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Articolo metodologico

Isolamento di popolazioni di neuroni specifici da nematode Caenorhabditis elegans

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⸱

DOI:

10.3791/60145

⸱

6 agosto 2019

 ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Nebraska, 2Nebraska Redox Biology Center, University of Nebraska, 3Nebraska Center for Integrated Biomolecular Communication, University of Nebraska, 4Fred & Pamela Buffett Cancer Center, University of Nebraska Medical Center

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per un semplice isolamento di specifici gruppi di cellule neuronali vive che esprimono proteine fluorescenti verdi dalle linee transgeniche di Caenorhabditis elegans . Questo metodo consente una varietà di studi ex vivo focalizzati su neuroni specifici e ha la capacità di isolare le cellule per ulteriori colture a breve termine.

Abstract

Durante il processo di invecchiamento, molte cellule accumulano alti livelli di danni che portano alla disfunzione cellulare, che sta alla base di molte condizioni geriatriche e patologiche. I neuroni post-mitotici rappresentano un tipo di cellula principale interessato dall'invecchiamento. Anche se esistono più modelli di mammiferi di invecchiamento neuronale, sono impegnativi e costosi da stabilire. Il nematode Caenorhabditis elegans è un potente modello per studiare l'invecchiamento neuronale, in quanto questi animali hanno una breve durata di vita, una cassetta degli attrezzi genetica robusta disponibile e un sistema nervoso ben catalogato. Il metodo qui presentato consente di un isolamento senza soluzione di continuità di cellule specifiche basato sull'espressione di una proteina fluorescente verde transgenica (GFP). Le linee animali transgeniche che esprimono GFP sotto distinti promotori tipo di cellule sono digerite per rimuovere la cuticola esterna e disturbati delicatamente meccanicamente per produrre liquami contenenti vari tipi di cellule. Le cellule di interesse vengono quindi separate dalle cellule non bersaglio attraverso lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza o da perline magnetiche ad accoppiamento anti-GFP. Le cellule isolate possono quindi essere coltivate per un tempo limitato o immediatamente utilizzate per analisi ex vivo specifiche per cellula, come l'analisi trascrizionale tramite PCR quantitativa in tempo reale. Pertanto, questo protocollo consente un'analisi rapida e robusta delle risposte specifiche delle cellule all'interno di diverse popolazioni neuronali in C. elegans.

Introduzione

Nel corso degli ultimi decenni, l'organismo modello metazoano Caenorhabditis elegans è stata una risorsa enorme nello studio dei neuroni, circuiti neuronali e il suo ruolo nelle risposte fisiologiche e comportamentali, e neurodegenerative associato all'invecchiamento Malattie. Una caratteristica unica di C. elegans è che gli animali sono trasparenti, permettendo il lignaggio di tutte le cellule somatiche adulte da mappare1. C. elegans ospita anche una quantità gestibile di neuroni, portando alla morfologia e alla connettività del sistema nervoso ben comprese2. Il lignaggio cellulare invariante, breve durata della vita, e l'abbondanza di strumenti genetici ad alto throughput disponibili per C. elegans lo rendono un organismo modello ideale per lo studio dell'invecchiamento all'interno di diverse popolazioni neuronali.

L'invecchiamento dei neuroni e disturbi neurodegenerativi sono complessi, e ogni disturbo ha firme patologiche uniche associate ad esso. Tuttavia, per molti di questi disturbi, come il morbo di Parkinson e di Alzheimer, una caratteristica comune è il carico progressivo di proteine piegate in modo non corretto3,4,5. In entrambe queste malattie, le proteine si piegano in modo equilone e si aggregano all'interno della cellula per causare tossicità, portando infine alla morte cellulare4,5. Per il corretto invecchiamento dei neuroni, l'omeostasi dei mitocondri, più specificamente proteina omeostasi, è importante, in quanto le perturbazioni e la dishomeostasi possono portare alla neurodegenerazione6,7,8. Le cellule sono dotate di vari meccanismi per mantenere l'omeostasi proteica, uno dei quali è la risposta delle proteine spiegata (UPR), un percorso classico in cui i segnali provenienti da reticolato endoplasmico (ER) attivano le cascate di segnali intracellulari, portando ad una risposta9. In forma diquesto UPR ER, i metazoi mostrano una risposta simile alla perdita di omeostasi delle proteine mitocondriali, la cosiddetta UPR mitocondriale (UPRmt)7,8. C. elegans sembra essere l'organismo più basale ad avere un percorso UPRmt confermato e ben definito7.

