Caratterizzazione dei miRNA associati funzionalmente nel Glioblastoma e della loro ingegneria in cluster artificiali per la terapia genica

Sommario

Descritto qui è un protocollo per caratterizzare i moduli di miRNA biologicamente sinergici e il loro assemblaggio in transgeni brevi, che consente la sovraespressione simultanea per applicazioni di terapia genica.

Abstract

La rilevanza biologica dei microRNA (miRNA) nella salute e nella malattia si basa in modo significativo su combinazioni specifiche di molti miRNA contemporaneamente deregolamentati piuttosto che sull'azione di un singolo miRNA. La caratterizzazione di questi moduli specifici di miRNA è un passo fondamentale per massimizzare il loro uso in terapia. Questo è estremamente rilevante perché i loro attributi combinatori possono essere praticamente sfruttati. Descritto qui è un metodo per definire una firma miRNA specifica rilevante per il controllo dei repressori di cromatina oncogenia nel glioblastoma. L'approccio definisce prima un gruppo generale di miRNA che sono deregolati nei tumori rispetto al tessuto normale. L'analisi viene ulteriormente perfezionata dalle condizioni di coltura differenziali, sottolineando un sottogruppo di miRNA che vengono co-espressi contemporaneamente durante specifici stati cellulari. Infine, i miRNA che soddisfano questi filtri sono combinati in un transgene policistronico artificiale, che si basa su uno scaffolding di geni di cluster miRNA naturalmente esistenti, quindi utilizzati per la sovraespressione di questi moduli miRNA nelle cellule riceventi.

Introduzione

I miRNA offrono un'opportunità ineguagliabile per lo sviluppo di un ampio approccio di terapia genica a molte malattie^1,2,3, compreso il cancro^4,5. Questo si basa su diverse caratteristiche uniche di queste molecole biologiche, tra cui la loro piccola dimensione⁶, semplice biogenesi⁷, e la tendenza naturale a funzionare in associazione⁸. Molte malattie sono caratterizzate da specifici modelli di espressione del miRNA, che spesso convergono sulla regolazione di funzioni biologiche complesse⁹. Lo scopo di questo metodo è innanzitutto quello di definire una strategia per identificare gruppi di miRNA che sono sinergicamente rilevanti per funzioni cellulari specifiche. Di conseguenza, fornisce una strategia per il ripristino di tali combinazioni di miRNA in studi e applicazioni a valle.

Questo metodo consente l'analisi funzionale di più miRNA contemporaneamente, sfruttando il loro targeting simultaneo di un gran numero di mRNA, ricapitolando così i complessi paesaggi delle malattie. Questo approccio è stato recentemente impiegato per definire un gruppo di tre miRNA che 1) sono contemporaneamente downregolati nel cancro al cervello e 2) mostrano un forte modello di co-espressione durante la differenziazione neurale, nonché in risposta allo stress genotossico da radiazioni o un Agente alchiante del DNA. La riequivocazione combinatoria di questo modulo di tre miRNA con il metodo di clustering descritto di seguito si traduce in una profonda interferenza con la biologia delle cellule tumorali e può essere facilmente utilizzata come strategia di terapia genica per studi preclinici¹⁰. Questo protocollo può essere di particolare interesse per coloro che sono coinvolti nella ricerca sui miRNA e sulle sue applicazioni traslazionali.

