Articolo metodologico

Caratterizzazione degli aggregati proteici individuali mediante nanospettroscopia a infrarossi e microscopia a forza atomica

DOI:

10.3791/60108

⸱

12 settembre 2019

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Misfolding Diseases, Department of Chemistry, University of Cambridge, 2Institute of Biotechnology, Life Sciences Center, Vilnius University, 3Cavendish Laboratory, Department of Physics, University of Cambridge

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descriviamo l'applicazione della nanospettroscopia a infrarossi e della microscopia a forza atomica ad alta risoluzione per visualizzare il processo di autoassemblaggio delle proteine in aggregati oligomerici e fibrille amiloidi, che è strettamente associato all'insorgenza e allo sviluppo di una vasta gamma di disturbi neurodegenerativi umani.

Abstract

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Il fenomeno del ripiegamento e dell'aggregazione delle proteine porta alla formazione di aggregati proteici altamente eterogenei, associati a condizioni neurodegenerative come il morbo di Alzheimer e il morbo di Parkinson. In particolare gli aggregati a basso peso molecolare, gli oligomeri amiloidi, hanno dimostrato di possedere proprietà citotossiche generiche e sono implicati come neurotossine in molte forme di demenza. Illustriamo l'uso di metodi basati sulla microscopia a forza atomica (AFM) per affrontare il difficile compito di caratterizzare le proprietà morfologiche, strutturali e chimiche di questi aggregati, che sono difficili da studiare utilizzando le strutturali convenzionali metodi biofisici sfusi a causa della loro eterogeneità e natura transitoria. Gli approcci di microscopia a sonda a scansione sono ora in grado di studiare la morfologia degli aggregati amiloidi con risoluzione sub-nanometrica. Dimostriamo qui che la nanospettroscopia a infrarossi (AFM-IR), che sfrutta contemporaneamente l'alta risoluzione dell'AFM e il potere di riconoscimento chimico della spettroscopia IR, può andare oltre e consentire la caratterizzazione delle proprietà strutturali dei singoli aggregati proteici, e quindi offrono approfondimenti sui meccanismi di aggregazione. Poiché l'approccio che descriviamo può essere applicato anche alle indagini sulle interazioni delle assemblee proteiche con piccole molecole e anticorpi, può fornire informazioni fondamentali per sviluppare nuovi composti terapeutici per diagnosticare o trattare disturbi neurodegenerativi.

Introduzione

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Oltre 40 milioni di persone in tutto il mondo sono attualmente colpite da disturbi neurodegenerativi, come il morbo di Alzheimer (AD)1 e le malattie di Parkinson (PD)2. Più in generale, più di cinquanta patologie sono associate a livello molecolare a misfolding e aggregazione delle proteine, un processo che porta alla proliferazione di aggregati di proteine fibrillari insolubili, noti come depositi di amiloide3, 4.Le origini molecolari della neurodegenerazione e i suoi legami con i cambiamenti conformazionali proteici delle proteine che portano alla formazione di amiloidi, tuttavia, rimangono poco chiare, in gran parte a causa dell'alto livello di eterogeneità, natura transitoria e su scala nanometrica dimensioni degli aggregati patologici4,5.

Indagini di grande successo sulle strutture proteiche negli ultimi decenni si sono basate ampiamente sull'uso di metodi sfusi, tra cui la cristallografia a raggi X, la microscopia crioelettronica e la spettroscopia a risonanza magnetica nucleare5, 6 È possibile: , 7 (in questo stato , 8 (IN vio , 9. All'interno di questa classe di tecniche, la spettroscopia a infrarossi (IR) è emersa come uno strumento analitico sensibile per svelare le proprietà chimiche dei sistemi biologici come le proteine8. I metodi di iR consentono la quantificazione delle variazioni strutturali secondarie e quaternarie durante il loro misfolding e aggregazione. Inoltre, al fine di decifrare ulteriormente a livello microscopico i dettagli meccanicistici coinvolti nei complessi paesaggi di energia libera delle proteine durante la loro aggregazione, un importante progresso è stato lo sviluppo di strumenti di cinetica chimica per estendere a complessi percorsi di auto-assemblaggio tra cui amiloide fibrille formazione5,6,7,10,11,12. Tuttavia, i metodi spettroscopici di massa forniscono solo informazioni medie sull'insieme eterogeneo di specie presenti nella soluzione o coinvolte in specifici passaggi microscopici, rendendo così lo studio delle proprietà biofisiche dei singoli specie aggregate impegnative al livello su nanoscala13,14.