La funzione/disfunzione di specifiche popolazioni neuronali all'interno di una rete più ampia può essere difficile da valutare a causa della loro connettività intrinseca e complessità3. Tuttavia, c'è spesso la necessità di studiare popolazioni neuronali distinte a causa di malattie specifiche del tipo di cellula con patologie complesse, come quelle associate all'omeostasi delle proteine cellulari alterate. In C. elegans,specifiche popolazioni neuronali possono essere geneticamente manipolate permettendo una facile osservazione in vivo. Il sistema nervoso di C. elegans è costituito principalmente da neuroni, con una piccola percentuale di cellule gliali. Nei vermi di ermafrodite adulti, ci sono circa 302 neuroni, suddivisi in oltre 100 classi diverse2,10. Neuroni come neuroni colinergici predominano nelle giunzioni neuromuscolari, mentre i neuroni dopaminergici sono principalmente coinvolti nella sensazione10,11. Poiché sia l'attività motoria che le capacità sensoriali diminuiscono con l'età, è importante dettagliare le intuizioni meccanicistiche sui difetti in questi singoli neuroni11,12. Come tale, vi è la necessità di un metodo semplice e robusto per isolare le cellule intatte di interesse per i successivi studi ex vivo.

Qui, descriviamo un metodo efficace ottimizzato per il rapido isolamento di specifiche cellule neuronali che esprimono proteine fluorescenti verdi (GFP) da C. elegans. Questo metodo di isolamento può essere eseguito su vermi larvali, giovani o adulti. L'isolamento delle cellule dai vermi larvali è stato precedentemente pubblicato da . Una nota importante qui è che tutti i vermi devono essere allo stesso stadio di vita per evitare una digestione eccessiva dell'animale o contaminazione da animali in diverse fasi di vita. Attraverso la rottura sia enzimatica che meccanica della cuticola nematode, un esoscheletro alto nel collagene e in altre proteine strutturali, un'ampia varietà di cellule può essere isolata13,14. Le cellule possono quindi essere isolate tramite citometria di flusso o anticorpi etichettati perline magnetiche. Tipicamente, l'RNA è isolato tramite un fenolo e un metodo isothiocyanato di fenidine per garantire l'arricchimento della popolazione cellulare desiderata15. Con molta cura queste cellule isolate possono essere mantenute in un flacone di coltura o piatto multi-bene. Questo metodo rappresenta uno strumento unico e potente nello studio di neuroni specifici e ha la capacità di isolare le cellule vive e funzionali per un'ulteriore coltura.

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Protocollo

1. Preparazione e raccolta di vermi invecchiati per l'isolamento cellulare

NOTA: Di seguito è spiegato l'isolamento dei neuroni colinergici dal ceppo transgenico unc-17::GFP (OH13083) ottenuto dal deposito di ceppo Caenorhabditis Genetics Center (CGC) presso l'Università del Minnesota. È imperativo mantenere condizioni sterili per prevenire la contaminazione da funghi o batteri.

