È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Caratterizzazione dei miRNA associati funzionalmente nel Glioblastoma e della loro ingegneria in cluster artificiali per la terapia genica

5.4K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/60215

⸱

4 ottobre 2019

 , 
1Department of Neurosurgery, Brigham and Women's Hospital-Harvard Medical School

In questo articolo

Sommario

Descritto qui è un protocollo per caratterizzare i moduli di miRNA biologicamente sinergici e il loro assemblaggio in transgeni brevi, che consente la sovraespressione simultanea per applicazioni di terapia genica.

Abstract

La rilevanza biologica dei microRNA (miRNA) nella salute e nella malattia si basa in modo significativo su combinazioni specifiche di molti miRNA contemporaneamente deregolamentati piuttosto che sull'azione di un singolo miRNA. La caratterizzazione di questi moduli specifici di miRNA è un passo fondamentale per massimizzare il loro uso in terapia. Questo è estremamente rilevante perché i loro attributi combinatori possono essere praticamente sfruttati. Descritto qui è un metodo per definire una firma miRNA specifica rilevante per il controllo dei repressori di cromatina oncogenia nel glioblastoma. L'approccio definisce prima un gruppo generale di miRNA che sono deregolati nei tumori rispetto al tessuto normale. L'analisi viene ulteriormente perfezionata dalle condizioni di coltura differenziali, sottolineando un sottogruppo di miRNA che vengono co-espressi contemporaneamente durante specifici stati cellulari. Infine, i miRNA che soddisfano questi filtri sono combinati in un transgene policistronico artificiale, che si basa su uno scaffolding di geni di cluster miRNA naturalmente esistenti, quindi utilizzati per la sovraespressione di questi moduli miRNA nelle cellule riceventi.

Introduzione

I miRNA offrono un'opportunità ineguagliabile per lo sviluppo di un ampio approccio di terapia genica a molte malattie1,2,3, compreso il cancro4,5. Questo si basa su diverse caratteristiche uniche di queste molecole biologiche, tra cui la loro piccola dimensione6, semplice biogenesi7, e la tendenza naturale a funzionare in associazione8. Molte malattie sono caratterizzate da specifici modelli di espressione del miRNA, che spesso convergono sulla regolazione di funzioni biologiche complesse9. Lo scopo di questo metodo è innanzitutto quello di definire una strategia per identificare gruppi di miRNA che sono sinergicamente rilevanti per funzioni cellulari specifiche. Di conseguenza, fornisce una strategia per il ripristino di tali combinazioni di miRNA in studi e applicazioni a valle.

Questo metodo consente l'analisi funzionale di più miRNA contemporaneamente, sfruttando il loro targeting simultaneo di un gran numero di mRNA, ricapitolando così i complessi paesaggi delle malattie. Questo approccio è stato recentemente impiegato per definire un gruppo di tre miRNA che 1) sono contemporaneamente downregolati nel cancro al cervello e 2) mostrano un forte modello di co-espressione durante la differenziazione neurale, nonché in risposta allo stress genotossico da radiazioni o un Agente alchiante del DNA. La riequivocazione combinatoria di questo modulo di tre miRNA con il metodo di clustering descritto di seguito si traduce in una profonda interferenza con la biologia delle cellule tumorali e può essere facilmente utilizzata come strategia di terapia genica per studi preclinici10. Questo protocollo può essere di particolare interesse per coloro che sono coinvolti nella ricerca sui miRNA e sulle sue applicazioni traslazionali.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

