Il comportamento dell'edificio Nest come indicatore precoce dei deficit comportamentali nei topi

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per quantificare il comportamento di costruzione del nido nei topi, che è noto per essere alterato in diversi disturbi e malattie neurologiche. Questo protocollo esamina l'utilità di quattro materiali e offre l'opportunità di quantificare l'accordo sui tassi nel punteggio, migliorando la validità e l'affidabilità del saggio.

Abstract

La costruzione del nido è un comportamento innato nei roditori maschili e femminili, anche se allevati in ambienti di laboratorio. Come tale, molti ricercatori forniscono roditori materiali sintetici e/o naturali (come spago, tessuto, cotone, carta e fieno) come misuratore del loro benessere generale e come valutazione ausiliaria per prevedere il possibile declino della cognizione. In genere, le modifiche nei comportamenti di annidamento, ad esempio la mancata creazione di un nido, indicano una modifica nella salute o nel benessere. Inoltre, il comportamento di nidificazione è sensibile a molte sfide ambientali e fisiologiche, così come molte mutazioni genetiche alla base degli stati della malattia patologica. Il protocollo seguente descrive un paradigma di comportamento di annidamento che esplora l'utilizzo di quattro tipi di materiale di nidificazione. Inoltre, il protocollo utilizza correlazioni intraclassi per dimostrare che l'affidabilità inter-rater è maggiore quando i nidi sono costruiti in carta triturata rispetto ad altri materiali di nidificazione comuni come quadrati di cotone, torsioni di carta e pannocchia morbida biancheria da letto e coperte. La metodologia scelta e le considerazioni statistiche (cioè la correlazione intraclasse) per questo saggio possono essere interessanti per coloro che conducono esperimenti valutando la qualità della vita dei topi.

Introduzione

La costruzione del nido è un comportamento innato in molti animali come uccelli, pesci, roditori e grandi scimmie, e sta attirando più attenzione per la sua potenziale utilità nello studio di malattie neurologiche e disturbi caratterizzati da un benessere diminuito e attività della vita quotidiana¹. I topi, sia maschi che femmine, costruiscono nidi di dimensioni simili per scopi riproduttivi, conservazione del calore e riparo; ancora più importante, continuano a farlo anche se allevati nelle impostazioni di laboratorio². Hess, Petrovich e Goodwin³ sostengono che gli stimoli biologicamente appropriati sono fondamentali per indurre comportamenti biologicamente appropriati come la nidificazione; tuttavia, una varietà di materiali naturali e artificiali, come fieno, canapa, spago di cotone, strisce di carta, palline dentali di cotone e quadrati di cotone pressati, sono stati utilizzati per valutare il comportamento di costruzione del nido². I cambiamenti in questi comportamenti di nidificazione (cioè, la mancata creazione di un nido dal materiale fornito) in genere indicano un cambiamento nella salute o nel benessere. Nella maggior parte dei casi, la mancanza di costruzione di nidi è attribuita a diversi fattori che influiscono negativamente sul benessere. Tali esempi che hanno tutti effettivamente diminuito la qualità della costruzione del nido nei topi includono gli estremi di temperatura; stimolazione dolorosa; malattie e infezioni indotte; mutazioni genetiche; e lesioni cerebrali nelle aree preoptice mediali, setto, e ippocampo^4,5,6.

