Descriviamo l'applicazione della nanospettroscopia a infrarossi e della microscopia a forza atomica ad alta risoluzione per visualizzare il processo di autoassemblaggio delle proteine in aggregati oligomerici e fibrille amiloidi, che è strettamente associato all'insorgenza e allo sviluppo di una vasta gamma di disturbi neurodegenerativi umani.
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Articolo metodologico
Caratterizzazione degli aggregati proteici individuali mediante nanospettroscopia a infrarossi e microscopia a forza atomica
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il fenomeno del ripiegamento e dell'aggregazione delle proteine porta alla formazione di aggregati proteici altamente eterogenei, associati a condizioni neurodegenerative come il morbo di Alzheimer e il morbo di Parkinson. In particolare gli aggregati a basso peso molecolare, gli oligomeri amiloidi, hanno dimostrato di possedere proprietà citotossiche generiche e sono implicati come neurotossine in molte forme di demenza. Illustriamo l'uso di metodi basati sulla microscopia a forza atomica (AFM) per affrontare il difficile compito di caratterizzare le proprietà morfologiche, strutturali e chimiche di questi aggregati, che sono difficili da studiare utilizzando le strutturali convenzionali metodi biofisici sfusi a causa della loro eterogeneità e natura transitoria. Gli approcci di microscopia a sonda a scansione sono ora in grado di studiare la morfologia degli aggregati amiloidi con risoluzione sub-nanometrica. Dimostriamo qui che la nanospettroscopia a infrarossi (AFM-IR), che sfrutta contemporaneamente l'alta risoluzione dell'AFM e il potere di riconoscimento chimico della spettroscopia IR, può andare oltre e consentire la caratterizzazione delle proprietà strutturali dei singoli aggregati proteici, e quindi offrono approfondimenti sui meccanismi di aggregazione. Poiché l'approccio che descriviamo può essere applicato anche alle indagini sulle interazioni delle assemblee proteiche con piccole molecole e anticorpi, può fornire informazioni fondamentali per sviluppare nuovi composti terapeutici per diagnosticare o trattare disturbi neurodegenerativi.
Introduzione
Oltre 40 milioni di persone in tutto il mondo sono attualmente colpite da disturbi neurodegenerativi, come il morbo di Alzheimer (AD)1 e le malattie di Parkinson (PD)2. Più in generale, più di cinquanta patologie sono associate a livello molecolare a misfolding e aggregazione delle proteine, un processo che porta alla proliferazione di aggregati di proteine fibrillari insolubili, noti come depositi di amiloide3, 4.Le origini molecolari della neurodegenerazione e i suoi legami con i cambiamenti conformazionali proteici delle proteine che portano alla formazione d....
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Protocollo
1. Saggi di aggregazione sui lettori di placche a fluorescenza
NOTA: Il protocollo qui descritto è un esempio di come studiare l'aggregazione di qualsiasi proteina o peptide da cinetica chimica. In particolare, descrive un protocollo ottimizzato per studiare l'aggregazione del peptide A42, che è coinvolto nell'insorgenza e nella progressione del morbo di Alzheimer58,59. Un protocollo simile può essere regolato e adottato per studiare l'aggregazione di qualsiasi proteina o peptide.
- Ottenere una soluzione monomerica altamente pura di A -42 attraverso tecniche di cromatografi....
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Risultati
Nella figura 1 è illustrato un corso di tempo rappresentativo di aggregazione a 42, misurato dal saggio di fluorescenza ThT, nella Figura 1. Il processo di aggregazione è comunemente caratterizzato da una curva sigmoidale, in cui si osserva inizialmente una fase di ritardo, ed è seguito da una fase di crescita ripida, prima che la curva raggiunga un altopiano quando viene raggiunto uno stato stabile di equilibrio6,7 ,
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Discussione
Il primo passo critico di questo protocollo è la preparazione di proteine monomeriche, come nel caso della soluzione A42 descritta nei passaggi 1.1 e 1.2. È essenziale avviare il processo di aggregazione da una soluzione monomerica altamente pura, in quanto la presenza di specie oligomeriche o aggregate può provocare una scarsa riproducibilità della cinetica di aggregazione58e indurre artefatti nell'AFM misurazioni (ad esempio, le specie di fibrillar saranno evidenti nelle fasi iniziali dell'aggre.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano la Fondazione nazionale svizzera per la scienza (SNF) per il sostegno finanziario (numero di sovvenzione P2ELP2_162116 e P300P2_171219), il programma Darwin College, Erasmus la ricerca che ha portato a questi risultati ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca nell'ambito del settimo programma quadro dell'Unione europea (FP7/2007-2013) attraverso la sovvenzione del CER PhysProt (numero di accordo 337969), la Newman Foundation (T.P.J.K.) e la Cambridge Centre for Misfolding Diseases (C.G., M.V. e T.P.J.K.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sistema AFM-IR | Anasys Instruments | nanoIR 2 o 3 | Sistemi per la misura dell'espansione termica in modalità di contatto e risonanza |
| Corning 96-well Half Area Fondo nero/trasparente Polistirene NBS Micropiastra | Corning | 3881 | |
| Corning Nastro sigillante in alluminio per micropiastre | Corning | 6570 | |
| Dischi biadesivi | AGAR Scientific | AGG3347N | |
| FLUOstar Omega | BMG Labtech | 415-101 | Platereader |
| Mica Disc 10mm V1 | AGAR Scientific | AGF7013 | |
| Park NX10 Sistema AFM | Park Systems | N/A | Microscopio a forza atomica |
| Platypus Chip d'oro ultrapiatto | Platypus Technologies | AU.1000.SWTSG | |
| PPP-NCHR-10 cantilever | Park Systems | PPP-NCHR-10 | |
| Provette LowBind per proteine, 2,0 mL | Eppendorf | 30108132 | |
| Cantilever rivestiti in oro silicio | Anasys Instruments | PR-EX-nIR2 | |
| SPM Dischi per campioni 12mm | AGAR Scientific | AGF7001 |
Riferimenti
- Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8, 595-608 (2016).
- Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 1-21 (2017).
- Chiti, F., Dobson, C. M.
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Ristampe e permessi
