Questo rapporto descrive un metodo microfluidico basato su chip per impostare un esperimento di coltura a cella singola in cui è possibile ottenere l'abbinamento ad alta efficienza e l'analisi microscopica di più cellule singole.
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Articolo metodologico
Stabilire coculture basate su una singola cellula in modo deterministico con un chip microfluidico
In questo articolo
Sommario
Abstract
I saggi di cocoltura cellulare sono stati ampiamente utilizzati per studiare le interazioni cellula-cellula tra diversi tipi di cellule per comprendere meglio la biologia delle malattie tra cui il cancro. Tuttavia, è difficile chiarire il complesso meccanismo delle interazioni intercellulari in popolazioni cellulari altamente eterogenee che utilizzano sistemi di cocoltura convenzionali perché l'eterogeneità della sottopopolazione cellulare è oscurata dai valori medi; i sistemi di cocoltura convenzionali possono essere utilizzati solo per descrivere il segnale della popolazione, ma non sono in grado di monitorare il comportamento delle singole cellule. Inoltre, i metodi sperimentali convenzionali a cella singola hanno una bassa efficienza nella manipolazione cellulare a causa della distribuzione di Poisson. I dispositivi microfabbricati sono una tecnologia emergente per gli studi a cella singola perché possono manipolare con precisione singole cellule ad alta produttività e possono ridurre il consumo di campioni e reagenti. Qui, descriviamo il concetto e l'applicazione di un chip microfluidico per più cocolture unicellulari. Il chip è in grado di catturare in modo efficiente più tipi di singole cellule in una camera di coltura (46%) e dispone di uno spazio di coltura sufficiente utile per studiare il comportamento delle cellule (ad esempio, migrazione, proliferazione, ecc.) sotto l'interazione cellula-cellula a livello di cellula singola. Le cellule endotiliche linfotiche e il carcinoma a cellule squamose orali sono stati utilizzati per eseguire un esperimento di cocoltura a cellule singole sulla piattaforma microfluidica per studi di interazione tra le singole imcellere dal vivo.
Introduzione
L'acquisizione efficiente di diversi tipi di celle singole e la fornitura di spazio di coltura sufficiente sono necessari per esperimenti di cocoltura a cella singola di più tipi di celle singole1. Limitare la diluizione è il metodo più comunemente usato per preparare le singole cellule per tali esperimenti, a causa del basso costo delle attrezzature necessarie. Tuttavia, a causa della limitazione della distribuzione di Poisson, la probabilità massima di acquisizione di una singola cellula è solo del 37%, rendendo l'operazione sperimentale laboriosa e dispendiosa in termini di tempo2. Al contrario, l'utilizzo dello smist....
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Protocollo
1. Fabbricazione di uno stampo di wafer mediante litografia morbida
NOTA: i dati del modello maschera sono disponibili nella pubblicazione precedente14.
- Disidratare un wafer di silicio da 4 pollici in un forno a 120 gradi per 15 min.
- Cappotto di rotazione 4 g di SU-8 2 fotoresist negativo su un wafer di silicio da 4 pollici a 1.000 giri/m per 30 s per creare uno strato di 5 m di spessore (strato #1).
- Cuocere lo strato morbido #1 su una piastra calda di 65 gradi centigradi per 1 min e poi trasferire lo strato #1 a una piastra calda di 95 gradi per 3 min.
- Strato freddo #1 a tempe....
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Risultati
Il dispositivo ha una struttura a tre strati come mostrato dalla fotografia trasversale di un dispositivo PDMS tagliato (Figura 1A). Il primo strato contiene un sito di cattura (6,0 m di larghezza e 4,6 m di altezza) che collega la camera di coltura e il canale di passaggio. La differenza di resistenza al flusso tra la camera di coltura e il canale by-pass fa sì che le cellule scorra nella posizione di cattura e riempiono l'ingresso del picco.......
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Discussione
Le interazioni intercellulari di varie cellule nel microambiente tumorale svolgono un ruolo importante nella progressione del tumore17. Per comprendere il meccanismo delle interazioni cellula-cellula, i sistemi di cocoltura vengono utilizzati come metodo analitico comune. Tuttavia, più tipi di cellule e l'eterogeneità delle cellule stesse hanno portato a complessità sperimentale e difficoltà analitiche.
Il chip di chiusura idrodinamico consente il caricamento di più cel.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del Ministero della Scienza e della Tecnologia (105-2628-E-400-001-MY2), e dal Ph.D. Program in Ingegneria dei Tessuti e Medicina Rigenerativa, dalla National Chung Hsing University e dagli Istituti nazionali di ricerca sulla salute.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nastro medico microfluidico diagnostico poliolefinico avanzato 3M | Company | 9795R | |
| Antibiotici | Biowest | L0014-100 | Glutammina-Penicillina-Streptomicina |
| Software AutoCAD | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Codice 057C1-74A111-1001 |
| Colorante CellTracke CMAC blu | Invitrogen | C2110 | |
| Colorante CMFDA verde | Invitrogen | C7025 | |
| Forno convenzionale | YEONG-SHIN azienda | ovp45 | |
| Essiccatore | Bel-Art Products | F42020-0000 | Essiccatore sottovuoto salvaspazio 190 mm base bianca |
| DiIC12 (3) colorante a membrana cellulare BD | Biosciences | 354218 | Utilizzato come tracker cellulare |
| DMEM-F12 medio | Gibco | 11320-082 | |
| Terreno di crescita delle cellule endoteliali MV 2 | PromoCell | C-22022 | |
| Siero fetale bovino Hyclone | Thermo | SH30071.03HI | |
| Hamilton serie 700 Siringa di vetro ( 0,1 ml ) | Hamilton | 80630 | 100 &; L, modello 710 RN SYR, piccolo NDL rimovibile, 22s ga, 2 pollici, stile punta 2 |
| Harris Uni-Core perforatore | Ted Pella Inc. | 15075 | con |
| perforatore Harris Uni-Core | Ted Pella Inc. | 15071 | con diametro interno di 0,5 mm |
| Piastra riscaldante | YOTEC azienda | YS-300S | |
| Msak allineatore | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| Plasma di ossigeno | NORDSON MARCH | AP-300 | |
| Pulitore al plasma | Nordson | AP-300 | Sistema di trattamento al plasma da banco |
| Kit di polidimetilsilossano (PDMS) | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Poli-tetrafluoroetilene (PTFE) | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | diametro interno, 0,51 mm; diametro esterno, 0,82 mm |
| Nastro rimovibile | 3M Company | Scotch Nastro rimovibile 811 | |
| Wafer di silicone | Eltech corperazione | SPE0039 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Stereomicroscopio | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| SU-8 10 fotoresist negativi | MicroChem | Y131259 | |
| SU-8 2 fotoresist negativi | MicroChem | Y131240 | |
| SU-8 2050 fotoresist negativo | MicroChem | Y111072 | |
| sviluppatore SU-8 | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | acetato di glicole propilenico monometilico |
| Apparecchio Harvard | 703007 | ||
| Triclorosilano | Gelest, Inc | SIT8174.0 | Tridecafluoro-1,1,2,2-tetraidroottil. Rischioso. Corrosivo per le vie respiratorie, reagisce violentemente con l'acqua. |
| Soluzione neutralizzante della tripsina | Gibco | R-002-100 |
Riferimenti
- Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065(2014).
- Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y.
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Ristampe e permessi