Il morbo di Alzheimer è una malattia neurodegenerativa progressiva caratterizzata da perdita di tessuto cerebrale, accumulo di placche extracellulari amiloidi-z e grovigli neurofibrillari intracellulari composti microtubuli iperfosforili proteine, tau⁷. Inoltre, il morbo di Alzheimer è caratterizzato, in particolare, da deficit nell'apprendimento e nella memoria e compromissione delle attività della vita quotidiana. Nei topi, le attività della vita quotidiana sono comunemente esaminate tramite la ruota circadiana^8,9,10,11, anche se nuove alternative, come la nidificazione, stanno crescendo in popolarità. La nidificazione ha dimostrato di essere sensibile alle manipolazioni (ad esempio, mutazioni genetiche, fattori di stress ambientale) che sono state identificate come fattori di rischio e/o cause del morbo di Alzheimer. Come tale, la nidificazione può essere utilizzata come un saggio aggiuntivo o complementare in molti ceppi murini che modellano quelle caratteristiche del morbo di Alzheimer. Ad esempio, Diacono e colleghi¹² hanno misurato la costruzione di nidi di topi Tg2576 con la proteina precursore dell'amiloide svedese (APPswe) e le mutazioni genetiche della presenilina 1 (PS1). La qualità dei nidi costruiti da topi Tg2576 ospitati in gruppo era significativamente peggiore rispetto ai controlli wildtype sia a 3 che a 12 mesi di età. In accordo con questi risultati, Filali et al.¹³ hanno riferito che i topi maschi APPswe/PS1 ospitati in modo singly sono stati dati due pezzi di 5 x 5 cm di cotone costruiti nidi significativamente più poveri come valutati su una scala da 1 a 5 (1 nido non toccato, 5 - un nido quasi perfetto). I topi transgenici costruivano costantemente nidi peggiori a 6, 9 e 12 mesi di età rispetto alle loro controparti wildtype, e in alcuni casi, i topi Appswe/PS1 non riuscirono completamente a costruire un nido con il cotone fornito.

Ricerche precedenti del nostro laboratorio hanno dimostrato che i topi wildtype C57BL/6J costruiscono nidi significativamente migliori dai quadrati di cotone rispetto ai topi CRND8 e CRND8/E4⁹. Tuttavia, la maggior parte degli esperimenti che utilizzano quadrati di cotone pressati sembrano essere variabili, con topi selvatici che non mostrano punteggi alti attesi rispetto ai topi transgenici che dovrebbero mostrare punteggi molto bassi nella nidificazione², che possono in parte portare a un mancanza di differenze nei parametri stimati (cioè differenze mediche) e di rilevanza statistica. La mancanza di differenze può essere dovuta in parte all'invecchiamento inadeguato dei topi o al tempo assegnato per la nidificazione. In alternativa, il materiale di nidificazione può essere una sfida aggiuntiva, con conseguente maggiore variabilità dovuta alle preferenze metodologiche dei ricercatori nella quantità e nel tipo di materiale, che può anche interagire con la deformazione del topo. Ad esempio, Robinson-Junker e colleghi¹⁴ hanno fornito materiale da letto trasformato o non lavorato di diverse dimensioni (ad esempio, piccoli o grandi fiocchi) ai topi C3H/HeNCrl e ai topi BALB/cAnNCrl, che sono comunemente osservati, rispettivamente, come poveri e forti costruttori di nidi. Quando sono stati forniti lenzuola non lavorati, i topi C3H hanno costruito nidi meno complessi, ma simili nei nidi di qualità rispetto a quelli dei topi BALB/c.  Allo stesso modo, Martin e colleghi¹⁵ hanno confrontato la complessità del nido di diversi materiali di nidificazione dati ai topi dei cervi, un lontano parente delle specie Mus musculus che hanno differenze evolutive distinte (cioè, più probabilità di scavare negli alberi e sottobosco e sono più attivi in cattività), ma ricevono cure allevamento simili a quelle dei comuni topi di laboratorio e costruiscono nidi da qualsiasi materiale morbido e fibroso disponibile^16,17,18.  Femmine e allevatori con cuccioli nella gabbia di casa costruiti nidi più complessi rispetto ai maschi, e gli autori suggeriscono che queste differenze comportamentali possono essere dovute a cambiamenti associati nelle concentrazioni di progesterone nei topi dei cervi¹⁵. Ancora più importante, i topi costruirono nidi più complessi composti da carta marrone seguiti da quadrati di cotone e cilindri di cotone, e i nidi meno complessi sono stati costruiti con carta bianca e quadrati di mini-cotone dispersi.

Nonostante la crescente popolarità della nidificazione, vengono discusse minimamente considerazioni riguardanti pratiche scientificamente valide, convenienti e sensibili al tempo. Date le suddette sfide metodologiche ed economiche, questo protocollo indaga l'utilità di diversi materiali di nidificazione - quadrati di cotone, torsioni di carta, carta triturata e biancheria da letto elaborata - nel comportamento di nidificazione. In particolare, abbiamo fornito tutti i materiali di nidificazione sia ai controlli wildtype C57BL/6J invecchiati che ai topi APOE e4 del morbo di Alzheimer al fine di studiare qualsiasi potenziale genotipo mediante interazioni materiali nella qualità della nidificazione. Inoltre, l'esperimento ha cercato di valutare l'affidabilità inter-rater dei nidi costruiti con materiali diversi. Nel loro insieme, questo protocollo dimostra la superiorità di un materiale di nidificazione in questo campione – carta triturata – in termini di qualità del nido e accordo tra i marcatori, con l'intento di migliorare la validità e l'affidabilità del saggio di nidificazione.

Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della George Mason University e sono conformi alle linee guida stabilite dalla valutazione e dall'accreditamento della cura degli animali di laboratorio.

1. Animali e considerazioni prima della valutazione

1. Per questo protocollo, utilizzare i topi adulti di tipo compreso tra 9 e 12 mesi C57BL/6J (n - 10) (stock - 000664) e topi APOE e4 (n - 11) da una croce a APOE e4 (stock #012307) emizigoa #006293 .
2. Nel locale di alloggio, topi di gruppo con lettiere dello stesso sesso con appropriato arricchimento (ad esempio, per questo protocollo, ai topi è stata fornita una ruota da corsa, un igloo e un piccolo giocattolo da masticare in nylon). Gruppo-house 4 - 6 topi femminili, e 4 maschi in una gabbia di casa 356 mm L x 485 mm W x 218 mm H.
   NOTA: I ricercatori possono prendere in considerazione l'idea di implementare strategie prima e/o dopo la nidificazione al fine di evitare l'aggressione al matto in gabbia quando i topi vengono reintrodotti dopo le prove di nidificazione. Tali strategie possono includere, ma non sono limitate a, la manipolazione giornaliera prima dei test comportamentali per acclimatare meglio i topi alla manipolazione durante i test comportamentali, i ricercatori e il personale^{dell'allevamento 19}, separando e alloggiando individualmente topi aggressivi, o riducendo il numero di topi nella gabbia di casa²⁰, a seconda della gravità dei combattimenti in gabbia, ferite osservate²¹, ecc.

2. Set-up della stanza e della nidificazione

1. Assicurarsi che ogni mouse completi quattro prove (1 materiale per prova). Randomizzare l'ordine di nidificazione del materiale per ogni mouse per evitare un effetto di ordine.
2. Preparare le gabbie in una sala prove separata. Condizioni ambientali record (ad es. 22,2 – 22,3 gradi centigradi, umidità del 45-47%, luci sulle 9:00 alle 21:00) in modo che siano coerenti in tutte le prove e siano identiche alla sala alloggi. Fornire cibo e acqua al libitum.
   1. Assegnare a ciascun mouse un numero o una lettera di identificazione casuale (ID). Fissare la scheda identificativo casuale a una gabbia da 29,2 x 18,4 cm.
   2. Registrare l'ID/tag animale originale e altre identificazioni necessarie in un registro della colonia per garantire che gli assistenti e il personale addetto agli animali rimangano ciechi alle condizioni.
3. Ordinare casualmente il posizionamento della gabbia nella sala prove in modo che i topi selvatici e transgenici non siano separati in modo inappropriato (cioè, sui lati opposti della stanza, su ripiani separati, ecc.).
4. Preparare i materiali di nidificazione coprendo sufficientemente il fondo della gabbia. Utilizzare circa 100 g di peso secco di biancheria da letto di pannocchia per la piazza, torsione, e triturato prove di carta, e circa 100 g della biancheria da letto pannocchia morbida per la prova di pannocchia morbida.
5. Se si utilizza un becher per disperdere il materiale di nidificazione, quindi riempire il becher non più di 100 mL con biancheria da letto di pannocchia o biancheria da letto pannocchia morbida.
6. Posizionare il primo materiale di nidificazione nella sequenza prima di introdurre il mouse nella gabbia. Questo protocollo utilizzava (1) un singolo quadrato di cotone pressato, (2) una singola torsione di carta, (3) 100g di fornina di pannocchia morbida solo (cioè, nessun ulteriore biancheria da letto o materiale di nidificazione aggiunto), e (4) 2,5 g di pulito (senza inchiostro), triturato carta bianca della stampante tagliata in strisce da 5 – 7 cm. Disperdere i materiali di nidificazione come illustrato nella Figura 1 (linea di base).