1. Caratterizzazione dei miRNA associati funzionalmente in Glioblastoma

  1. Analisi dell'espressione di miRNA differenziale ampia nel glioblastoma rispetto al cervello
    1. In primo luogo, determinare i miRNA più significativamente deregolamentati nel tumore. Ciò può essere ottenuto utilizzando almeno tre diversi metodi:
      1. Estrarre l'Atlante del Genoma del Cancro, trovato a https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga, per i dati di sequenziamento11.
      2. Eseguire l'analisi microarray da un nuovo campione operativo12.
      3. Utilizzare i set di dati pubblicati in precedenza13.
        NOT: Qualunque sia il metodo scelto, l'output fornisce un insieme di massa di miRNA la cui espressione è statisticamente correlata (direttamente o inversamente) con la biologia del tumore. Questo gruppo iniziale costituisce il pool di miRNA che vengono ulteriormente analizzati per l'identificazione di un sottoinsieme di miRNA che mostra l'associazione funzionale più rigorosa eseguendo un'analisi più dinamica delle modifiche di espressione, come descritto di seguito.
  2. Analisi dell'espressione miRNA specifica della condizione
    1. Induzione della differenziazione cellulare:
      1. Utilizzare piatti di plastica poli-D-lysina (PDL) pre-rivestiti per favorire la formazione di una coltura monostrato. Per il rivestimento dei piatti, sciogliere la PDL in acqua a una concentrazione di 100 g/mL. Utilizzare 1 mL di soluzione per 25 cm2 superficie. Risciacquare 2x con PBS 6 h dopo l'applicazione della soluzione PDL.
      2. Piastra di cellule staminali neurali umane in quantità uguali (100.000 cellule/5 mL) o nel mezzo di cellule staminali (mezzo neurobasale , integratore B27 , 20 ng/mL EGF/FGF), mezzo di differenziazione astrocitica (DMEM - 10% FBS), o mezzo di differenziazione neuronale (mezzo neurobasale 2 - acido retinoico M)14. Il protocollo per la differenziazione oligodendrociti richiede l'aggiunta di IGF-1 (200 ng/mL) dopo la rimozione EGF/FGF14,15.
      3. Dopo la placcatura cellulare, inserire in incubatrice per 1 settimana a 37 gradi centigradi, 5% di CO2.
    2. Estrazione dell'RNA:
      1. Dopo 7 giorni, rimuovere le cellule dall'incubatrice e rimuovere il mezzo.
      2. Lavare le cellule con PBS (5 mL). Quindi, aggiungere 1 mL di reagente di lisi (vedi Tabella dei materiali) per lesiare le cellule e raschiare le cellule nel tubo di microfuge da 1,5 mL utilizzando un raschietto cellulare. Conservare i tubi contenenti le cellule lismi a temperatura ambiente (RT) per 5 min.
      3. Procedere all'isolamento totale dell'RNA seguendo le istruzioni del produttore.
    3. Analisi dell'espressione miRNA:
      1. Quantificare l'espressione differenziale di miRNA specifici identificati nel passaggio 1.1 tra i tre modelli di differenziazione da PCR in tempo reale, utilizzando sonde TaqMan e seguendo i protocolli del produttore per la trascrizione inversa e l'amplificazione PCR ( Figura 1).
  3. Convalida dei cluster di miRNA per difficoltà specifiche dello stress
    1. Coltura G34 glioblastoma cellule staminali nel mezzo neurobasale - supplemento B27 - 20 ng/mL EGF/FGF. Iniziare con 1 x 106 celle in 5 mL in un fiaschetta di fissaggio basso di 25 cm2.
    2. A partire da 48 h dopo la placcatura, aggiungere le concentrazioni di raddoppio del DNA di alchilante agente temozolomide (TM) ogni 5 giorni, come segue:
      1. Iniziare con 5 M per 5 giorni. Dopo 5 giorni, rimuovere il mezzo e sostituire con un mezzo fresco senza temolomide, per consentire alle cellule sopravvissute di recuperare. Dopo 48 h, aggiungere 10 M TM e incubare per altri 5 giorni.
      2. Ripetere ogni volta il passo 1.3.2.1, raddoppiando la concentrazione di TM, fino a quando non viene raggiunta una concentrazione di almeno 100 M e le cellule diventano resistenti al farmaco10.