Diverse tecniche di microscopia con la capacità di operare su scale più piccole del limite di diffrazione della luce sono emerse negli ultimi decenni. Questa classe di metodi include la microscopia elettronica (EM) e la microscopia a forza atomica (AFM). Mentre la microscopia elettronica a scansione (SEM) e la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) forniscono immagini bidimensionali (2D) di un campione, l'AFM è emersa negli ultimi decenni come una tecnica potente e versatile per studiare morfologie tridimensionali (3D), come così come le proprietà nanomeccaniche di un campione con risoluzione sub-nanometrica13,14,15,16,17,18,19, 20 anni , 21 Mieto , 22 Milia , 23 del 23 o , 24 Mi lasa' di , 25 mi lato , 26 del sistema di , 27.La logica alla base dello studio dell'aggregazione proteica tramite AFM è che questo approccio consente di studiare la morfologia delle singole specie presenti nella soluzione13,14,16, 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37. In particolare, monitorando il campione in funzione del tempo, AFM consente di sforare l'evoluzione della morfologia della specie all'interno del campione, che permette di seguire e visualizzare i percorsi di formazione di amiloidi23, 25,38,39,40,41,42. Inoltre, AFM consente la quantificazione dei parametri strutturali come le altezze e le lunghezze trasversali delle singole specie presenti nella soluzione13,19,30,31 ,32,33,34,35,36,37,40,43, 44 (di sistema) , 45 anni , 46 per quanto , 47 o , 48. Tuttavia, lo studio di una singola proprietà biofisica, come la morfologia, spesso non è sufficiente quando si studiano sistemi biologici eterogenei e complessi. I metodi di imaging AFM, SEM o TEM da soli non rivelano facilmente le proprietà chimiche delle specie eterogenee di aggregati amiloidi su scala nanometrica.

Un importante progresso per l'analisi di campioni biologici eterogenei di questa portata è stato recentemente fatto con lo sviluppo e l'applicazione al campo dell'aggregazione proteica della nanospettroscopia infrarossa (AFM-IR)24,26, 38,42,49,50,51,52. Questo metodo innovativo sfrutta la combinazione della risoluzione spaziale dell'AFM (1-10 nm) con il potere di analisi chimica di IR. La tecnica AFM-IR si basa sulla misurazione dell'effetto di risonanza indotta fototermica guidato da un laser AIR e sulla misurazione dell'espansione termica del campione in esame da parte della punta AFM. Il campione può essere illuminato dal laser a infrarossi direttamente dall'alto o dal basso nella riflessione interna totale, come nella spettroscopia a infrarossi convenzionale24,42,52,53 . Il laser a raggi IR può essere pulsato con frequenze tipiche nell'ordine di centinaia di kilohertz (1,1000 kHz) e sintonizzato su un'ampia gamma spettrale, in genere tra i 1000-3300 cm-1. Anche se la sorgente laser copre un'area di 30 m di diametro, la risoluzione spaziale della tecnica AFM-IR è determinata nominalmente dal diametro della punta AFM, che rileva l'espansione termica locale del sistema. AFM-IR è adatto per studiare campioni biologici perché il segnale IR è proporzionale al loro spessore fino a 1,5 m, e gli spettri IR risultanti sono generalmente in accordo con i corrispondenti spettri di trasmissione FTIR13,54 ,55. Per questo motivo, i metodi stabiliti di analisi in spettroscopia possono essere facilmente applicati, come lo studio dei cambiamenti chimici, il cambiamento della forma della banda e la de-convoluzione mediante l'analisi dei secondi derivati52. Nel complesso, combinando la risoluzione spaziale dell'AFM con il potere di riconoscimento chimico della spettroscopia IR, AFM-IR consente l'acquisizione simultanea di un'ampia gamma di proprietà morfologiche, meccaniche e chimiche di un campione su scala nanometrica.