Figura 1: Impostazione della gabbia per ogni materiale. Tutti i topi hanno completato una prova con ogni tipo di materiale per un totale di quattro prove. La biancheria da letto di nodia fiancheggiava l'intero fondo delle gabbie contenente una torsione di carta, un quadrato di cotone premuto e carta triturata. La morbida biancheria da letto di pannocchia è stata uniformemente dispersa in tutta la gabbia per incoraggiare i topi a separare i piccoli quadrati di cotone dalla pannocchia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Prova di nidificazione

1. Iniziare la prima prova di nidificazione alla stessa ora del giorno all'inizio del ciclo di luce (ad esempio, 9:00 AM).
2. Portare la gabbia di casa contenente i topi nella sala prove. Rimuovere ogni mouse dalla gabbia di casa e posizionarlo nella gabbia di nidificazione assegnata con il materiale già collocato nella gabbia. Riportare le gabbie di casa alla sala housing.
3. Consentire ai topi di completare 1 prova per 24 h indisturbati.
4. 24 h dopo l'inizio della prima prova, tornare alla sala prove.
5. Rimuovere con attenzione il coperchio della gabbia e fotografare il nido di ogni topo, catturando l'ID assegnato nella fotografia e riducendo al minimo l'aspetto di qualsiasi materiale al di fuori della gabbia.
   NOTA: Attendere che il mouse si sposti fuori dal nido prima di tentare di rimuoverlo dalla gabbia. Si consiglia vivamente di fotografare il nido mentre il mouse è nella gabbia ma fuori dal nido. Il tentativo di rimuovere il mouse dalla gabbia prima di fotografare può potenzialmente causare l'avvistamento del mouse, muovendosi così sopra i materiali di nidificazione e disperdi.
6. Rimuovere delicatamente il mouse dalla gabbia di nidificazione e inserirlo in una gabbia di detenzione temporanea. Smaltire la biancheria da letto e gli eventuali materiali di nidificazione, sostituire la biancheria da letto e fornire il materiale di nidificazione successivo nella sequenza e riportare il mouse alla gabbia di nidificazione.
7. Ripetere se necessario per ottenere i punteggi per tutte e 4 le prove. Si raccomanda di utilizzare carta triturata e i criteri di punteggio di accompagnamento, anche se i ricercatori possono essere interessati a utilizzare i materiali alternativi discussi in questo protocollo.
8. Quando tutte le prove sono complete, riporta i topi alle loro gabbie di casa. Osservare i topi per qualsiasi potenziale comportamento aggressivo. L'aggressione può verificarsi nei maschi selvatici più anziani.
   NOTA: Ai fini di questo protocollo, i topi sono stati testati una volta a circa 9 – 12 mesi di età. La nidificazione deve essere condotta in diverse età (cioè, in età più precoce, a seconda del ceppo scelto, prima dell'insorgenza di tratti fenotipici) per documentare la diminuzione della capacità di nidificazione nel tempo e dimostrare il probabile ruolo causale della neurodegenerazione.

4. Punteggio e valutazione dell'affidabilità degli inter-rater

1. Fornisci immagini di base per ogni materiale di nidificazione ad almeno 2 individui che non sono all'occhiesi per lo studio. Anche se non è obbligatorio, assicurarsi che i marcatori abbiano familiarità con il concetto di nidificazione. Quando si allenano i marcatori, fornire una serie di nidi di esempio (ad esempio, Figura 2 per la carta triturata) per familiarizzare i marcatori con ogni tipo di materiale (se applicabile) e i criteri di punteggio.
   1. Valutare ogni nido su una scala da 1 a 5 utilizzando le seguenti informazioni sulla scala (adattate da Diacon, 2006)². Vedere Figura 2 come punteggio di esempio utilizzando carta triturata.
   2. Assegnare un punteggio di 1 quando la carta triturata o piccoli quadrati sono rimasti sparsi in tutta la gabbia, o il quadrato di cotone o torsione è rimasto intatto;
   3. Assegnare un punteggio di 2 quando parte del materiale è stato costruito in un nido, ma oltre il 50% del materiale non è stato utilizzato per la costruzione del nido (cioè, è rimasto disperso o la maggior parte del materiale originale è rimasto intatto);
   4. Assegnare un punteggio di 3 quando un nido evidente è stato costruito, ma diversi pezzi erano ancora sparsi;
   5. Assegnare un punteggio di 4 quando quasi tutto il materiale è stato utilizzato per il nido, ma pochi pezzi di materiale sono rimasti sparsi o erano vicino al nido;
   6. Assegnare un punteggio pari a 5 quando tutto il materiale è stato utilizzato per creare un nido identificabile.
      NOTA: I marcatori dovrebbero fare pause e rivisitare le foto della linea di base al fine di evitare affaticamento e distorsione durante la procedura di punteggio. I marcatori non dovrebbero discutere i punteggi tra loro per evitare pregiudizi. I marcatori devono discutere i punteggi dopo che il punteggio è completo, o se sono necessarie ulteriori discussioni per modificare i punteggi, che possono potenzialmente risolvere i problemi con le correlazioni intraclassi (ICC). Le correlazioni intraclassi verranno eseguite seguendo i passaggi elencati nella sezione 4.2.