  1. Preparare e sincronizzare i worm tramite il metodo di sbiancamento come descritto da T. Stiernagle16. Per gli esperimenti di invecchiamento, piastre piastre di piastre di crescita del nematode (NGM) contenenti una soluzione d'acqua di fluorodeoxyuridina (FuDR) per ridurre la produzione di uova e arrestare la cova delle uova. Ispezionare regolarmente le piastre di agar per evitare la contaminazione o la schiusa delle uova in quanto ciò causerà risultati inaffidabili.
    NOTA: Per le celle unc-17::GFP, in genere tre piastre NGM da 100 mm x 15 mm vengono utilizzate per isolare una quantità sufficiente di celle di interesse16.
  2. Raccogliere i worm e preparare i buffer per l'isolamento delle celle.
    1. Raccogliere i vermi in un tubo conico da 15 mL. Lavare i vermi dalla piastra con 1,5 mL di m9 buffer (1 mM MgSO4, 85 mM NaCl, 42 mM Na2HPO4, 7H2O, 22 mM KH2PO, pH 7.0) e centrifuga per 5 min a 1.600 x g. Scartare vermi supernatali e lavare i vermi con 1 mL di tampone M9. Ripetere la centrifugazione e lavare per un totale di cinque volte per rimuovere quanto più possibile la contaminazione da E. coli.
      NOTA: l'aggiunta di antibiotici (50 g/mL), come l'ampicillina, in questa fase può aiutare a ridurre la contaminazione batterica.
    2. Per due campioni, preparare 2 mL di solfato di sodio-dithiothreitol (SDS-DTT) buffer di lisi: 200 mM DTT, 0.25% (w/v) SDS, 20 mM HEPES (pH 8.0) e 3% (w/v) di saccarosio.
    3. Preparare 15 mL di buffer di isolamento (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM HEPES [pH 7.3]) e memorizzarlo su ghiaccio.
      NOTA: sia il buffer di lisi SDS-DTT che il buffer di isolamento devono essere resi freschi prima di ogni esperimento.
  3. Interruzione della cuticle e isolamento di una singola cellula
    1. Centrifuga animali raccolti al punto 1.2.1 per 5 min a 1.600 x g. Rimuovere tutti i vermi supernatali e sospendere in 1 mL di supporti M9 e trasferire a tubo di microcentrifuga da 1,5 mL.
    2. Vermi pellet con centrifugazione a 1.600 x g per 5 min.
    3. Aggiungere 200 l di tampone di lisi SDS-DTT ai vermi e incubare per 5 min a temperatura ambiente (RT). I vermi dovrebbero apparire "strabiliati" lungo il corpo se visti al microscopio leggero.
      NOTA: l'esposizione prolungata al buffer di lisi SDS-DTT può causare la morte di vermi, che può essere monitorata osservando i vermi. I vermi che sono morti si allungano e non si arricciano.
    4. Aggiungere 800 l di cuscinetto di isolamento a freddo ghiaccio e mescolare scando delicatamente il tubo.
    5. Vermi pellet per 1 min a 13.000 x g a 4 gradi centigradi, rimuovere supernatali e lavare con 1 mL di buffer di isolamento.
    6. Ripetere il passaggio 1.3.5 per un totale di cinque volte, rimuovendo con attenzione il buffer di isolamento ogni volta.
    7. Aggiungere 100 ll di miscela di proteasi da Streptomyces griseus (15 mg/mL) (Tabella dei materiali) sciolto nel buffer di isolamento al pellet e incubare per 10-15 min a RT.
      NOTA: Come per il buffer di lisi SDS-DTT, la digestione estesa della proteasi può comportare un'eccessiva scissione delle proteine lungo la membrana plasmatica, impedendo l'isolamento della GFP esposta in superficie tramite perline magnetiche.
    8. Durante l'incubazione con miscela di proteasi, applicare un'interruzione meccanica con il pipetting di campioni su e giù contro il fondo del tubo di microcentrifuga da 1,5 ml con una punta di micropipetta da 200 litri per 60-70 volte. Tenere la punta della pipetta contro la parete del tubo di microcentrifuga con una pressione costante per dissociare correttamente le cellule.
    9. Per determinare lo stadio di digestione, togliete un piccolo volume della miscela di digestione, rilasciatelo su un vetrino di vetro e ispezionatelo utilizzando un microscopio a coltura dei tessuti. Dopo 5/7 min di incubazione, i frammenti di vermi dovrebbero aver ridotto visibilmente la cuticola e un liquame di cellule sarà prontamente visibile.
    10. Reazione di stop-halt con 900 L di Leibovitz freddo Di lei-15 medio integrato con 10% siero bovino fetale (FBS) e penicillina-streptomicina (concentrazione finale a 50 U/mL penicillina e 50 g/mL streptomicina).
    11. Pellet ha isolato frammenti e cellule per centrifugazione per 5 min a 10.000 x g a 4 gradi centigradi. Lavare le celle pellettate con 1 mL di supporti freddi integrati l'L-15 due volte di più per garantire che i detriti in eccesso e la cuticola vengano rimossi.
    12. Risospendere le cellule pellettate in 1 mL di supporti integrati con L-15 e lasciare sul ghiaccio per 30 min. Prendere lo strato superiore, circa 700-800, in un tubo di microcentrifuga. Questo strato contiene cellule senza detriti cellulari e verrà utilizzato nel successivo isolamento delle cellule di interesse.
    13. Seguendo le istruzioni del produttore, utilizzare un contatore cellulare automatico o un emocitometro per misurare la densità cellulare di 10/25 -L di cellule isolate.