Qui, illustriamo un protocollo per la caratterizzazione del processo di aggregazione proteica che sfrutta la combinazione di saggi di fluorescenza in vitro, imaging AFM ad alta risoluzione e AFM-IR su nanometrica. Questo approccio combinato ha già eccellere nel fornire risultati dettagliati nello studio delle proprietà chimiche e strutturali delle singole micro-goccioline formate da aggregati proteici, nello studio della separazione di fase delle proteine liquide liquide e in studiare l'eterogeneità e le proprietà biofisiche delle singole specie aggregate su nanoscala23,26,38,45,50,53, 56,57.

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Protocollo

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1. Saggi di aggregazione sui lettori di placche a fluorescenza

NOTA: Il protocollo qui descritto è un esempio di come studiare l'aggregazione di qualsiasi proteina o peptide da cinetica chimica. In particolare, descrive un protocollo ottimizzato per studiare l'aggregazione del peptide A42, che è coinvolto nell'insorgenza e nella progressione del morbo di Alzheimer58,59. Un protocollo simile può essere regolato e adottato per studiare l'aggregazione di qualsiasi proteina o peptide.

  1. Ottenere una soluzione monomerica altamente pura di A -42 attraverso tecniche di cromatografia di scambio io-io e di esclusione delle dimensioni per distinguere le frazioni proteiche che contengono L'A42, e per isolare la frazione monomerica da altre forme aggregate di A42 ottenuta58 , 59.
  2. Diluire il peptide in un cuscinetto di fosfato di sodio da 20 mM, 200 EDTA a 200 m EDTA a pH 8,058 a una concentrazione finale desiderata che va da 1,5 ml, in tubi a basso legame da 1,5 ml. I campioni raccolti per le misurazioni AFM non devono contenere il tinrito fluorescente utilizzato nell'analisi di aggregazione (thioflavin T, ThT), in quanto potrebbe introdurre artefatti durante la deposizione del campione per l'analisi AFM. Quindi, preparate triplicati di due soluzioni identiche: i) la prima contenente il monomerico A-42 a seguire il processo di aggregazione da parte dell'AFM; ii) il secondo contenente il monomerico A42 con l'aggiunta di 20 M ThT come tracciante per monitorare la cinetica dell'aggregazione.
    NOTA: è importante eseguire i passaggi 1.1 e 1.2 sul ghiaccio. Questa procedura è quella di garantire che la soluzione monomerica A-42 non si aggrega fino a quando non viene avviata nel lettore di piastre. Quando si maneggiano i campioni, è essenziale un'attenta pipettatura per evitare l'introduzione di bolle d'aria che possono influenzare il campione proteico.
  3. Pipette 80 -L di ogni campione in ogni pozzo di una piastra a 96 pozze, a mezza area di polistirolo nero con fondo chiaro e superfici non vincolanti.
  4. Sigillare la piastra con un foglio per ridurre al minimo l'evaporazione del campione nel corso dell'aggregazione.
  5. Equilibrio e la temperatura del lettore di piastre a 37 gradi centigradi.
  6. Impostare il protocollo di aggregazione per leggere le misurazioni della fluorescenza a intervalli di tempo fissi, a una lunghezza d'onda di eccitazione di 440 nm e a una lunghezza d'onda di emissione di 480 nm. L'aggregazione deve essere avviata in condizioni di quiescente.
  7. Inserire la piastra nel lettore di piastre.
    NOTA: è importante prestare attenzione durante la gestione della piastra, per garantire che l'aggregazione non venga attivata prima di avviare il lettore di piastre. Utilizzare le impostazioni di regolazione del guadagno per garantire la lettura ottimale della fluorescenza di ogni campione.
  8. Avviare la misurazione.
    NOTA: L'esperimento di aggregazione si conclude quando la curva sigmoidale a fluorescenza ThT raggiunge un altopiano58.