    3. In un esperimento parallelo, irradiare le cellule G34 come segue:
      1. A partire da 48 h dopo la placcatura di 1 x 106 cellule in 5 mL in un fiascheta a basso attaccamento di 25 cm2, è accettabile irradiare le cellule con 2 Gy di energia (qualsiasi irradiatore che fornisce emissione di fotoni è accettabile). Riportare le cellule all'incubatrice e non disturbare. Dopo 48 h, irradiare nuovamente le cellule con ulteriori 2 Gy di energia.
      2. Ripetere il passaggio 1.3.3.1 4x fino a somministrare un totale di 10 Gy di energia.
      3. Riportare le cellule all'incubatrice e lasciarle recuperare in mezzo fresco per almeno 5 giorni prima dell'analisi a valle.
    4. Dopo l'induzione della resistenza, le cellule di lisi che utilizzano il reagente di lisi ed estrarre l'RNA totale secondo il protocollo del produttore.
    5. Analizzare l'espressione dei miRNA specifici identificati nelle sezioni 1.1-1.2 come descritto nel passaggio 1.2.1 (Figura 2).
  4. Caratterizzazione della convergenza funzionale dei miRNA raggruppati
    1. Ottenere il targetoma previsto di ogni miRNA definito nelle sezioni 1.2-1.3 ottenuto utilizzando gli strumenti di previsione del targeting miRNA.
      NOT: Generalmente ricorriamo a TargetScan, come il suo algoritmo viene periodicamente aggiornato16. Gli strumenti di stima aggiuntivi sono miRanda17, miRDB18e DIANA-miRPath19. Tutti questi programmi sono applicazioni gratuite basate sul web.
      1. Dalla prima pagina di Targetscan, selezionare il miRNA di interesse dal menu a discesa pre-popolato. Fare clic sul pulsante Invia.
      2. Scaricare l'elenco risultante delle destinazioni come foglio di calcolo utilizzando il collegamento Scarica tabella (Supplementary Figure 1).
      3. Per ridurre le possibilità di previsioni di falsi positivi, includere solo gli obiettivi all'interno della colonna siti conservati nelle analisi a valle. Inoltre, è possibile ottenere ulteriore rigore utilizzando ulteriori programmi di previsione del miRNA (vedi sopra) e includendo solo gli obiettivi comuni a tutti gli algoritmi.
    2. Classificare i targetomi risultanti in base alle categorie di Ontologia genica utilizzando ToppGene Suite20 per valutare l'arricchimento dei percorsi comuni a ciascun miRNA.
      1. Incollare l'elenco degli obiettivi ottenuti dal passaggio 1.4.1 nella finestra "Set di geni di formazione", utilizzando il simbolo HGNC come tipo di voce. Fare clic su Invia > Avvia. Il programma fornirà una tabella di output che mostra le categorie "Go" più significative per l'elenco di geni inserito (Figura supplementare 2).
    3. Per stabilire infine il contributo di ciascun miRNA alla regolazione di un percorso comune o di un processo cellulare (in questo caso, regolazione della cromatina), controllare ogni targetoma ottenuto nel passaggio 1.4.1 rispetto all'elenco completo dei geni coinvolti nel processo cellulare specifico ( regola della cromatina), utilizzando la funzione diagramma di Venn fornita nel sito web Bioinformatics and Evolutionary Genomics http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn.
      NOT: Questo programma consente l'intersezione di più gruppi contemporaneamente (Figura 3). Gli obiettivi unici specifici forniti da ogni miRNA vengono quindi annotati e selezionati per esperimenti funzionali a valle.
      1. Nella prima pagina del programma, caricare o copiare/incollare l'elenco se i mRNA di destinazione per ogni miRNA o interesse nelle rispettive finestre. Assegnare un nome a ogni elenco con un identificatore univoco.
      2. Fare clic su Invia. Il programma fornirà un output visivo di un diagramma di Venn con un numero di geni in ogni settore, nonché un elenco completo di mRNA per ogni subset e combinazioni di intersezioni.

