili
- Preparare fasi mobili, tra cui solvente A: 100 mM di formato di ammonio (pH - 4,4), solvente B: acetonitrile 100%, solvente C: 90% acqua ultra-pura (10% metanolo) e solvente D: 50% metanolo (acqua ultra-pura).
- Aprire il software per controllare le fasi mobili.
- Lavare gli strumenti UPLC a una portata di 0,2 mL/min (50% solvente B e 50% solvente C) bilanciato per 30 min, quindi ad una velocità di flusso di 0,2 mL/min (25% solvente A e 75% solvente B) bilanciamento per 20 min, quindi una velocità di flusso di 0,4 mL/ bilanciamento.
- Sciogliere i n-glicani etichettati con 25 gradi di una miscela di acetonitrile 100% e acqua ultra-pura ad un rapporto 2:1 (v/v). Quindi, centrifugare a 134 g per 5 min (4 gradi centigradi) e caricare 10 -L degli strumenti N-glicani etichettati negli strumenti UPLC.
- Separare i valori etichettati N-glicani alla portata di 0,4 mL/min con una pendenza lineare del 75% al 62% di acetonitrile per 25 min. Quindi, eseguire una corsa analitica da dextran calibrazione colonna / colonna di glicopeptide su un UPLC a 60 gradi centigradi (qui, i campioni sono stati tenuti a 4 gradi centigradi prima dell'iniezione).
- Rileva la fluorescenza N-glican a lunghezze di eccitazione ed emissione di 330 e 420 nm, rispettivamente.
- Integrare i glicani in base alla posizione di picco e al tempo di ritenzione.
- Calcolare il valore relativo di ogni picco di Glycan (GP)/ tutti i picchi di Glycan (GP) (percentuale, %) come segue: GP1: GP1/GP-100, GP2: GP2/GP-100, GP3: GP3/GP-100, ecc.
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Risultati
Come illustrato nella Figura 1, IgG N-glicani sono stati analizzati in 24 picchi iniziali di glicani (GP) in base alla posizione di picco e al tempo di ritenzione. Le strutture N-glicani sono disponibili attraverso il rilevamento della spettrometria di massa secondo uno studio precedente (Tabella 1)15. Per garantire che i risultati fossero comparabili, è stata applicata la normalizzazione totale dell'...
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Discussione
UPLC funge da metodo di analisi quantitativa relativa5,15. I risultati indicano che UPLC è una tecnologia di rilevamento stabile con una buona riproducibilità e relativa precisione quantitativa. La quantità di glicani in ogni picco è espressa come percentuale dell'area totale integrata utilizzando UPLC, che è il valore relativo. La quantificazione relativa migliora la comparabilità dei campioni di prova. Inoltre, 96 piastre g di proteine sono utilizzate per purif...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dalla National Natural Science Foundation of China (81673247 & 81872682) e dalla australiana-Cina Collaborative Grant (NH & MRC - APP11112767 -NSFC 81561128020).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2-amminobenzamide, 2-AB | Sigma, Cina | ||
| Piastra di raccolta a 96 pozzetti | AXYGEN | ||
| Piastra filtrante a 96 pozzetti | Pol | 0,45 um GHP | |
| Separazioni | |||
| Rotore a piastra a 96 pozzetti | Eppendorf Co., Ltd, Germania | T_1087461900 | |
| Acido acetico | Sigma, Cina | ||
| Acetonitrile | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, Cina | ||
| Bicarbonato di ammonio | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Cina | ||
| Formiato di ammonio | Beijing Minruida Technology Co., Ltd. | ||
| Incubatore/bilanciere a scuotimento costante | Zhicheng strumento analitico manufacturing co., Ltd, Cina | ZWY-10313 | |
| Scala di calibrazione destrano/colonna glicopeptidica | Watts technology Co., Ltd, Cina | Colonna | |
| Dimetil solfossido (DMSO) | Sigma, Cina | ||
| Fosfato disodico | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Cina | ||
| Forni elettrici | Tester instruments Co., Ltd | 202-2AB | |
| Empower 3.0 | Waters technology Co., Ltd, America | ||
| Ethanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, Cina | ||
| Acido formico | Sigma, Cina | ||
| GlycoProfile 2-AB Kit di etichettatura | Sigma, Cina | ||
| HCl | Junrui Biotechnology Co., Ltd, Cina | ||
| Centrifuga ad alta velocità | Eppendorf Co., Ltd, Germania | 5430 | |
| Igepal | Sigma, Cina | ||
| Centrifuga a bassa temperatura | Eppendorf Co., Ltd, Germania | ||
| Frigorifero a bassa temperatura | Qingdao Haier Co., Ltd | ||