2. Preparazione del campione per le misurazioni AFM e nano-IR

  1. Incolla il disco V1 mica di alta qualità al disco in acciaio magnetico in acciaio inox di alta qualità utilizzando schede adesive o nastro a doppio lato.
  2. Incisa mica posizionando un pezzo di nastro adesivo sulla superficie della mica e tirando fuori lo strato superiore della mica. Questa procedura produrrà una superficie pulita, atomicamente piana, adatta per la deposizione del campione.
    NOTA: La superficie incisa deve essere uniforme e liscia.
    DESTRA: Non toccare o respirare direttamente sopra la mica appena incisa, in quanto ciò introdurrà artefatti.
  3. Mettere in pausa/interrompere la misurazione del lettore di piastre per raccogliere il punto di interesse durante il processo di aggregazione della proteina.
  4. Rimuovere la pellicola di guarnizione e raccogliere 10 gradini dei campioni senza ThT dal pozzo in un tubo a bassa legatura da 1,5 ml.
  5. Depositare i 10 l del campione sulla mica appena incisa. Per le misurazioni AFM-IR i campioni devono essere depositati su substrato d'oro appena spogliato.
  6. Incubare la soluzione sulla mica per 1 min per consentire la fisisorbazione.
    NOTA: Tempi di incubazione più lunghi consentirebbero un migliore assorbimento in superficie, ma può indurre l'auto-organizzazione artificiale e l'auto-assemblaggio25. Per evitare questi effetti, la deposizione spray può essere sfruttata25.
  7. Risciacquare tre volte con 1 mL di acqua ultrapura.
  8. Asciugare sotto un delicato flusso di azoto per misurare il campione nell'ambiente atmosferico.

3. Imaging AFM della morfologia degli aggregati proteici

NOTA: Le misurazioni morfologia possono essere eseguite sia in modalità di contatto che dinamica, nei passaggi seguenti quest'ultimo viene descritto poiché riduce le forze laterali per misurare la morfologia 3D del campione ad alta risoluzione. Le misurazioni AFM-IR verranno eseguite in modalità di contatto per migliorare il rapporto segnale-rumore AFM-IR.

  1. Accendere il sistema AFM almeno 30 min prima delle misurazioni per consentire al sistema di raggiungere la stabilità termica. Fare clic su Setup (Setup),quindi su Probe (Sonda). Nella finestra Cambio sonda, fare clic su Avanti per preparare lo stage di messaa fuoco .
  2. Spegnere l'interruttore del fascio AFM (se è acceso). Sbloccare i blocchi coda di colomba, scollegare la testa dal sistema e in Sonda Cambia finestra fare clic su Avanti.
  3. Montare lo sbalzo AFM sul supporto della sonda. Collegare la testa al sistema e bloccare le serrature a coda di rondine.
    NOTA: I cantilever ottimali per studiare campioni biologici in modalità dinamica AFM hanno una costante a molla compresa tra 2-40 N m-1 e un radii dell'apice compreso tra 2-8 nm14.
  4. Attivare l'interruttore del fascio laser AFM e nella finestra Cambio sonda fare clic su Avanti.
  5. Nella finestra pop-up fare clic su No se il tipo di sbalzo non è cambiato. Regolare le manopole di allineamento ottiche per trovare il cantilever. Regolare lo stato attivo sul cantilever e fare clic su Avanti.
  6. Nella finestra pop-up fare clic su Sì se lo stato attivo è sul cantilever.
  7. Posizionare il raggio laser all'estremità del cantilever utilizzando le manopole di controllo della posizione del laser di rilevamento. Massimizzare il segnale totale misurato dal fotodiodo a quattro quadranti almeno >1 V utilizzando le manopole che controllano la posizione del fascio laser deviato sul fotodiode sensibile alla posizione (PSPD). Nella finestra Cambio sonda fare clic su Avanti e quindi su Chiudi.
  8. Attendere 15 min per lo sbalzo per raggiungere la stabilità termica. Se necessario, riadattare la posizione del raggio laser deviato sul PSPD.
  9. Fare clic su NCM SWEEP, scegliere l'ampiezza desiderata di oscillazione, fare clic su Usa fase, fare clic su auto e sintonizzare il cantilever vicino al massimo della sua prima risonanza libera di oscillazione, che è di circa 300 kHz per un sbalzo con una costante di molla di 40 N m-1.
    NOTA: Sintonizzare il cantilever dal massimo della sua risonanza libera assicura una maggiore stabilità delle misurazioni14.
  10. Posizionare il campione sul supporto del campione. Scegliere i parametri di imaging adatti. La velocità di scansione tipica è di 0,3,0 Hz per un'area di scansione di 1 x 1 mda 2 a 5 x 5 m2. La risoluzione tipica necessaria è compresa tra 256 x 256 e 1024 x 1024 pixel. Fare clic su Area di scansione per scegliere la dimensione della scansione e il numero di pixel.
  11. Concentrare la vista ottica sul campione. Fare clic su Approccio per avvicinarsi alla superficie di campionamento. Una volta completato l'approccio clicca sul Sollevamento di 100 m per alzare la punta AFM di 100 m sopra la superficie del campione. Fare clic su Espandi sull'immagine ottica del campione. Fare clic sulla barra dello stage di messa a fuoco per mettere a fuoco la vista sulla superficie del campione.
  12. Utilizzare le frecce per spostarsi nella regione del campione di interesse. Attivare la superficie premendo il pulsante Avvicina. Fare clic sul pulsante Scansione linea e verificare se la punta segue bene la superficie, se necessario, regolare il Puntodi impostazione .
  13. Iniziare a imaging la superficie campione premendo il pulsante Scansione. Durante l'imaging, per evitare una forza di imaging di grandi dimensioni e mantenere la coerenza all'interno di campioni indipendenti, mantenere un regime costante di cambiamento di fase che non superi i42gradi.
  14. Immettere il nome del file e scegliere la directory di base in cui verrà salvata l'immagine acquisita.