Figura 2: Esempio di punteggio utilizzando i criteri per la carta triturata, il materiale preferito. Da sinistra a destra: 1 – la carta triturata è rimasta intatta; 2 – parte della carta è stata costruita in un nido, ma la maggior parte dei pezzi è rimasta dispersa; 3 – fu costruito un nido evidente, ma erano ancora sparsi diversi pezzi; 4 – la maggior parte dei pezzi sono stati utilizzati per il nido, ma alcuni pezzi sono stati sparsi vicino al nido; 5 – tutti i pezzi sono stati utilizzati per fare il nido. Si noti che nelle fotografie, il numero assegnato all'animale viene visualizzato per evitare di staccarle. Il colore della carta è casuale. I ricercatori dovrebbero permettere al topo di rimanere nella gabbia per evitare di spaventare il topo, che potrebbe potenzialmente disperdere il nido. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Raccogliere e inserire punteggi e formattare il file di dati in modo che i punteggi di ogni marcatore per ogni materiale siano in colonne separate.
   NOTA: Se si utilizza il file supplementare 1, si prega di notare che lo script di codifica per questa analisi richiede software open source gratuiti (ad esempio, pacchetto irr in RStudio)^22,23. Lo script rimuove le intestazioni e le variabili dell'oggetto (ad esempio, la riga superiore e gli ID animale) per eseguire la correlazione intraclasse (ICC). Eseguire lo script per condurre un accordo bidirezionale, accordo, medie misure ICC evidenziando la sezione delimitata del codice e premendo Ctrl , Invio o Comando .
3. Confrontare la^CPIcon i criteri esistenti 24^,25,26. In genere, i valori ICC superiori a 0,80 corrispondono a una forte affidabilità tra i tassi, giustificando la media dei punteggi in un determinato momento (File supplementare 2).
4. Utilizzare gli stessi criteri ICC per l'affidabilità intra-rater, che può essere di interesse per coloro che conducono punteggio per la prima volta.
   AVVISO: i punteggi devono segnare gli stessi nidi fotografati entro una settimana dalla valutazione iniziale. Procedere con cautela con la media dei dati quando ICC è basso, in quanto ciò potrebbe inclinare i dati o produrre risultati nulli. Se i valori ICC sono bassi, potrebbe essere necessaria (1) formazione aggiuntiva per i punteggi, (2) i punteggi possono essere necessari per discutere il loro ragionamento per i punteggi del nido, (3) potrebbe essere necessario un altro revisore indipendente per effettuare una chiamata di giudizio per quanto riguarda i punteggi, o (4) intra-rater potrebbe essere necessario valutare l'affidabilità. Se l'affidabilità intra-rater è scarsa, potrebbe essere necessario un addestramento aggiuntivo o un marcatore diverso.