2. Isolamento delle cellule GFP-positive tramite citometria di flusso o perline magnetiche anti-GFP

NOTA: Esistono due metodi che possono essere implementati per isolare tipi di cella specifici. Il primo metodo consiste nell'utilizzare lo smistamento delle cellule attivato dalla fluorescenza (FACS), mentre il secondo metodo utilizza perline magnetiche coniugate ad anticorpi per far nascere cellule distinte che esprimono distinte proteine localizzate dalla membrana plasmatica. Quest'ultimo metodo richiede la localizzazione di GFP alla membrana plasmatica, essendo quindi disponibile per l'interazione con il tallone magnetico accoppiato agli anticorpi.

  1. Isolamento delle cellule GFP-positive per citometria di flusso
    1. Dalla sospensione a cellule isolate raccolta al punto 1.3.12, centrifugare le cellule per 5 min a 10.000 x g a 4 gradi centigradi. Scartare le cellule supernatali e sospendere le cellule pellettate nel mezzo con federato L-15 a una densità cellulare non superiore a 6 x 106 celle/mL per evitare di sovraccaricare il citometro di flusso.
    2. Ordina le celle in base all'espressione gFP positiva utilizzando un citometro di flusso in grado di ordinare i campioni. Le celle negative da GFP possono essere utilizzate come controllo per l'analisi specifica del tipo non di cella.
      NOTA: Come accennato in precedenza, un approccio alternativo per isolare le cellule positive GFP può essere utilizzato se la proteina di interesse marcata GFP è localizzata nella membrana plasmatica delle cellule. In questo caso, il protocollo descritto nella sezione 2.2 può essere utilizzato.
  2. Isolamento delle cellule GFP-positive tramite perline magnetiche anti-GFP
    1. Dalla sospensione a cellule isolate raccolta al punto 1.3.12, centrifugare le cellule per 5 min a 10.000 x g a 4 gradi centigradi. Eliminare le cellule supernatali e sospendere in 485 -L di mezzo integrato ll-15. Aggiungere alla soluzione 15 l di ddH2O pre-lavate con anticorpo-GFP.
    2. Incubare le cellule con il liquame magnetico a 4 gradi centigradi per 1 h con una tornitura molto delicata. Una svolta eccessiva danneggerà le cellule.
    3. Dopo l'incubazione, centrifugare il campione per 5 min a 10.000 x g a 4 gradi centigradi, quindi lavare il pellet 2x con 1 mL di mezzo integrato l'L-15 per rimuovere le cellule clacson- negative.
  3. Coltura di cellule isolate
    1. Piastra celle isolate in una piastra sterile a 6 pozzetto multi-bene.
      NOTA: Queste piastre possono essere rivestite con lectina di arachidi per aumentare l'attaccamento cellulare; tuttavia, se le celle devono essere utilizzate immediatamente, questo passaggio può essere ignorato.
    2. Mettete la piastra in un contenitore di plastica e incubate le cellule a 20 gradi con una salvietta umida o carta velina molle (aggiungere 50 g/mL di ampillina a ddH2O per garantire nessuna crescita batterica sulla cancellazione) per aggiungere umidità alle cellule. Non incubare in un'incubatrice di CO 2, poiché livelli elevati di CO2 possono danneggiare le cellule.