4. Misurazioni di nanosptroscopia infrarossi di aggregati proteici

  1. Accendere il sistema AFM-IR e il laser a infrarossi (IR)60 30-60 min prima delle misurazioni per la stabilizzazione termica. I laser tipici degli strumenti AFM-IR sono gli oscillatori di parametri ottici (OPO) e i laser a cascata quantistica (QCL).
  2. Aprire il software integrato per controllare lo strumento. Fare clic sul file e quindi su nuovo per aprire un nuovo file nanoIR. Premere il pulsante inizializzare per avviare il sistema AFM-IR.
  3. Aprire il coperchio dello strumento e montare sul sistema AFM-IR una sonda rivestita in oro di silicio con un raggio nominale di 30 nm e una costante di molla di 0,2 N/m per misurare il campione in modalità di contatto.
  4. Fare clic su Carica nella sezione Sonda AFM e quindi su Avanti. Nella parte d'accorto sulla sezione sonda fare clic sulle frecce per mettere a fuoco la fotocamera sul cantilever. Nella sezione campione di movimento XY, utilizzare le frecce per posizionare l'aria trasversale alla fine dello sbalzo.
  5. Ruotare le manopole che controllano la posizione del laser di rilevamento per posizionare il laser alla fine dello sbalzo. Ruotare le manopole laser per rilevare e massimizzare la somma misurata dal fotodiodo a quattro quadranti su un valore >3 V. Ruotare la manopola di deflessione per regolare la deflessione a sbalzo a -1 V e quindi fare clic su Avanti. Chiudere il coperchio dello strumento.
  6. Nella sezione concentrarsi sul campione utilizzare le frecce per mettere a fuoco la fotocamera sul campione. Quindi, nella sezione campione movimento XY utilizzare le frecce per muoversi nella regione di interesse del campione e fare clic su avvicinarsi e coinvolgere.
  7. Nella finestra del microscopio selezionare come input i canali di interesse per mappare le proprietà biofisiche del campione. In particolare, scegliere l'altezza per la morfologia, l'ampiezza 2 per l'assorbimento IR e la frequenza PLL per mappare la risonanza di contatto tip-sample.
  8. Nella sezione di scansione AFM della finestra dei controlli, utilizzare parametri simili come nella sezione 3 (ad esempio, la frequenza di scansione 0,1-1,0 Hz, tra 256 x 256 e 1024 x 1024 pixel). Scegli come valore dei guadagni in base alla rugosità del campione: integrale I - 1/10 e P proporzionale - 10/30. Quindi, fare clic su scansione per acquisire una mappa di morfologia.
    NOTA: la morfologia può essere misurata in modo simile nella modalità di maschiatura dinamica, ma le misurazioni AFM-IR vengono eseguite qui in modalità di contatto per avere rapporti segnale/rumore più elevati.
  9. Al termine della mappatura della morfologia, nella finestra del microscopio, fare clic sulla mappa dell'altezza per posizionare la sonda sulla parte superiore di un aggregato. Quindi, nella sezione nanoIR della finestra dei controlli, fare clic su Avvia IR per illuminare il campione con il laser a iR.
  10. Per mettere a fuoco il laser a infrarossi sul cantilever, fare clic sull'ottimizzazione. In questa finestra, scrivere un numero d'onda in cui il campione avrà un'elevata assorbimento e fare clic su aggiungi. Per le proteine, un valore tipico è 1655 cm-1. Fare clic sulla scansione per trovare la posizione laser a iR e fare clic su Aggiorna per allineare la sua posizione con lo sbalzo. Chiudere la finestra.
