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Articolo metodologico

Isolamento dei leucociti dal latte materno umano per l'uso in un saggio di fagocitosi cellulare dipendente da anticorpi sui bersagli HIV

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DOI:

10.3791/60149

⸱

6 settembre 2019

 , 
1Division of Infectious Diseases, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

In questo articolo

Sommario

Il latte materno trasmette il virus dell'immunodeficienza umana (HIV), anche se solo il 15% dei neonati allattati al seno da madri affette da HIV si infetta. I neonati allattati al seno ingeriscono 105x 108 leucociti materni al giorno, anche se queste cellule sono poco studiate. Qui descriviamo l'isolamento del latte materno leucociti e un'analisi della loro capacità fagocitica.

Abstract

Anche in assenza di farmaci antiretrovirali, solo il 15% dei neonati allattati al seno da madri affette da HIV si infetta, suggerendo un forte effetto protettivo del latte materno (BM). A meno che l'accesso all'acqua pulita e la formula per neonati appropriata non siano affidabili, l'OMS non raccomanda la cessazione dell'allattamento al seno per le madri infette dall'HIV. Numerosi fattori probabilmente funzionano in tandem per ridurre la trasmissione di BM. I neonati allattati al seno ingeriscono al giorno 105x 108 leucociti materni, anche se ciò che rimane ampiamente poco chiaro è il contributo di queste cellule alle qualità antivirali della BM. la fagocitosi cellulare dipendente da anticorpi (ADCP), una delle risposte immunitarie innatee più essenziali e pervasive, da parte dei fagociti BM contro i bersagli HIV. Le cellule sono state isolate da 5 campioni di BM umani ottenuti in varie fasi dell'allattamento. L'isolamento è stato effettuato attraverso una delicata centrifugazione seguita da un'attenta rimozione del grasso di latte e il lavaggio ripetuto del pellet cellulare. Le perle fluorescenti rivestite con inviluppo HIV (Env) epitopo sono state utilizzate come obiettivi per l'analisi di ADCP. Le cellule sono state macchiate con il marcatore di superficie CD45 per identificare i leucociti. È stato scoperto che l'attività ADCP era significativa sopra gli esperimenti di controllo e riproducibilmente misurabile utilizzando un anticorpo specifico dell'HIV 830A.

Introduzione

Il latte materno umano (BM) è costituito da cellule materne che sono >90% vitali1. La composizione cellulare è fortemente influenzata dallo stadio di allattamento, dallo stato di salute della madre e del bambino e dalla variazione individuale, che rimane poco compresa1,2,3,4. Dato che la BM contiene 103x 105 leucociti/mL, si può stimare che i neonati allattati al seno ingeriscano 105x 108 leucociti materni al giorno5. Vari studi in vivo hanno dimostrato che i leucociti materni forniscono immunità critica al bambino e sono funzionali ben oltre questi siti di ingestione iniziale5,6,7,8 ,9,10,11. Tutte le cellule di derivazione materna ingerite dal neonato hanno il potenziale per svolgere funzioni immunitarie a fianco o per compensare i leucociti del bambino12.

La trasmissione madre-bambino (MTCT) del virus dell'immunodeficienza umana (HIV) rimane una crisi nei paesi con risorse limitate. Poiché le malattie diarrea e respiratorie sono responsabili di notevoli tassi di mortalità tra i neonati nei paesi con risorse limitate, e queste malattie sono significativamente ridotte dall'allattamento esclusivo al seno, i benefici per le madri infette da HIV l'allattamento al seno superano di gran lunga i rischi13,14,15. A meno che l'accesso all'acqua pulita e la formula per neonati appropriata non siano affidabili, l'OMS non raccomanda la cessazione dell'allattamento al seno per le madri infette da HIV16. Circa 100.000 MTCT tramite BM si verificano ogni anno; tuttavia, solo il 15% dei neonati allattati al seno dalle loro madri infette da HIV si infettano, suggerendo un forte effetto protettivo di BM17,18,19,20,21. Numerosi fattori probabilmente funzionano in tandem per impedire la trasmissione. È importante sottolineare che gli anticorpi specifici per l'HIV (Abs) in BM sono stati correlati alla riduzione dell'MTCT e/o alla riduzione della morte infantile per infezione da HIV22,23. Ciò che rimane in gran parte poco chiaro è il contributo della frazione cellulare di BM alle sue qualità antivirali.

