Articolo metodologico

Stabilire coculture basate su una singola cellula in modo deterministico con un chip microfluidico

DOI:

10.3791/60202

⸱

27 settembre 2019

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Engineering and Nanomedicine, National Health Research Institutes, 2Ph.D. Program in Tissue Engineering and Regenerative Medicine, National Chung Hsing University, 3National Institute of Cancer Research, National Health Research Institutes

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo rapporto descrive un metodo microfluidico basato su chip per impostare un esperimento di coltura a cella singola in cui è possibile ottenere l'abbinamento ad alta efficienza e l'analisi microscopica di più cellule singole.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I saggi di cocoltura cellulare sono stati ampiamente utilizzati per studiare le interazioni cellula-cellula tra diversi tipi di cellule per comprendere meglio la biologia delle malattie tra cui il cancro. Tuttavia, è difficile chiarire il complesso meccanismo delle interazioni intercellulari in popolazioni cellulari altamente eterogenee che utilizzano sistemi di cocoltura convenzionali perché l'eterogeneità della sottopopolazione cellulare è oscurata dai valori medi; i sistemi di cocoltura convenzionali possono essere utilizzati solo per descrivere il segnale della popolazione, ma non sono in grado di monitorare il comportamento delle singole cellule. Inoltre, i metodi sperimentali convenzionali a cella singola hanno una bassa efficienza nella manipolazione cellulare a causa della distribuzione di Poisson. I dispositivi microfabbricati sono una tecnologia emergente per gli studi a cella singola perché possono manipolare con precisione singole cellule ad alta produttività e possono ridurre il consumo di campioni e reagenti. Qui, descriviamo il concetto e l'applicazione di un chip microfluidico per più cocolture unicellulari. Il chip è in grado di catturare in modo efficiente più tipi di singole cellule in una camera di coltura (46%) e dispone di uno spazio di coltura sufficiente utile per studiare il comportamento delle cellule (ad esempio, migrazione, proliferazione, ecc.) sotto l'interazione cellula-cellula a livello di cellula singola. Le cellule endotiliche linfotiche e il carcinoma a cellule squamose orali sono stati utilizzati per eseguire un esperimento di cocoltura a cellule singole sulla piattaforma microfluidica per studi di interazione tra le singole imcellere dal vivo.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'acquisizione efficiente di diversi tipi di celle singole e la fornitura di spazio di coltura sufficiente sono necessari per esperimenti di cocoltura a cella singola di più tipi di celle singole1. Limitare la diluizione è il metodo più comunemente usato per preparare le singole cellule per tali esperimenti, a causa del basso costo delle attrezzature necessarie. Tuttavia, a causa della limitazione della distribuzione di Poisson, la probabilità massima di acquisizione di una singola cellula è solo del 37%, rendendo l'operazione sperimentale laboriosa e dispendiosa in termini di tempo2. Al contrario, l'utilizzo dello smist....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Fabbricazione di uno stampo di wafer mediante litografia morbida

NOTA: i dati del modello maschera sono disponibili nella pubblicazione precedente14.

  1. Disidratare un wafer di silicio da 4 pollici in un forno a 120 gradi per 15 min.
  2. Cappotto di rotazione 4 g di SU-8 2 fotoresist negativo su un wafer di silicio da 4 pollici a 1.000 giri/m per 30 s per creare uno strato di 5 m di spessore (strato #1).
  3. Cuocere lo strato morbido #1 su una piastra calda di 65 gradi centigradi per 1 min e poi trasferire lo strato #1 a una piastra calda di 95 gradi per 3 min.
  4. Strato freddo #1 a tempe....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il dispositivo ha una struttura a tre strati come mostrato dalla fotografia trasversale di un dispositivo PDMS tagliato (Figura 1A). Il primo strato contiene un sito di cattura (6,0 m di larghezza e 4,6 m di altezza) che collega la camera di coltura e il canale di passaggio. La differenza di resistenza al flusso tra la camera di coltura e il canale by-pass fa sì che le cellule scorra nella posizione di cattura e riempiono l'ingresso del picco.......