  11. Nella sezione generale dell'impostazione nanoIR, scrivere un numero d'onda in cui è prevista un'elevata assorbimento nel campo relativo. Quindi, disattivare l'opzione Filtro passaggio banda e osservare la lettura del contatore e la rapida trasformazione di Fourier (FFT) della risposta a sbalzo. Nella finestra FFT spostare il cursore verde per leggere la frequenza di risonanza del sbalzo. Un valore tipico della FFT della risonanza dei cantileverèè di circa 300 kHz. Scrivere questo valore di frequenza di risonanza nella sezione generale nel campo del centro freq e utilizzare una finestra freq.
    NOTA: Selezionare una potenza laser sufficientemente bassa da non saturare la lettura del misuratore e per avere distorsioni nella risposta a sbalzo e per non surriscaldare il campione.
  12. Fare clic sulla finestra di sintonizzazione a impulsi laser per utilizzare la modalità avanzata di risonanza. Scegli un centro di frequenza di 300 kHz, una gamma di accordatoria di 50 kHz e un ciclo di servizio del laser del 5%. Fare clic sull'acquisizione per spazzare la frequenza cardiaca del laser. Utilizzando il cursore nel grafico, regolare l'impulso laser alla frequenza della risposta meccanica dell'espansione termica del campione che assorbe la luce IR. Quindi, selezionare l'opzione PLL per monitorare la risonanza del contatto tra il campione e la mancia. Premere il pulsante zero nella finestra PLL e selezionare enable per tenere traccia della risonanza di contatto del suggerimento di esempio. Scegli un guadagno integrale I - 0,5 e il guadagno proporzionale P - 10. Chiudere la finestra.
  13. Aprire nuovamente la finestra di ottimizzazione e trovare la posizione del laser AIR per almeno 3 numeri d'onda corrispondenti alle principali bande di assorbimento del campione (amide banda I-II-III) e per almeno un numero d'onda per ogni chip del laser.
  14. Fare clic su Strumenti . Calibrazione dello sfondo IR Nuovofile . Nella finestra selezionare la regione spettroscopica di interesse (1800-1200 cm-1 per studiare campioni proteici); scegliere la stessa frequenza cardiaca determinata al punto 4.12 e un ciclo di servizio del 5%; clicca sull'acquisizione veloce e seleziona la velocità del laser, la gamma tipica per un laser a cascata quantistica è tra 20-500 cm-1. Fare clic su Acquisisci per misurare lo sfondo laser a iR. Questo spettro di fondo verrà utilizzato per la normalizzazione degli spettri localizzati su nanoscala misurati. Chiudere la finestra.
    NOTA: se non è disponibile una modalità avanzata laser e risonanza veloce, salta il passaggio 4.12 e seleziona gli spettri passo invece di velocizzare sia in background che nelle finestre di acquisizione degli spettri IR. Tuttavia, la sensibilità aggregata singola non sarà raggiunta.
  15. Nelle impostazioni degli spettri IR, scegliete una risoluzione dello spettro IR compresa tra 1 -4 cm-1 e un numero di co-medie di almeno 64x. Fare clic su Acquisisci per misurare uno spettro iR localizzato su scala nanometrica nella gamma proteica (1800-1200 cm-1).
  16. Per acquisire una mappa chimica risolta su nanoscala, selezionare l'opzione di imaging IR, scegliere un numero d'onda di interesse (ad esempio, 1655 cm-1 per la banda interna I) e fare clic sulla scansione nella finestra di scansione AFM.
  17. Una volta completata la mappatura, andare su file e salvare le misure. Per analizzare le mappe acquisite di morfologia, risonanza di contatto e chimica, nonché gli spettri localizzati su nanoscala, utilizzare il software di elaborazione delle immagini AFM integrato. Spectra e Immagini possono essere salvati come file .csv o .axz per un'ulteriore analisi dettagliata con software commerciale.