3. Imaging fluorescente di cellule isolate GFP-positive

  1. Accendere la lampadina fluorescente di un microscopio invertito con attacco a fluorescenza e lasciarla riscaldare per circa 10 min.
  2. Rimuovere la coltura cellulare dall'incubatrice e impostare sullo stadio del microscopio invertito con attacco di florescenza. Far scorrere il filtro GFP nelle scanalature sotto lo stadio del microscopio.
  3. Visualizzare le celle con un ingrandimento di 50x. Le cellule GFP-positive iisolate con successo saranno facilmente visibili. Scattare foto utilizzando l'allegato della fotocamera al microscopio.

4. Estrazione di RNA da cellule isolate

NOTA: L'estrazione dell'RNA deve essere eseguita immediatamente dopo l'isolamento cellulare per garantire un'alta qualità del materiale. L'RNA isolato può essere utilizzato per produrre cDNA e la successiva misurazione dei livelli di trascrizione mediante PCR quantitativo (qPCR). Tutti i tubi, le punte e i reagenti devono essere privi di RNasi e lo spazio di lavoro deve essere lavato a etanolo prima dell'estrazione dell'RNA.

  1. Dalle cellule isolate raccolte al passo 2.1.2, centrifugare le cellule in uno sterile 1,5 mL sterile, tubo di microcentrifuga senza RNase per 5 min a 10.000 x g a 4 gradi centigradi. Se le cellule sono isolate tramite perline magnetiche, seguire la raccolta delle cellule come indicato sopra.
  2. Utilizzando una micropipetta, rimuovere il supernatante dal tubo di microcentrifuga centrifuga e aggiungere 100 -L di M9 medio per lavare via mezzo integrato L-15. Centrifuga le cellule 5 min a 10.000 x g a 4 gradi centigradi e rimuovere il supernatante. Per garantire che tutti i supporti vengano rimossi, ripetere per un totale di tre lavamenti che rimuovono attentamente il supernatante ogni volta.
  3. Aggiungere 1 mL di fenolo e guanidina isothiocyanate solution (Tabella dei materiali) alle cellule e pipettare la sospensione su e giù con attenzione. Incubare la miscela a RT per 5 min.
  4. Dopo l'incubazione, aggiungere 250 fenoli e la soluzione isothiocyanata di fenigliano
  5. Centrifugare la soluzione per 5 min a 10.000 x g a 25 gradi centigradi.
  6. Rimuovere con attenzione la maggior parte dello strato acquoso superiore con una micropipetta possibile, senza disturbare gli strati organici inferiori, e trasferire lo strato inferiore a un nuovo tubo di microcentrifuga RNase da 1,5 mL. Al nuovo tubo, aggiungere 500 l di isopropanol e mescolare invertendo il tubo. Incubare questa soluzione a RT per 5 min.
  7. Centrifugare il tubo a 14.000 x g per 20 min a 25 gradi centigradi.
  8. Mantenendo i campioni sul ghiaccio, rimuovere il più possibile isopropanolo con una micropipetta e aggiungere delicatamente 1 mL di 70% (v/v) di etanolo in ddH2O senza RNase al tubo. Assicurarsi di non espellere la soluzione direttamente sul fondo del tubo; applicare la miscela etanolo/acqua sul lato del tubo.
  9. Centrifuga a 10.000 x g per 5 min a 25 gradi centigradi.
  10. Rimuovere la maggior parte dell'etanolo e asciugare all'aria sul ghiaccio per un periodo di 3 e 5 min.
    NOTA: l'etanolo deve essere rimosso dopo questo passaggio; tuttavia, un'attenta ispezione del fondo del tubo è importante per garantire che non venga lasciato etanolo.
  11. Dopo che il tubo è stato essiccato all'aria, aggiungete 15-20 L di RNase-free ddH2O e misurate la concentrazione e la purezza dell'RNA utilizzando uno spettrofotometro a 260 nm. La purezza del campione deve essere misurata come rapporto di 260 nm/280 nm. Questo rapporto dovrebbe essere approssimativamente >2.
    NOTA: L'RNA isolato può essere congelato e conservato a -20 gradi centigradi. È, tuttavia, altamente preferenziale utilizzare un kit di sintesi cDNA il più presto possibile per garantire una produzione cDNA di alta qualità. La PCR quantitativa può seguire le istruzioni fornite dal produttore del termociclore utilizzato in laboratorio.

