L'obiettivo del protocollo è quello di misurare in modo affidabile le proprietà meccaniche della membrana delle vesciche giganti mediante aspirazione alla micropipetta.
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Articolo metodologico
Obsistenza di Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le vesciche giganti ottenute da fosfolipidi e copolimeri possono essere sfruttate in diverse applicazioni: somministrazione controllata e mirata di farmaci, riconoscimento biomolecolare all'interno di biosensori per la diagnosi, membrane funzionali per cellule artificiali e sviluppo di micro/nanoreattori bioispirati. In tutte queste applicazioni, la caratterizzazione delle loro proprietà della membrana è di fondamentale importanza. Tra le tecniche di caratterizzazione esistenti, l'aspirazione di micropipette, introdotta da E. Evans, consente la misurazione delle proprietà meccaniche della membrana come il modulo di comprimibilità dell'area, la piegatura del modulo e lo stress e la deformazione della lisi. Qui, presentiamo tutte le metodologie e le procedure dettagliate per ottenere vesciche giganti dalla pellicola sottile di un lipidico o un polimero (o entrambi), la produzione e il trattamento superficiale delle micropipette, e la procedura di aspirazione che porta alla misurazione di tutti i parametri sopra menzionati.
Introduzione
Le vesciche giganti ottenute dai fosfolipidi (liposomi) sono state ampiamente utilizzate fin dagli anni '70 come modello di membrana cellulare di base1. Alla fine degli anni '90, le morfologie vescicolari ottenute dall'auto-assemblaggio dei polimeri, chiamati polimeriini in riferimento ai loro analoghi lipidi2,3, sono apparse rapidamente come un'interessante alternativa ai liposomi che possiedono una debole stabilità meccanica e scarsa funzionalità chimica modulare. Tuttavia, il loro carattere biomimetico cellulare è piuttosto limitato rispetto ai liposomi poiché questi ultimi sono comp....
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Protocollo
1. Fabbricazione di micropipette
NOTA: Qui sono necessarie micropipette con un diametro interno compreso tra 6 e 12 m e una lunghezza di conia intorno ai 3-4 mm. Un metodo dettagliato di produzione micropipetta è descritto di seguito.
- Posizionare il vetro borosilicate capillare nella barra di traino dell'estraente e fissare una delle estremità stringendo la manopola.
- Far scorrere con attenzione il vetro attraverso i fori sul lato della camera riscaldatrice.
- Stringere la manopola di bloccaggio all'altra estremità.
- Controllare le dimensioni della punta e la lunghezza del cono per ottenere le specifiche ....
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Risultati
Con il protocollo di cui sopra, abbiamo studiato diversi vescicoli di unilamellar sintetico sintetico (GUV), ottenuti da un fosfolipidide: 2-oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC), un copolimero di triblocco: Poly(ethyleneoxide)-b-Poly(dimetilsiloxane) -b-Poly(etileneossido) (PEO12-b-PDMS43-b-PEO12)sintetizzato in uno studio precedente13, e un copolimero disblocco Poly(dime.......
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Discussione
Il rivestimento della micropipetta è uno dei punti chiave per ottenere misurazioni affidabili. L'adesione della vescica alla micropipetta deve essere prevenuta, e un rivestimento è comunemente usato nella letteratura17,18,19,20,21, con BSA, zo-casein o surfasil. I dettagli della procedura di rivestimento sono raramente menzionati.
L.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori riconoscono con gratitudine l'ANR per il sostegno finanziario (ANR Sysa).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Attrezzatura e materiali necessari per la progettazione di micropipette | |||
| Capillari in vetro borosilicato | World Precision Instruments | 1B100-4 | diametro esterno e interno rispettivamente di 1 mm e 0,58 mm. |
| Filamento installato | Sutter Instrument Co. | FB255B | 2,5 mm * 2,5 mm scatola filamento |
| fiammante / marrone estrattore per micropipette | Sutter Instrument Co. | Modello P-97 | |
| Microforge | NARISHGE Co. | MF-900 | dotato di due obiettivi (10x e 32x) |
| Materiali per il rivestimento di puntali per pipette con BSA | |||
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Sigma-Aldrich | 10735078001 | |
| Siringa monouso da 1 ml Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| Siringa monouso da 10 ml Luer Tip | Codan | 626616 | |
| Siringa monouso da 5 ml Luer Tip | Codan | 62.5607 | |
| Filtro monouso in acetato di cellulosa | Cluzeau Info Labo | L5003SPA | Dimensione dei pori: 0,22µ m, diametro: 25 mm |
| Tubo capillare flessibile in silice fusa Polymicro | Technologies. | TSP530660 | Diametro interno 536µ m, Diametro esterno 660µ m,Glucosio |
| Sigma-Aldrich | G5767 | ||
| Siringa 500 µ L luer Lock GASTIGHT | Hamilton Syringe Company | 1750 | |
| Miscelatore rotativo per provette | Labinco | 28210109 | |
| Micromanipolazione Configurazione | |||
| Guida ottica in alluminio, lunghezza 1000 mm, filettature M4, serie X48 | Newport | ||
| Tavolo ottico smorzato | Newport | utilizzato come supporto del microscopio per prevenire le vibrazioni esterne. | |
| Micromanipolatore | Eppendorf | Patchman NP 2 | L'unità modulo (unità motore per il movimento X, Y e Z) è montata sul microscopio invertito tramite un adattatore. |
| Micrometro | Mitutoyo Corporation | 350-354-10 | Digimatic LCD Testina micrometrica 25,4 mm Portata 0,001 mm |
| Serbatoio acqua in plexiglass (100 ml) | Microscopio | ||
| DMI6000) fatto in casa dotato di scanner risonante e obiettivo ad immersione in acqua (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I). | Leica | ||
| X48 Rail Carrier 80 mm Lunghezza, con filettatura 1/4-20, 8-32 e 4-40 | Newport | ||
| Materiali per la preparazione di soluzioni di saccarosio e anfifili | |||
| 2-Oleoil-1-palmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina | Sigma-Aldrich | ||
| Cloroformio | VWR | 22711.244 | |
| L-&alfa;-Fosfatidiletanolammina-N-(lissamina rodamina B sulfonil) | Sigma-Aldrich | 810146C | Rodamina taggato lipidi |
| Saccarosio | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Elettroformazione configurazione | |||
| 10 µ L tappi capillari in vetro | Hirschmann | 9600110 | |
| Siringa monouso da 1 ml Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| H Grease | Apiezon | Apiezon H Grease | Grasso senza silicone |
| Vetrini rivestiti in ossido di indio e stagno | Sigma-Aldrich | 703184 | |
| Needle | Terumo | AN2138R1 | 0,8 x 38 mm |
| Ohmmetro (multimetro) | Voltcraft | VC140 | |
| Toluene | VWR | 28676.297 | |
| Generatore di tensione | Keysight | 33210A |
Riferimenti
- Bangham, A. D., Standish, M. M., Watkins, J. C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. Journal of Molecular Biology. 13 (1), (1965).
- Discher, D. E., Eisenberg, A. Polymer vesicles. Science. 297 (5583), 967-973 (2002).
- Hammer, D., et al.
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Ristampe e permessi