2. Assemblaggio di moduli miRNA in un cluster transgenico policistronico

  1. Preparazione dello scaffold transgenico a base di locus a grappolo miR-17-92
    1. Ottenere la sequenza nucleotidica dell'ammasso miR-17-92 dal browser genoma Ensembl21. Selezionare la sequenza "core" della coppia di basi da 800 dollari che comprende tutte e sei forcine miRNA codificate del locus e almeno 200-nucleotide flanking sequenze sia a monte (5') che a valle (3') della sequenza di core.
    2. Incollare la sequenza precedente in qualsiasi programma di modifica delle parole.
    3. Definire la sequenza di ciascuna delle sei forcine native recuperandole in miRBase22. Contrassegnare ciascuna di queste sequenze nell'intervallo della sequenza "core" identificata in precedenza. Tutte le sequenze tra ogni tornante rappresentano sequenze distanziali, che sono importanti per la corretta elaborazione del transgene.
    4. Rimuovere le sequenze di tornanti nativi dalla sequenza "core", con l'eccezione di 3-5 nucleotidi a entrambe le estremità 5' e 3' di ogni forcina, che servirà come accettatore per le nuove forcine.
  2. Costruire un nuovo transgene che codifica più miRNA di scelta
    1. Ottenere sequenze fornacchia di miRNA destinati ad essere sovraespressi nel transgene da miRBase. Notare attentamente i nucleotidi specifici che sono i siti di scissione microprocessore.
    2. Sostituire le forcine rimosse (passaggio 2.1.4) con le sequenze di tornanti dei miRNA desiderati ottenute nel passaggio 2.2.1.
    3. Aggiungere le sequenze di restrizione desiderate in entrambe le regioni di fianco del transgene per facilitare la subclonazione nei vettori di consegna di scelta. Verificare che le sequenze di restrizione scelte non siano presenti all'interno della sequenza stessa.
    4. Per i controlli negativi, utilizzare sequenze criptato a 20 nucleotidi per sostituire la sequenza naturale di 20 nucleotidi di ogni miRNA maturo. Generare queste sequenze criptate utilizzando uno strumento online come https://genscript.com/tool/create-scrambled-sequence.
  3. Verifica della struttura bidimensionale del transgene
    1. Copiare la sequenza transgenica completa nel programma software di previsione della struttura dell'RNA RNAweb Fold23.
    2. Utilizzando le impostazioni standard del programma, fare clic su Procedi.
    3. Analizzare l'output grafico, in particolare per la presenza di forcine ben definite e la presenza di strutture staminali a doppio filamento almeno 11 nucleotidi proximali al sito di scissione microprocessore. Inoltre, cercare l'assenza di punti di diramazione all'interno delle sequenze di tornanti (Figura 4).