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le interazioni intercellulari di varie cellule nel microambiente tumorale svolgono un ruolo importante nella progressione del tumore17. Per comprendere il meccanismo delle interazioni cellula-cellula, i sistemi di cocoltura vengono utilizzati come metodo analitico comune. Tuttavia, più tipi di cellule e l'eterogeneità delle cellule stesse hanno portato a complessità sperimentale e difficoltà analitiche.

Il chip di chiusura idrodinamico consente il caricamento di più cel.......

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del Ministero della Scienza e della Tecnologia (105-2628-E-400-001-MY2), e dal Ph.D. Program in Ingegneria dei Tessuti e Medicina Rigenerativa, dalla National Chung Hsing University e dagli Istituti nazionali di ricerca sulla salute.

....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Nastro medico microfluidico diagnostico poliolefinico avanzato 3MCompany9795R
AntibioticiBiowestL0014-100Glutammina-Penicillina-Streptomicina
Software AutoCADAutodeskAutoCAD LT 2011Codice 057C1-74A111-1001
Colorante CellTracke CMAC bluInvitrogenC2110
Colorante CMFDA verdeInvitrogenC7025
Forno convenzionaleYEONG-SHIN aziendaovp45
EssiccatoreBel-Art ProductsF42020-0000Essiccatore sottovuoto salvaspazio 190 mm base bianca
DiIC12 (3) colorante a membrana cellulare BDBiosciences354218Utilizzato come tracker cellulare
DMEM-F12 medioGibco11320-082
Terreno di crescita delle cellule endoteliali MV 2PromoCellC-22022
Siero fetale bovino HycloneThermoSH30071.03HI
Hamilton serie 700 Siringa di vetro ( 0,1 ml )Hamilton80630100 &; L, modello 710 RN SYR, piccolo NDL rimovibile, 22s ga, 2 pollici, stile punta 2
Harris Uni-Core perforatoreTed Pella Inc.15075con
perforatore Harris Uni-CoreTed Pella Inc.15071con diametro interno di 0,5 mm
Piastra riscaldanteYOTEC aziendaYS-300S
Msak allineatoreDeya Optronic CO.A1K-5-MDA
Plasma di ossigenoNORDSON MARCHAP-300
Pulitore al plasmaNordsonAP-300Sistema di trattamento al plasma da banco
Kit di polidimetilsilossano (PDMS)Dow corningSylgard 184
Poli-tetrafluoroetilene (PTFE)Ever Sharp Technology, Inc.TFT-23Tdiametro interno, 0,51 mm; diametro esterno, 0,82 mm
Nastro rimovibile3M CompanyScotch Nastro rimovibile 811
Wafer di siliconeEltech corperazioneSPE0039
Spin coaterSynrex Co., Ltd.SC-HMI 2" ~ 6"
StereomicroscopioLeica MicrosystemsLeica E24
SU-8 10 fotoresist negativiMicroChemY131259
SU-8 2 fotoresist negativiMicroChemY131240
SU-8 2050 fotoresist negativoMicroChemY111072
sviluppatore SU-8Grand Chemical CompaniesGP5002-000000-72GCacetato di glicole propilenico monometilico
Apparecchio Harvard703007
TriclorosilanoGelest, IncSIT8174.0Tridecafluoro-1,1,2,2-tetraidroottil. Rischioso. Corrosivo per le vie respiratorie, reagisce violentemente con l'acqua.
Soluzione neutralizzante della tripsinaGibcoR-002-100
da 1,5 mm di diametro interno Pompa a siringa con

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065(2014).
  2. Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Single Cell Co CultureCell Capture EfficiencyPDMS DeviceLymphatic Endothelial CellsOral Squamous Cell CarcinomaSyringe Pump LoadingCell Suspension PreparationTriple Single CultureDynamic Live Imaging

Articoli correlati