5. Elaborazione e analisi delle dimensioni trasversali

  1. Appiattire le immagini raw14,17,19,41,42,59 utilizzando il software di elaborazione delle immagini AFM incorporato o il software commerciale.
    NOTA: le aggregazioni devono essere mascherate dal calcolo per evitare artefatti di analisi e sottovalutazione della loro altezza misurata.
  2. Appiattire l'immagine per 0 ordine di adattamento sottrazione.
  3. Appiattire l'immagine in base al piano e quindi riga per riga in un ordine di regressione di 1st, il secondo passaggio viene ripetuto fino a raggiungere la linea di base piatta nel profilo di linea dell'immagine.
  4. Se il campione è molto affollato, contiene aggregati eccezionalmente elevati o l'artefatto dell'arco dello scanner è presente, appiattire l'immagine utilizzando l'adattamento dell'ordine di regressione 2nd.
  5. Misurare l'altezza e la larghezza aggregate da un profilo di linea preso perpendicolare all'asse fibrilla14,17,19,41,42,59.
  6. Misurare la lunghezza della fibrilla parallela all'asse fibrilla14,17,19,41,42,59.

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Risultati

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Nella figura 1 è illustrato un corso di tempo rappresentativo di aggregazione a 42, misurato dal saggio di fluorescenza ThT, nella Figura 1. Il processo di aggregazione è comunemente caratterizzato da una curva sigmoidale, in cui si osserva inizialmente una fase di ritardo, ed è seguito da una fase di crescita ripida, prima che la curva raggiunga un altopiano quando viene raggiunto uno stato stabile di equilibrio6,7 ,

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Discussione

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Il primo passo critico di questo protocollo è la preparazione di proteine monomeriche, come nel caso della soluzione A42 descritta nei passaggi 1.1 e 1.2. È essenziale avviare il processo di aggregazione da una soluzione monomerica altamente pura, in quanto la presenza di specie oligomeriche o aggregate può provocare una scarsa riproducibilità della cinetica di aggregazione58e indurre artefatti nell'AFM misurazioni (ad esempio, le specie di fibrillar saranno evidenti nelle fasi iniziali dell'aggre...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano la Fondazione nazionale svizzera per la scienza (SNF) per il sostegno finanziario (numero di sovvenzione P2ELP2_162116 e P300P2_171219), il programma Darwin College, Erasmus la ricerca che ha portato a questi risultati ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca nell'ambito del settimo programma quadro dell'Unione europea (FP7/2007-2013) attraverso la sovvenzione del CER PhysProt (numero di accordo 337969), la Newman Foundation (T.P.J.K.) e la Cambridge Centre for Misfolding Diseases (C.G., M.V. e T.P.J.K.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Sistema AFM-IRAnasys InstrumentsnanoIR 2 o 3Sistemi per la misura dell'espansione termica in modalità di contatto e risonanza
Corning 96-well Half Area Fondo nero/trasparente Polistirene NBS MicropiastraCorning3881
Corning Nastro sigillante in alluminio per micropiastreCorning6570
Dischi biadesiviAGAR ScientificAGG3347N
FLUOstar OmegaBMG Labtech415-101Platereader
Mica Disc 10mm V1AGAR ScientificAGF7013
Park NX10 Sistema AFMPark SystemsN/AMicroscopio a forza atomica
Platypus Chip d'oro ultrapiattoPlatypus TechnologiesAU.1000.SWTSG
PPP-NCHR-10 cantileverPark SystemsPPP-NCHR-10
Provette LowBind per proteine, 2,0 mLEppendorf30108132
Cantilever rivestiti in oro silicioAnasys InstrumentsPR-EX-nIR2
SPM Dischi per campioni 12mmAGAR ScientificAGF7001

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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