3. Ottenere i Transgeni mediante sintesi del DNA

  1. Dopo la progettazione e la convalida in silico dell'ammasso di miRNA chimerico, ottenere la sequenza di lavoro utilizzando la sintesi del DNA da fornitori commerciali24 e procedere con la clonazione a valle in vettori e consegna transgenica. Abbiamo usato vettori lentivirali per la consegna in vitro10 e virus adeno-associati (AAV) per la consegna invivo intracranica25.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Questo metodo ha permesso la caratterizzazione di un modulo di tre miRNA che sono costantemente downregolati nei tumori cerebrali, che sono co-espressi specificamente durante la differenziazione neuronale (Figura 1) e coinvolti nella risposta di sopravvivenza del tumore dopo terapia (Figura 2). Ciò si ottiene regolando un complesso percorso repressivo della cromatina oncogenica. Questo modello di co-espressione ha suggerito una f...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Questo protocollo si basa sulla nozione che, invece di funzionare in isolamento, i miRNA sono biologicamente rilevanti lavorando in gruppi, e questi gruppi sono stabiliti trascrizionalmente da contesti cellulari specifici26. Per giustificare questo approccio da una prospettiva traslazionale, viene introdotto un protocollo di follow-up che consente la ricreazione di questo modello multi-miRNA nelle cellule/tessuti. Ciò è possibile sfruttando la biogenesi relativamente semplice dei miRNA, per cui il...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non segnalano conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare i membri del Laboratorio di Oncologia Neuro Harvey Cushing per il sostegno e la critica costruttiva. Questo lavoro è stato supportato da NINDS concede K12NS80223 e K08NS101091 a P. P.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,4% agarosio a bassa temperatura di fusione IBI ScientificIB70058
0,45 µ Unità filtrante sterile MMerck MilliporeSLH033RS
Provetta per microcentrifuga da 1,5 mLEppendorf22431081
piastre a 6 pozzetti Greiner Bio-One657160
Topi atimici (FoxN1 nu/nu)Envigo069(nu)/070(nu/+)
B-27 Supplemento Thermo Fisher Scientific12587010
Pallone per colture cellulariGreiner Bio-One660175
Raschietto cellulare, 16cmSarstedt83.1832
Cesio 137 irradiatore JL Sheperd and AssociatesCore Facility (Harvard Medical School)
CloroformioSigma-Aldrich439142-4L
DMEM, alto glucosio, piruvato Thermo Fisher Scientific11995040
Dulbecco' soluzione salina tamponata con fosfati Soluzione Gibco14190144
Eosin Y Sigma-AldrichE4009
Siero fetale bovino Soluzione di formalina Sigma-AldrichF9665
Sigma-AldrichHT501128
GlutaMAX Supplement Thermo Fisher Scientific35050061
HEK-293Collezione di colture di tipo americanoATCC CRL-1573
Soluzione di ematossilinaSigma-Aldrich1051750500
Cellule staminali primarie di glioma umano (GBM62)Fornito dal Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women' s Hospital, Boston, MA)
Cellule staminali primarie umane di glioma (MGG4)Fornito dal Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA)
Vettore lentivirale pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFPSystem BiosciencesCD511B-1
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific11668019
Microcentrifuga refrigerataEppendorfmodello n. 5424 R, n. cat. 5404000138
Mezzo di montaggio Thermo Fisher Scientific4112APG
Nalgene Provette per centrifuga a fondo tondo in policarbonato ad alta velocità Thermo Fisher Scientific 3117-0380PK
NanoDropThermo Fisher Scientific2000c
Cellule progenitrici neurali (NPC)Fornito dal Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women' s Hospital, Boston, MA)
Terreno neurobasale Thermo Fisher Scientific21103049
Nikon eclipse Ti sistema di microscopio a fluorescenza motorizzatoNikon, Giappone14314
Opti-MEMThermo Fisher Scientific 31985088
provette per PCR Sigma-AldrichCLS6571-960EA
Penicillina-Streptomicina Thermo Fisher Scientific15140122
Piastre di Petri 94/16 Greiner Bio-One632180
Poli-D-Lisina Sigma-AldrichP4707
EGF umano ricombinante PeproTech AF-100-15
FGF umano ricombinante-basic PeproTech AF-100-18B
Acido retinoicoGibco12587-010 
Kit di miniprep RNADirect-zolR2050
S1000 TermociclatoreBio-RAD1852196
Micro Irradiatore Guidato da Immagini per Piccoli Animali Xstrahal Life Sciences, Regno UnitoStabilimento principale (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA)
Sorvall WX+ Ultracentrifuge Thermo Fisher Scientific 
StemPro Accutase Thermo Fisher ScientificA1110501
StepOne Sistema di PCR in tempo realeBiosistemi applicati 
Cabina di biosicurezza SterilGARD The Baker CompanySG403A-HE
S9378
T98-GCultura di tipo americano CollectiATCC CRL-1690
TaqMan MicroRNA Kit di trascrizione inversaThermo Fisher Scientific4366596
TaqMan Universal PCR Master MixThermo Fisher Scientific4324018
TemozolomideTocris Bioscience2706
Tissue-Tek temperatura di taglio ottimale Fisher ScientificNC9636948
Reagente TRIzol Thermo Fisher Scientific15596026Reagente per lisi
U251-MGColtura di tipo americano CollectiATCC HTB-17
U87-MG ViraPower CollectiATCC HTB-14
ViraPowerThermo Fisher ScientificK4970-00
Acqua, grado HPLCFisherW54
Xilene Sigma-Aldrich534056
750001004376357 Saccarosio Sigma-Aldrich Sistema di espressione lentivettoriale