Molti Abs facilitano una varietà di attività anti-virali mediate dalla regione "costante" della molecola di immunoglobulina, il frammento cristallizzabile (Fc), attraverso l'interazione con i recettori Fc (FcR) che si trovano praticamente su tutte le cellule immunitarie innate, praticamente tutte si trovano nell'uomo BM24. La fagocitosi cellulare dipendente da anticorpi (ADCP) è stata dimostrata come necessaria per lo sgombero delle infezioni virali ed è stata poco studiata nel caso della prevenzione dell'MTCT dell'HIV25,26,27, 28 mi la più del 24 , 29.Data la scarsità di conoscenze sul potenziale contributo dell'attività ADCP da parte dei fagociti BM alla prevenzione della MTCT dell'HIV, abbiamo mirato a sviluppare un metodo rigoroso per isolare le cellule dalla BM umana al fine di intraprendere uno studio di ADCP mediato da cellule da BM ottenuto in varie fasi di allattamento.

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Protocollo

Ogni partecipante a questo studio è stato assunto e intervistato in accordo con l'approvazione dell'ente di revisione etico e istituzionale (IRB) con la guida e l'autorizzazione del Programma del Monte Sinai per la protezione dei soggetti umani (PPHS) utilizzando un per ottenere campioni di latte materno.

1. Preparazione della microsfera target

  1. Selezionare un antigene bersaglio pertinente.
    NOTA: In questo esempio è stata utilizzata la proteina ricombinante V1V2-2F5K, progettata per imitare l'apice trimerico della busta HIV nativa30.
  2. Eseguire la biotinylation utilizzando un kit commerciale (Tabella dei materiali) secondo il protocollo del produttore.
    1. Calcolare il mmol del reagente di biotina da aggiungere alla reazione per un eccesso molare di 5 volte utilizzando la formula: biotina mmol x proteina mL x (proteina mg/mL) x (proteina biotina mmol/mg) x (5 proteina biotina/mmolmmo)30,31. Quindi calcolare l'unità di reagente di biotina da aggiungere utilizzando la formula: biotina e biotina mmol x (1.000.000 x L/L) x (L/10 mmol).
    2. Biotina equilibrate a temperatura ambiente prima dell'apertura. Sciogliere le proteine in 0,5 mL di salina con buffer fosfato (PBS) secondo il calcolo sopra fatto.
    3. Preparare una soluzione di 10 mM di reagente di biotina in dimetilfossido di dimetilzolaro (DMSO) e aggiungere il volume appropriato di 10 mM reagente di biotina alla soluzione proteica, e incubare la reazione sul ghiaccio per 2 h o a temperatura ambiente per 30 min.
  3. Rimuovere la biotina in eccesso utilizzando concentratori proteici (poliethersulfone [PES] membrane, 3 kDa taglio del peso molecolare [MWCO], 0,5 mL; Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.
    1. Depositare il campione nella camera superiore della colonna di spin e aggiungere PBS fino a 400 . Centrifuga a 12.000 x g a temperatura ambiente per 30 min.
    2. Scartare il flow-through e aggiungere PBS a 400 .L. Ripeti centrizione. Scartare il flow-through e aggiungere PBS a 100 .L. Misurare la concentrazione di proteine da uno spettrometro.
      NOTA: Le proteine possono essere congelate e congelate a -80 gradi centigradi fino all'uso.

2. Preparazione della piastra di analisi cellulare dipendente da anticorpi (ADCP)

  1. Proteine biohoonilate coniugate a 1 semisfera ('perle'; Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.
    1. Per piastra di perline coniugate, incubare 6 g di proteine con 12 litri di perline di stock in 200 -L di 0,1% di albumina di siero bovino (BSA)-PBS a temperatura ambiente per 1 h, vortice dolcemente ogni 20 min.
    2. Centrifuga a 13.000 x g per 5 min. Scartare supernatante, vorticare delicatamente e risospendere in 1200 - L di 0,1% BSA-PBS. Ripetere la rotazione e lavare il passaggio 2x. Risospendere in 1200 - L dello 0,1% BSA-PBS.
  2. Aliquota 10 l di soluzione di perline per bene in una piastra rotonda inferiore 96-bene. Preparare le diluizioni di anticorpi o di infiammazione immunitaria in una diminuzione del 2% del 2% di HSA HBSS, in genere a partire da 50 g/mL di anticorpo o una diluizione di 1/100 di siero.
    NOTA: nei dati di esempio è stato utilizzato l'anticorpo monoclonale (mAb) 830A.
  3. Aggiungere 10 l di anticorpi/sera titolati alla piastra di perline e incubare per 2 h a 37 gradi centigradi. Aggiungere 200 L del 2% HSA HBSS ad ogni pozzo e centrifugare piastra a 2.000 x g per 10 min.
  4. Rimuovere con attenzione il supernatante con un rapido ribaltamento e decantazione del liquido dai pozzetti della piastra in un lavandino per evitare di disturbare il pellet di perline invisibile.

