Articolo metodologico

Isolamento di popolazioni di neuroni specifici da nematode Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/60145

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6 agosto 2019

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1Department of Biochemistry, University of Nebraska, 2Nebraska Redox Biology Center, University of Nebraska, 3Nebraska Center for Integrated Biomolecular Communication, University of Nebraska, 4Fred & Pamela Buffett Cancer Center, University of Nebraska Medical Center

In questo articolo

Sommario

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Qui, presentiamo un protocollo per un semplice isolamento di specifici gruppi di cellule neuronali vive che esprimono proteine fluorescenti verdi dalle linee transgeniche di Caenorhabditis elegans . Questo metodo consente una varietà di studi ex vivo focalizzati su neuroni specifici e ha la capacità di isolare le cellule per ulteriori colture a breve termine.

Abstract

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Durante il processo di invecchiamento, molte cellule accumulano alti livelli di danni che portano alla disfunzione cellulare, che sta alla base di molte condizioni geriatriche e patologiche. I neuroni post-mitotici rappresentano un tipo di cellula principale interessato dall'invecchiamento. Anche se esistono più modelli di mammiferi di invecchiamento neuronale, sono impegnativi e costosi da stabilire. Il nematode Caenorhabditis elegans è un potente modello per studiare l'invecchiamento neuronale, in quanto questi animali hanno una breve durata di vita, una cassetta degli attrezzi genetica robusta disponibile e un sistema nervoso ben catalogato. Il metodo qui presentato consente di un isolamento senza soluzione di continuità di cellule specifiche basato sull'espressione di una proteina fluorescente verde transgenica (GFP). Le linee animali transgeniche che esprimono GFP sotto distinti promotori tipo di cellule sono digerite per rimuovere la cuticola esterna e disturbati delicatamente meccanicamente per produrre liquami contenenti vari tipi di cellule. Le cellule di interesse vengono quindi separate dalle cellule non bersaglio attraverso lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza o da perline magnetiche ad accoppiamento anti-GFP. Le cellule isolate possono quindi essere coltivate per un tempo limitato o immediatamente utilizzate per analisi ex vivo specifiche per cellula, come l'analisi trascrizionale tramite PCR quantitativa in tempo reale. Pertanto, questo protocollo consente un'analisi rapida e robusta delle risposte specifiche delle cellule all'interno di diverse popolazioni neuronali in C. elegans.

Introduzione

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Nel corso degli ultimi decenni, l'organismo modello metazoano Caenorhabditis elegans è stata una risorsa enorme nello studio dei neuroni, circuiti neuronali e il suo ruolo nelle risposte fisiologiche e comportamentali, e neurodegenerative associato all'invecchiamento Malattie. Una caratteristica unica di C. elegans è che gli animali sono trasparenti, permettendo il lignaggio di tutte le cellule somatiche adulte da mappare1. C. elegans ospita anche una quantità gestibile di neuroni, portando alla morfologia e alla connettività del sistema nervoso ben comprese2. Il lignaggio cellulare invariante,....

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Protocollo

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1. Preparazione e raccolta di vermi invecchiati per l'isolamento cellulare

NOTA: Di seguito è spiegato l'isolamento dei neuroni colinergici dal ceppo transgenico unc-17::GFP (OH13083) ottenuto dal deposito di ceppo Caenorhabditis Genetics Center (CGC) presso l'Università del Minnesota. È imperativo mantenere condizioni sterili per prevenire la contaminazione da funghi o batteri.

  1. Preparare e sincronizzare i worm tramite il metodo di sbiancamento come descritto da T. Stiernagle16. Per gli esperimenti di invecchiamento, piastre piastre di piastre di crescita del nematode (NGM) contenenti una ....

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Risultati

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Il protocollo qui descritto consente l'isolamento specifico dei neuroni colinergici unc-17::GFP-positivi dai nematodi C. elegans per i successivi studi ex vivo come la profilazione dell'espressione genica specifica del tipo di cellula e l'eventuale coltura a breve termine per misurazioni elettrofisiologiche patch-clamp.

Figura 1 Mostra neuroni colinergici unc-17::GFP-posit.......

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Discussione

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Il nematode C. elegans è un modello consolidato e potente per studiare la salute neuronale e la malattia2. Con ampi strumenti genetici per manipolare questi animali e una quantità gestibile di vari tipi di neuroni mappati con precisione, una grande quantità di dati può essere raccolta con una quantità relativamente piccola di materiale. Qui, illustreremo un metodo ottimizzato per isolare neuroni distinti da animali interi. Interrompendo le proteine cutici esterne del verme, un liquame di .......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo la dott.ssa Jennifer Fox e i membri del laboratorio Khalimonchuk per commenti approfonditi. Riconosciamo il sostegno dei National Institutes of Health (R01 GM108975 a O.K. e T32 GM107001-01A1 a E.M.G.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
piastra a 6 pozzettiFisher Scientific12-556-004
Agar, grado di biologia molecolareVWRA0930
CaCl2SigmaC5670
CloroformioSigma496189
Contess Contatore di cellule automatizzatoInvitrogenZ359629
DTTUSBiologicalD8070
EtanoloDecon Labs2701
FBSOmega ScientificFB-02
FluorodesossiuridinaSigmaF0503
HEPESSigmaH3375
IsopropanoloVWRBDH1133
KClAmrescoO395
KH2PO4USBiologicalP5110
KimwipesKimberly-Clark Professionals7552
Leibovitz's L-15 MediumGibco21083027
MgCl2SigmaM8266
MgSO4USBiologicalM2090
Na2HPO4· 7H2OUSBiologicalS5199
NaClVWRX190
NaOCl (Bleach)Clorox
NaOHAmrescoO583
Penicillina-StreptomicenFisher Scientific15140122
Peptone YUSBiologicalP3306
Pronasi EMiscela7433da Streptomyces griseus
SDSAmrescoO227
SMT1-FLQC stereomicroscopio a fluorescenzaTritech Research
SucroseUSBiologicalS8010
SuperScript IV Kit di sintesi One-StepThermoFisher12594025
TRIzolInvitrogen15596026soluzione di isotiocianato di fenolo e guanidina
Trypan Blue StainInvitrogenT10Z82
α-GFP perle magneticheMBLD153-11
di proteasi Sigma

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100, 64-119 (1983).
  2. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. Th....

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