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Risultati

Il protocollo qui descritto consente l'isolamento specifico dei neuroni colinergici unc-17::GFP-positivi dai nematodi C. elegans per i successivi studi ex vivo come la profilazione dell'espressione genica specifica del tipo di cellula e l'eventuale coltura a breve termine per misurazioni elettrofisiologiche patch-clamp.

Figura 1 Mostra neuroni colinergici unc-17::GFP-posit...

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Discussione

Il nematode C. elegans è un modello consolidato e potente per studiare la salute neuronale e la malattia2. Con ampi strumenti genetici per manipolare questi animali e una quantità gestibile di vari tipi di neuroni mappati con precisione, una grande quantità di dati può essere raccolta con una quantità relativamente piccola di materiale. Qui, illustreremo un metodo ottimizzato per isolare neuroni distinti da animali interi. Interrompendo le proteine cutici esterne del verme, un liquame di ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo la dott.ssa Jennifer Fox e i membri del laboratorio Khalimonchuk per commenti approfonditi. Riconosciamo il sostegno dei National Institutes of Health (R01 GM108975 a O.K. e T32 GM107001-01A1 a E.M.G.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
piastra a 6 pozzettiFisher Scientific12-556-004
Agar, grado di biologia molecolareVWRA0930
CaCl2SigmaC5670
CloroformioSigma496189
Contess Contatore di cellule automatizzatoInvitrogenZ359629
DTTUSBiologicalD8070
EtanoloDecon Labs2701
FBSOmega ScientificFB-02
FluorodesossiuridinaSigmaF0503
HEPESSigmaH3375
IsopropanoloVWRBDH1133
KClAmrescoO395
KH2PO4USBiologicalP5110
KimwipesKimberly-Clark Professionals7552
Leibovitz's L-15 MediumGibco21083027
MgCl2SigmaM8266
MgSO4USBiologicalM2090
Na2HPO4· 7H2OUSBiologicalS5199
NaClVWRX190
NaOCl (Bleach)Clorox
NaOHAmrescoO583
Penicillina-StreptomicenFisher Scientific15140122
Peptone YUSBiologicalP3306
Pronasi EMiscela7433da Streptomyces griseus
SDSAmrescoO227
SMT1-FLQC stereomicroscopio a fluorescenzaTritech Research
SucroseUSBiologicalS8010
SuperScript IV Kit di sintesi One-StepThermoFisher12594025
TRIzolInvitrogen15596026soluzione di isotiocianato di fenolo e guanidina
Trypan Blue StainInvitrogenT10Z82
α-GFP perle magneticheMBLD153-11
di proteasi Sigma

Riferimenti

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