3. Isolamento delle cellule del latte materno

  1. Ottenere latte materno umano da donne in lattazione sane, espresso utilizzando doppie pompe elettroniche o manuali. Isolare le cellule entro 4 h di espressione, mantenendo il latte a temperatura ambiente.
  2. Utilizzando tubi da 50 mL, centrificare 50 mL di latte a 800 x g per 15 min. versare con attenzione il latte scremato e il grasso lasciando il pellet cellulare indisturbato. Pulire l'interno del tubo con una salvietta senza laminetta per rimuovere tutto il grasso dalla parete del tubo.
  3. Aggiungi 10 mL di albume di siero umano del 2% nella soluzione di sale equilibrato di Hank (2% HSA HBSS [senza Ca2 o Mg]). Risospendere il pellet con un leggero pipettaggio per evitare l'attivazione delle cellule e l'apoptosi. Trasferire in un tubo da 15 mL e centrifugare a 450 x g per 10 min.
  4. Versare il supernatante e ripetere il passaggio 1.3. Quindi, risospendere delicatamente le celle in 1-2 mL del 2% HSA HBSS a seconda del numero di cellulare previsto e contare le celle con un emocitometro o un contatore cellulare automatizzato, notando anche la fattibilità cellulare.

4. Assay ADCP

NOTA: i metodi descritti di seguito sono adattati da Ackerman et al.32.

  1. Aggiungere 50.000 celle BM appena isolate a ciascun aumento di aspetto ADCP ben in 200 -L di 2% HSA-HBSS. Incubare per 2 h a 37 .
    1. Per gli esperimenti di controllo, le cellule pre-incubate a 37 s con 10 g/mL di actinio (cytochalasin-D), 50 agenti di blocco FCR (FcBlock) o una combinazione di entrambi prima della loro aggiunta alle piastre.
  2. Piastra di centrifuga a 930 x g per 10 min. Rimuovere con cautela il supernatante come nel passaggio 2.7 e ripetere il lavaggio.
  3. Rimuovere con attenzione le celle sovrnatali e macchiate per la redditività utilizzando 0,5 g/mL (concentrazione finale) macchia di vitalità fissabile 450 per pozzo in 50 : L del 2% HSA HBSS. Incubare 20 min a temperatura ambiente al buio. Centrifuga a 930 x g per 10 min e rimuovere supernatante come nel passo 2.7. Aggiungere di nuovo 200 L del 2% HSA HBSS e centrifugare, seguita dalla rimozione del super-natante come nel punto 2.7.
  4. Dopo la colorazione della vitalità, le celle di colorazione per i marcatori di leucocito di interesse, minimamente includendo una macchia specifica del CD45 come il CD45 anti-umano del topo PE (clone HI30) ad una concentrazione ottimizzata (1g/LL in 50 - L di 1% BSA HBSS nei dati di esempio).
    NOTA: è possibile includere eventuali indicatori di interesse specifici del lignaggio.
  5. Incubare 20 min a temperatura ambiente al buio. Centrifuga a 930 x g per 10 min e rimuovere supernatante come nel passo 2.7. Aggiungere 200 -L dell'1% di BSA HBSS e ripetere la centrifugazione. Rimuovere supernatante. Fissare le cellule in 200 - L di 0,5% formaldeide al buio a temperatura ambiente per 30 min o durante la notte a 4 gradi centigradi. Conservare in frigorifero al buio fino all'analisi.