5. Considerazioni statistiche

1. Condurre analisi statistiche, a seconda dei casi. Per i dati che non violano i presupposti di normalità ma utilizzano più materiali per ogni topo (ad esempio, un effetto all'interno dei soggetti), utilizzare un'analisi mista della varianza (ANOVA).
   1. Se si utilizzano codici forniti come file supplementari, si prega di scaricare ulteriori pacchetti aggiuntivi che sono specificati nello script^27,28,29,30.
   2. Se si esegue un ANOVA misto utilizzando lo script fornito, eseguire lo script per convertire qualsiasi file di dati in formato wide in formato lungo (ad esempio, anziché variabili ripetute tra le colonne, convertire le celle da ripetere tra le righe). Un file di dati di esempio è incluso in questo manoscritto per dimostrare come convertire un file di dati da formato wide a long-format.
   3. Condurre l'Oggetto ANOVA misto, come specificato nello script. Si noti che se il test di Mauchly di Sphericity viene violato, quindi implementare i fattori di correzione come la correzione Greenhouse-Geisser.
   4. Eseguire tutti i test posthoc necessari per esaminare le differenze tra i fattori con più di 2 livelli, come specificato nello script di codifica. In questo esempio, eseguire test posthoc Bonferroni per confrontare i diversi tipi di materiale di nidificazione.
      NOTA: Se si utilizza un solo materiale di nidificazione, non incorporare un fattore all'interno dei soggetti. Se la raccolta dei dati in più punti temporali, tuttavia, incorporare queste misure ripetute come se i livelli di un fattore all'interno dei soggetti.
      NOTA: In alcuni casi, i topi selvatici possono avere punteggi perfetti e quindi mostreranno un effetto soffitto, portando ad una distribuzione non normale². Considerare test statistici appropriati (ad esempio, test non parametrici con misure alternative di tendenza e dispersione centrale), metodi di normalizzazione o approcci robusti (modellazione di effetti misti per misure ripetute) durante l'analisi dei dati.

Risultati

I risultati dei quattro diversi materiali di nidificazione forniti ai topi wildtype e APOE e4 sono spiegati come segue. Sulla base dei criteri esistenti, la Corte penale internazionale ha mostrato un forte accordo tra tutti e tre i programmatori per tutti e quattro i materiali di nidificazione (carta triturata ICC - 0,94; iCC quadrato - 0,91; biancheria da letto ICC - 0,87; torsione ICC - 0,87); pertanto, i tre punteggi sono stati mediati insieme per creare un singolo punteggio per ogni materiale fornito. Un ANOVA misto 2 x 4 ha prodotto un effetto principale significativo del genotipo, F(1, 19) - 31,30, p < 0,01, sp² - 0,62. Tra tutti e quattro i materiali forniti, i topi wildtype hanno ottenuto un punteggio più elevato sulla qualità del nido (3,18 x 0,20) rispetto ai topi APOE e4 (1,98 x 0,16). Inoltre, l'ANOVA mista ha prodotto un effetto principale significativo del materiale, F(3, 57) , 57,48, p < 0,01, sp² - 0,75. I confronti a coppie con la correzione di Bonferroni hanno mostrato che la carta triturata (4,11 x 0,20) è stata valutata in modo significativamente superiore(p < 0,05) in termini qualitativi rispetto al quadrato (1,95 0,21), biancheria da letto (2,21 x 0,21) o materiale di torsione (1,94 x 0,20), senza differenze osservate tra i materiali quadrati, da letto e torsione (tutti p > 0,99). Non c'è stata un'interazione significativa tra genotipo e materiale. I dati sono illustrati nella Figura 3.

Altri esperimenti del nostro laboratorio hanno prodotto risultati simili in modelli a esordio precoce della malattia di Alzheimer. Ad esempio, come dimostrato nella Figura 4, 5,5 mesi-vecchio P301L rTg4510 (htau) topi costruiti significativamente più cattivi nidi di carta triturata rispetto alle loro controparti wildtype corrisponde all'età³¹. Allo stesso modo, due topi J20 (hAPP)/htau e single htau hanno costruito nidi più poveri di carta triturata rispetto alle loro controparti solo a basso tipo e CAMKIIa-promotrici, sia a 3,5- che 7 mesi di età³² (dati non mostrati).

