Misurazione dell'attività della chitinasi nei campioni biologici

Sommario

Presentato qui è un metodo semplice per misurare l'attività delle chitinasi nei fluidi biologici come la lavanda bronchoalveolare o il siero.

Abstract

Le chitinasi sono gli enzimi che fendono la chitina. Anche in assenza di chitina, i mammiferi hanno quantità significative di chitinasi presenti nel corpo anche al basale. Il ruolo preciso della chitinasi non è noto, tuttavia si credeva che svolgesse un ruolo importante nella digestione e nella difesa dell'ospite contro il cibo e gli agenti patogeni che contengono la chitina, rispettivamente. Recenti lavori, tra cui il nostro, hanno mostrato un ruolo importante della chitinasi e delle proteine simili alla chitinasi nell'immunità dell'ospite e nelle malattie allergiche. È importante sottolineare che le attività di chitinasi fungono da importanti biomarcatori della gravità della malattia in un'ampia gamma di malattie, tra cui malattie infiammatorie di tipo 2 come l'asma e la fibrosi polmonare. Allo stesso modo, i pazienti con disturbi genetici come la malattia di Gaucher hanno livelli di chitinasi significativamente elevati, che non solo correlano con la gravità della malattia, ma servono anche come un biomarcatore affidabile per l'efficacia terapeutica. Il protocollo qui descritto descrive un modo semplice, rapido e diretto per misurare l'attività delle chitinasi in campioni di BAL o siero di topi e può essere ampiamente adattato a soggetti umani e altri organismi modello a causa della natura altamente conservata degli enzimi.

Introduzione

La chitina è il secondo polisaccaride più abbondante sulla terra dopo la cellulosa, servendo come componente strutturale principale di una varietà di organismi tra cui l'esoscheletro di insetti, funghi, lieviti e alghe; alcuni vertebrati hanno anche la chitina¹. Le chitinasi sono una famiglia di enzimi che sono in grado di abbattere la chitina e sono altamente conservati durante tutta l'evoluzione in specie che vanno dai batteri ai mammiferi^2,3. Oltre alle chitinasi, i mammiferi hanno anche proteine simili alla chitinasi che sono simili alle chitinasi nella loro capacità di legare la ch....

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite nell'ambito di un protocollo approvato dall'IACUC presso la Yale University School of Medicine.

1. Collezione di campioni di mouse

1. Anestesizzazione
   1. Anestesizza reati con ketamina e xylazina (100 mg/kg di ketamina e 10 mg/kg di xilanina).
2. Raccolta di campioni di sangue
   1. Confermare la profondità dell'anestesia per non risposta a un pizzico di dita dei dei dei idi.
   2. Aprire chirurgicamente la cavità toracica per esporre il cuore.
   3. Inserire un ago da 26,5 G nel ventricolo sinistro e racc....

Risultati

I risultati mostrati di seguito provengono da uno studio che misura l'attività della chitinasi nei campioni di siero e BAL di tipo selvatico (C57BL/6) e topi transgenici Chit1 (su sfondo C57BL/6) che sovraesprimono il gene Chit1 su un promotore di doxyciclina. I nostri dati mostrano che sia i campioni di siero che di BAL hanno attività di chitinasi rilevabili in base alla linea di base 698,2 x 189,9 nmol/mL-h e 485,7 x 114 nmol/ml-h, rispettivamente. La sovraespressione del gene Chit1 che utilizza la doxycycline nell'acq.......

Discussione

L'attività della chitinasi è emersa come un importante biomarcatore per prevedere la gravità della malattia, la progressione della malattia, l'efficacia terapeutica e la presenza di specifici patogeni¹⁸. Anche se molte delle teorie a lungo postulate sul ruolo delle chitinasi non sono state provate sperimentalmente¹⁹, nuovi studi hanno fornito importanti informazioni sul ruolo delle chitinasi e della chitinasi come proteine in varie malattie^2,

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
4-metilumbelliferone	Sigma	M1381	Standard: comunemente usato nei saggi fluorimetrici per la determinazione dell'attività enzimatica
4MU-GlcNAc2	Sigma	M9763	substrato fluorescente della chitinasi per l'uso in campioni di topo
4MU-GlcNAc3	Sigma	M5639	substrato fluorescente della chitinasi per l'uso in campioni umani
Acido citrico-monoidrato			per l'uso in McIlvain Buffer
Glycine			per l'uso in Stop Buffer a una concentrazione di 0,3 M
Na2HPO4xH2O			per l'uso in McIlvain Buffer
NaOH			per l'uso in Stop Buffer a una concentrazione di 12 g/L
Vision Plate: Piastra nera a 96 pozzetti, non sterile, non trattata	4titude	4ti-0224