5. Analisi per citometria di flusso

  1. Eseguire il gating iniziale per eliminare i doppietti su un grafico a dispersione in avanti (FSC) e in un grafico a dispersione laterale (SSC) e detriti (materiale più piccolo di FSC - 5000) (vedere la figura 1). Utilizzare un grafico SSC vs viability (V450 in questo caso) per eliminare le cellule morte (quelle positive per la colorazione di vitalità).
  2. Utilizzare un grafico SSC vs CD45 per differenziare le principali classi di leucociti (granulociti, monociti, linfociti) come ampiamente descritto33,34.
    NOTA: questa classificazione è solo suggestiva e sono necessari marcatori specifici per il lignaggio per confermare il tipo di cella.
  3. Per tutte le cellule CD45, o per ogni sottoinsieme di interesse leucocito, misurare l'attività ADCP gating con un marcatore sulle cellule di perline-positive in un istogramma del canale isotoniocianato (FITC) fluorescenano, dove vengono rilevate le perline fluorescenti.
    NOTA: I pozzi di controllo negativo in cui non sono state aggiunte perline indiche indiche indiche indicheranno dove le cellule sono evidenti nel tallone e quindi dove posizionare il marcatore di gating.
  4. Calcolare i punteggi ADCP come (intensità di fluorescenza mediana [MFI] di cellule perline positive) x (% del CD45 totale - cellule nella popolazione positiva). Utilizzare il software grafico per tracciare i punteggi ad ogni concentrazione ab/siero ed eseguire un'analisi dell'area sotto la curva (AUC).
    NOTA: ADCP è considerato positivo se l'AUC è maggiore di 3 volte deviazione standard del punteggio ADCP AUC di un mAb di controllo negativo non specifico (in questo caso, 3865).

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Risultati

Il latte può essere mantenuto a temperatura ambiente o più fresco (anche se non congelato); tuttavia, dato che abbiamo osservato una minore vitalità quando il latte è stato mantenuto molto freddo (dati non mostrati), e che è più semplice raccogliere, conservare brevemente e trasportare a temperature ambiente, si raccomanda che i campioni non siano refrigerati al fine di ridurre variabilità da campione a campione. Nel latte ottenuto 7-183 giorni dopo il parto, la concentrazione cellulare d...

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Discussione

La tecnica a flusso di citometria per misurare l'attività ADCP descritta qui è stata descritta per la prima volta nel 201130 e da allora è stata dimostrata robusta e citata in più di 80 studi. Il protocollo qui descritto adatta questa tecnica per l'uso con le cellule BM primarie per la prima volta. Precedenti studi sulla funzionalità mediata da Fc da cellule BM sono stati in gran parte limitati alla misurazione di esplosioni ossidative o analisi di fagocitosi a base di estasi utilizzando cellule i...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo la Dott.ssa Susan e il Dipartimento di Microbiologia della Icahn School of Medicine del Monte Sinai per la revisione del manoscritto. Il NIH/NICHD ha fornito finanziamenti per questo progetto con il numero di sovvenzione R21 HD095772-01A1. Inoltre, R. Powell è stato sostenuto da fondi del Dipartimento di Medicina, Divisione delle Malattie Infettive, Icahn School of Medicine del Monte Sinai.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1 µ m FluoSpheres Microsfere marcate con NeutrAvidin Thermo FisherF8776
BD Pharmingen PE Topo Anti-Umano CD45BD560975
Siero bovino AlbuminaMP Biomedicals8810025
Corning V-bottom polistirene piastra a 96 pozzetti Corning 3894
Citocalasina DSigma22144-77-0
Kit EZ-Link NHS-LC-LC-Biotina Thermo Fisher21338
Falcon 15 mL Provette da centrifuga conicheCorning 
Falcon 50 mL Provette da centrifuga conicheCorning 352070
Macchia di vitalità fissabile 450 BD562247
Soluzione di formaldeideSigma252549 
HBSS senza calcio, magnesio o fenolo rossoLife Technologies14175-095
Blocco BD Fc umanoBD564219
Albumina sierica umanaMP Biomedicals2191349
Kimtech Science Kimwipes Tergicristalli per compiti delicatiKimberly-Clark Professional 34120
PBS 1x pH 7.4Thermo Fisher10010023
Polistirene 10 mL Pipette sierologiche Corning 4488
Concentratori di proteine PES, 3K MWCO, 0,5 mLPierce88512
352196

Riferimenti

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