Figura 3: Qualità nominale dei nidi realizzati con materiali diversi forniti ai topi wildtype e APOE e4. Un effetto principale del genotipo (p < 0,01) ha dimostrato che i topi selvatici costruivano costantemente nidi migliori fatti con la carta triturata, i quadrati di cotone pressati, la torsione della carta e la biancheria da letto morbida rispetto ai topi APOE e4. L'effetto principale del materiale (p < 0,01) ha dimostrato inoltre che i nidi costruiti con la carta triturata sono stati valutati di qualità superiore rispetto agli altri tre materiali. La carta triturata aveva la più alta misura di affidabilità inter-rater valutata dalla CPI. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Nidi dicarta triturati costruiti per topi selvatici e htau, su acqua di zinco o da parte di gofusa. (A) Nidi rappresentativi costruiti da topi selvatici e htau di 5,5 mesi, sull'acqua di controllo (tap) o con 10 parti per milione zinco (un biometallo implicato nella malattia di Alzheimer). I nidi sono stati segnati sulla scala da 1 a 5 utilizzando i criteri specificati. Da sinistra a destra: wildtype : acqua di zinco (4,54-0,52); wildtype : acqua di controllo (4,15-0,80); htau - acqua di controllo (3,08 x 0,64); htau - acqua di zinco (2,46-0,97). (B) Un'interazione genotipo-acqua ha dimostrato che i topi htau sull'acqua di zinco hanno costruito nidi significativamente peggiori rispetto agli altri gruppi ( . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Inoltre, semplici effetti hanno mostrato che i topi htau sull'acqua di zinco costruivano nidi peggiori rispetto ai topi htau sull'acqua di controllo. Topi wildtype su acqua di controllo e zinco nidi costruiti ad acqua di qualità superiore e simile, rispetto ai loro omologhi htau. Ristampato dal Journal of Alzheimer's Disease, Vol 64, Craven, KM, Kochen WR, Hernandez CM, Flinn JM, lo zinco esacerba Tau Pathology in un modello di topo Tau, 671-630, Copyright (2018), con il permesso di IOS Press³¹. La pubblicazione è disponibile su IOS Press tramite http://dx.doi.org/10.3233/JAD-180151. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare 1: File di codifica supplementare: annidamento. R Fare clic qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: AD Studio nidificazione scores.csv Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussione

La nidificazione è un comportamento di roditore di importanza evolutiva ed è stata utilizzata per valutare l'attività della vita quotidiana e del benessere generale nei topi². La facilità di condurre il test, la sua affidabilità e la sua validità facciale rendono la nidificazione un complemento pratico a molti test comportamentali come la tana, il ritmo circadiano e la toelettatura. Ma, man mano che la nidificazione diventa più comunemente utilizzata in laboratorio, le varie combinazioni per condurre, quantificare e interpretare la nidificazione aumentano. Di conseguenza, sono necessarie ulteriori ricerche per esplorare le migliori procedure metodologicamente e praticamente valide per la nidificazione, in modo che la validità e l'affidabilità del saggio non siano sacrificate per i costi, il tempo di test e altre procedure che riducano l'onere dei test .

La qualità dell'edificio del nido è infatti sensibile al tipo di biancheria da letto fornita e al genotipo. Nel complesso, i topi wildtype hanno costruito nidi significativamente migliori rispetto ai topi APOE e4 indipendentemente dal materiale di nidificazione; tuttavia, sia i topi wildtype che APOE e4 costruiscono nidi di qualità significativamente più alti dalla carta triturata rispetto agli altri tre materiali di nidificazione. Altri studi forniscono prove corroboranti per quanto riguarda la carta triturata: topi costruiti nidi più complessi da strisce di carta triturate che con quadrati di cotone pressato, tessuto e biancheria da letto di pioppo³³. Inoltre, i nidi costruiti con strisce di carta triturate sono stati valutati qualitativamente come più "naturalistici" di quelli di altri materiali, caratterizzati dalla forma del nido stesso e dall'altezza delle pareti intorno alla cavità del nido in per formare una cupola^6,33. Come tale, la selezione di materiale adeguato per questo saggio è fondamentale al fine di osservare meglio il comportamento naturale in un ambiente relativamente controllato, cioè l'impostazione di laboratorio. Ancora più importante, anche se questo protocollo ha valutato la nidificazione una volta a 9 – 12 mesi di età, sottolineiamo che la nidificazione dovrebbe essere condotta in diverse età. La semplicità di questo protocollo permette di essere condotto più volte, idealmente prima dell'insorgenza di deficit che accompagnano la neurodegenerazione. Le misurazioni ripetute offrono l'opportunità di documentare il probabile ruolo causale della neurodegenerazione nella capacità di nidificazione diminuita.