| Collettore a 96 pozzetti per piastre | Tecnologia Watt Co., Ltd, Cina | 186001831 | |
| metanolo | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, Cina | ||
| Milli-Q contatore di acqua pura | Millipore Co., Ltd, America | Advantage A10 | |
| NaOH | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Cina | ||
| PH tester | Sartorius Co., Ltd, Germania | PB-10 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato, PBS | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Cina | ||
| Pipetta | Eppendorf Co., Ltd, Germania | 4672100, 0,5-10 & mu; l & 10-100μ l & 20-200μ l & 1000μ | |
| PNGasi F enzima | Sigma, Cina | ||
| Potassio diidrogeno fosfato | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Cina | ||
| Propan-2-olo | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, Cina | ||
| SDS | Sigma, Cina | ||
| Cloruro di sodio | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Cina | ||
| Cianoboroidruro di sodio (NaBH3CN) | Sigma, Cina | ||
| Spettrofotometro | Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd | B-500 | |
| Pistola liquida di trasferimento | Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, Cina | 4672100 | |
| Tris | Amresco, America | ||
| Frigorifero a bassissima temperatura | Thermo Co., Ltd, America | MLT-1386-3-V; MDF-382E | |
| Cromatografia liquida ad alte prestazioni | Watts technology Co., Ltd, Cina | Acquity MLtraPerformance LC | |
| Vacuum Pump | Watts technology Co., Ltd, Cina | 725000604 | |
| Volatilizzatore / Essiccatore | Eppendorf Co., Ltd, Germania | T_1087461900 | |
| Vortex | Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, Cina | NP-30S | |
| Tester a bagno d'acqua | strumenti Co., Ltd | DK-98-IIA | |
| Bilancia | Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd. | MP200B |
Riferimenti
- Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214(2012).
- Cummings, R., Pierce, J. M. The Challenge and Promise of Glycomics. Chemistry Biology. 21 (1), (2014).
- Shade, K. T. C., Anthony, R. M. Antibody Glycosylation and Inflammation. Antibodies. 2, 392(2013).
- Gudelj, I., Lauc, G., Pezer, M. Immunoglobulin G glycosylation in aging and diseases. Cellular Immunology. 333, 65(2018).
- Huffman, J. E., et al. Comparative performance of four methods for high-throughput glycosylation analysis of immunoglobulin G in genetic and epidemiological research. Molecular Cellular Proteomics. 13, 1598(2014).
- Stockmann, H., Adamczyk, B., Hayes, J., Rudd, P. M. Automated, high-throughput IgG-antibody glycoprofiling platform. Analytical Chemistry. 85, 8841(2013).
- Kristic, J., et al. Glycans are a novel biomarker of chronological and biological ages. Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences Medical Sciences. 69, 779(2014).
- Nikolac, P. M., et al. The association between galactosylation of immunoglobulin G and body mass index. Progress in Neuropsychopharmacology Biological Psychiatry. 48, 20(2014).
- Liu, D., et al. The changes of immunoglobulin G N-glycosylation in blood lipids and dyslipidaemia. Journal of Translational Medicine. 16, 235(2018).
- Lemmers, R., et al. IgG glycan patterns are associated with type 2 diabetes in independent European populations. Biochimica Biophysica Acta General Subjects. 1861, 2240(2017).
- Wang, Y., et al. The Association Between Glycosylation of Immunoglobulin G and Hypertension: A Multiple Ethnic Cross-Sectional Study. Medicine (Baltimore). 95, e3379(2016).
- Liu, D., et al. Ischemic stroke is associated with the pro-inflammatory potential of N-glycosylated immunoglobulin G. Journal of Neuroinflammation. 15, 123(2018).
- Russell, A. C., et al. The N-glycosylation of immunoglobulin G as a novel biomarker of Parkinson's disease. GLYCOBIOLOGY. 27, 501(2017).
- Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation. Analytical Chemistry. 82, 10208(2010).
- Pucic, M., et al. High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations. Molecular Cellular Proteomics. 10, M111(2011).
- Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95(2000).
- Ren, S., et al. Distribution of IgG galactosylation as a promising biomarker for cancer screening in multiple cancer types. Cell Research. 26, 963(2016).
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