Riferimenti

  1. Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
  2. Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nature Reviews Genetics. 12, 861-874 (2011).
  3. Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer's Disease: A Meta-Analysis Approach. Scientific Reports. 8, 4767(2018).
  4. Calin, G. A., et al. Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 99, 15524-15529 (2002).
  5. Croce, C. M. Causes and consequences of miRNA dysregulation in cancer. Nature Reviews Genetics. 10, 704-714 (2009).
  6. Ambros, V. miRNAs: tiny regulators with great potential. Cell. 107, 823-826 (2001).
  7. Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).
  8. He, L., et al. A miRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435, 828-833 (2005).
  9. Santos, M. C., et al. miR-124, −128, and −137 orchestrate neural differentiation by acting on overlapping gene sets containing a highly connected transcription factor network. Stem Cells. 34, 220-232 (2016).
  10. Bhaskaran, V., et al. The functional synergism of miRNA clustering provides therapeutically relevant epigenetic interference in glioblastoma. Nature Communications. 10 (1), 442(2019).
  11. Kim, T. M., Huang, W., Park, R., Park, P. J., Johnson, M. D. A developmental taxonomy of glioblastoma defined and maintained by MiRNAs. Cancer Research. 71 (9), 3387-3399 (2011).
  12. Dell'Aversana, C., Giorgio, C., Altucci, L. MiRNA Expression Profiling Using Agilent One-Color Microarray. Methods in Molecular Biology. 1509, 169-183 (2017).
  13. Silber, J., et al. miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells. BMC Medicine. 6 (14), (2008).
  14. Hester, M. E., et al. Two factor reprogramming of human neural stem cells into pluripotency. PLoS ONE. 4 (9), e7044(2009).
  15. Hsieh, J., et al. IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes. Journal of Cell Biology. 164 (1), 111-122 (2004).
  16. Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective miRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005(2015).
  17. Betel, D., Wilson, M., Gabow, A., Marks, D. S., Sander, C. The miRNA.org resource: targets and expression. Nucleic Acids Research. 36, D149-D153 (2008).
  18. Wong, N., Wang, X. miRD(B) an online resource for miRNA target prediction and functional annotations. Nucleic Acids Research. 43 (D1), D146-D152 (2015).
  19. Vlachos, I. S., et al. DIANA-miRPath v3.0: deciphering miRNA function with experimental support. Nucleic Acids Research. 43 (W1), W460-W466 (2015).
  20. Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization. Nucleic Acids Research. 305, W305-W311 (2009).
  21. Aken, B. L., et al. Ensembl 2017. Nucleic Acids Research. 45, D635-D642 (2017).
  22. Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from miRNA sequences to function. Nucleic Acid Research. 47, D155-D162 (2019).
  23. Lorenz, R., et al. Vienna RNA Package 2.0. Algorithms for Molecular Biology. 6 (1), 26(2011).
  24. Hughes, R. A., Ellington, A. D. Synthetic DNA synthesis and assembly: Putting the synthetic in synthetic biology. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (1), a023812(2017).
  25. Crommentuijn, M. H., et al. Intracranial AAV-sTRAIL combined with lanatoside C prolongs survival in an orthotopic xenograft mouse model of invasive glioblastoma. Molecular Oncology. 10 (4), 625-634 (2016).
  26. Ivey, K. N., Srivastava, D. MiRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions. Cell Stem Cell. 7, 36-41 (2010).
  27. Han, J., et al. Molecular Basis for the Recognition of Primary miRNAs by the Drosha-DGCR8 Complex. Cell. 125, 887-901 (2006).
  28. Barroso-del Jesus, A., Lucena-Aguilar, G., Menendez, P. The miR-302-367 cluster as a potential stemness regulator in ESCs. Cell Cycle. 8, 394-398 (2009).
  29. Liu, Y. P., Haasnoot, J., Brake, O., Berkhout, B., Konstantinova, P. Inhibition of HIV-1 by multiple shRNAs expressed from a single miRNA polycistron. Nucleic Acid Research. 36, 2811-2824 (2008).
  30. Chen, S. C., Stern, P., Guo, Z., Chen, J. Expression of Multiple Artificial MiRNAs from a Chicken miRNA126-Based Lentiviral Vector. PLoS ONE. 6 (7), e22437(2011).
  31. Yang, X., Marcucci, K., Anguela, X., Couto, L. B. Preclinical Evaluation of An Anti-HCV miRNA Cluster for Treatment of HCV Infection. Molecular Therapy. 21, 588-601 (2013).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Moduli di microRNATerapia del glioblastomaTransgeni policistronici artificialiScaffold di miR-17-92Analisi TargetScanToppGene SuiteFunzione del diagramma di VennPredizione della struttura dell'RNAResistenza alla temozolomideCellule staminali neurali
Caratterizzazione dei miRNA associati funzionalmente nel Glioblastoma e della loro ingegneria in cluster artificiali per la terapia genica
Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.