La costruzione naturale del nido è stata dimostrata differire tra i topi di diversi ceppi di fondo³⁴, e come tale, la qualità complessiva e la forma del nido possono differire non a causa del transgene di interesse, ma a causa della tensione di fondo. Ad esempio, gli antenati dei topi C57BL/6 erano considerati nidi "foro", mentre gli antenati dei topi BALB/C erano considerati nidi "superficie"³⁵. I topi sullo sfondo C3H o croci con questo ceppo, come l'ibrido C3H/He-C57BL/6 con E4 utilizzato in Graybeal et al.⁹ sono anche considerati poveri nidificatori; pertanto, i ricercatori dovrebbero prendere in considerazione l'uso di topi di controllo sullo stesso sfondo dei topi transgenici, che nel complesso migliorerebbero il ruolo diretto e causale dei transgeni, piuttosto che dello sfondo, nella neurodegenerazione e nei successivi deficit nel nido comportamento di costruzione.

Alcuni esperimenti spesso utilizzano un singolo marcatore per giudicare qualitativamente la complessità del nido; tuttavia, facciamo l'argomento per includere più marcatori, e, cosa più importante, marcatori ciechi a condizioni sperimentali. Attraverso questo approccio, abbiamo utilizzato tre marcatori ciechi indipendenti e una correlazione intraclasse per valutare l'accordo tra i marcatori, che, con la formazione di base, hanno prodotto elevate correlazioni intraclassi che erano indicative di elevata affidabilità inter-tasso e un forte accordo per quanto riguarda la qualità del nido. Inoltre, decine di nidi composti da carta triturata e quadrati di cotone avevano le più alte correlazioni intraclassi, un'indicazione di maggiore accordo e una maggiore coerenza tra i marcatori. Il forte accordo fornisce anche una giustificazione per calcolare la media dei punteggi multipli insieme, una strategia attuata a casaccio nella ricerca comportamentale. Anche se questa strategia richiede più individui e, presumibilmente, più tempo per segnare i nidi, riduce efficacemente il pregiudizio nelle valutazioni qualitative come la nidificazione.

I materiali di nidificazione utilizzati in questo saggio erano approssimativamente uguali nel prezzo ad eccezione della morbida biancheria da letto di pannocchia. La biancheria da letto commerciale per la nidificazione può essere economicamente intraprendente per alcuni sperimentatori; tuttavia, Martin et al.¹⁵ notare che i quadrati di cotone, rispetto ad altri materiali come la carta sgualcita, è uno dei materiali più costosi disponibili per l'acquisto. Ciò può essere dovuto alla facile disponibilità, stoccaggio e amministrazione, ma altri ricercatori possono optare per materiali altrettanto validi e affidabili, soprattutto se contestati da un gran numero di animali in una struttura, il numero di prove di nidificazione, le restrizioni di tempo per nidificazioni di punteggio e costi elevati delle gabbie. Pertanto, la carta triturata può essere un'opzione più fattibile e appropriata. Inoltre, l'acquisizione dei dati per il nostro metodo può essere condotta immediatamente (cioè, il punteggio di persona), anche se le fotografie dovrebbero essere altamente considerate al fine di registrare, salvare e ri-quantificare i nidi, se lo si desidera ai fini della valutazione tra e in-rater affidabilità in momenti successivi. Come notato, sottolineiamo con forza l'inclusione di più marcatori per pratiche di "test, ri-test" per valutare l'accordo, poiché queste procedure metodologicamente solide sono spesso trascurate.

In conclusione, riteniamo che la metodologia e le considerazioni statistiche (cioè la correlazione intraclasse) per questo saggio possano essere interessanti per esperimenti che valutano la qualità della vita, il benessere generale e le attività della vita quotidiana nei topi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Lettiera per pannocchie di mais	Envigo	7092	1/8 in lettiera per quadrati di cotone, carta sminuzzata e prove di torsione della carta
Quadrati di cotone	Envigo	Iso-Blox
Diamond Twists	Envigo	7979C.CS	Torsioni di carta utilizzate nel protocollo
Topo - APOE4 e4	Jackson Laboratories	#012307	Topo omozigote APEO4 e4 allevato con il topo
Topo - C57BL/6J	Jackson Laboratories	#000664	Mouse wildtype per controlli
Mouse - J20	Jackson Laboratories	#006293	Topo emizigote allevato con il mouse omozigote APOE e4 per generare un incrocio
Rstudio	R Core Team	V1.1.463	Run with R version 3.5.3 (2019-03-11) -- "Great Truth". Nota: i pacchetti R aggiuntivi sono inclusi nel codice fornito e possono essere installati da CRAN
Soft Cob	Envigo	7087C