Protocollo

1. Caratterizzazione dei miRNA associati funzionalmente in Glioblastoma

1. Analisi dell'espressione di miRNA differenziale ampia nel glioblastoma rispetto al cervello
   1. In primo luogo, determinare i miRNA più significativamente deregolamentati nel tumore. Ciò può essere ottenuto utilizzando almeno tre diversi metodi:
      1. Estrarre l'Atlante del Genoma del Cancro, trovato a https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga, per i dati di sequenziamento¹¹.
      2. Eseguire l'analisi microarray da un nuovo campione operativo¹².
      3. Utilizzare i set di dati pubblicati in precedenza¹³.
         NOT: Qualunque sia il metodo scelto, l'output fornisce un insieme di massa di miRNA la cui espressione è statisticamente correlata (direttamente o inversamente) con la biologia del tumore. Questo gruppo iniziale costituisce il pool di miRNA che vengono ulteriormente analizzati per l'identificazione di un sottoinsieme di miRNA che mostra l'associazione funzionale più rigorosa eseguendo un'analisi più dinamica delle modifiche di espressione, come descritto di seguito.
2. Analisi dell'espressione miRNA specifica della condizione
   1. Induzione della differenziazione cellulare:
      1. Utilizzare piatti di plastica poli-D-lysina (PDL) pre-rivestiti per favorire la formazione di una coltura monostrato. Per il rivestimento dei piatti, sciogliere la PDL in acqua a una concentrazione di 100 g/mL. Utilizzare 1 mL di soluzione per 25 cm² superficie. Risciacquare 2x con PBS 6 h dopo l'applicazione della soluzione PDL.
      2. Piastra di cellule staminali neurali umane in quantità uguali (100.000 cellule/5 mL) o nel mezzo di cellule staminali (mezzo neurobasale , integratore B27 , 20 ng/mL EGF/FGF), mezzo di differenziazione astrocitica (DMEM - 10% FBS), o mezzo di differenziazione neuronale (mezzo neurobasale 2 - acido retinoico M)¹⁴. Il protocollo per la differenziazione oligodendrociti richiede l'aggiunta di IGF-1 (200 ng/mL) dopo la rimozione EGF/FGF^14,15.
      3. Dopo la placcatura cellulare, inserire in incubatrice per 1 settimana a 37 gradi centigradi, 5% di CO₂.
   2. Estrazione dell'RNA:
      1. Dopo 7 giorni, rimuovere le cellule dall'incubatrice e rimuovere il mezzo.
      2. Lavare le cellule con PBS (5 mL). Quindi, aggiungere 1 mL di reagente di lisi (vedi Tabella dei materiali) per lesiare le cellule e raschiare le cellule nel tubo di microfuge da 1,5 mL utilizzando un raschietto cellulare. Conservare i tubi contenenti le cellule lismi a temperatura ambiente (RT) per 5 min.
      3. Procedere all'isolamento totale dell'RNA seguendo le istruzioni del produttore.
   3. Analisi dell'espressione miRNA:
      1. Quantificare l'espressione differenziale di miRNA specifici identificati nel passaggio 1.1 tra i tre modelli di differenziazione da PCR in tempo reale, utilizzando sonde TaqMan e seguendo i protocolli del produttore per la trascrizione inversa e l'amplificazione PCR ( Figura 1).
3. Convalida dei cluster di miRNA per difficoltà specifiche dello stress
   1. Coltura G34 glioblastoma cellule staminali nel mezzo neurobasale - supplemento B27 - 20 ng/mL EGF/FGF. Iniziare con 1 x 10⁶ celle in 5 mL in un fiaschetta di fissaggio basso di 25 cm^2.
   2. A partire da 48 h dopo la placcatura, aggiungere le concentrazioni di raddoppio del DNA di alchilante agente temozolomide (TM) ogni 5 giorni, come segue:
      1. Iniziare con 5 M per 5 giorni. Dopo 5 giorni, rimuovere il mezzo e sostituire con un mezzo fresco senza temolomide, per consentire alle cellule sopravvissute di recuperare. Dopo 48 h, aggiungere 10 M TM e incubare per altri 5 giorni.
      2. Ripetere ogni volta il passo 1.3.2.1, raddoppiando la concentrazione di TM, fino a quando non viene raggiunta una concentrazione di almeno 100 M e le cellule diventano resistenti al farmaco¹⁰.
   3. In un esperimento parallelo, irradiare le cellule G34 come segue:
      1. A partire da 48 h dopo la placcatura di 1 x 10⁶ cellule in 5 mL in un fiascheta a basso attaccamento di 25 cm^2, è accettabile irradiare le cellule con 2 Gy di energia (qualsiasi irradiatore che fornisce emissione di fotoni è accettabile). Riportare le cellule all'incubatrice e non disturbare. Dopo 48 h, irradiare nuovamente le cellule con ulteriori 2 Gy di energia.
      2. Ripetere il passaggio 1.3.3.1 4x fino a somministrare un totale di 10 Gy di energia.
      3. Riportare le cellule all'incubatrice e lasciarle recuperare in mezzo fresco per almeno 5 giorni prima dell'analisi a valle.
   4. Dopo l'induzione della resistenza, le cellule di lisi che utilizzano il reagente di lisi ed estrarre l'RNA totale secondo il protocollo del produttore.
   5. Analizzare l'espressione dei miRNA specifici identificati nelle sezioni 1.1-1.2 come descritto nel passaggio 1.2.1 (Figura 2).
4. Caratterizzazione della convergenza funzionale dei miRNA raggruppati
   1. Ottenere il targetoma previsto di ogni miRNA definito nelle sezioni 1.2-1.3 ottenuto utilizzando gli strumenti di previsione del targeting miRNA.
      NOT: Generalmente ricorriamo a TargetScan, come il suo algoritmo viene periodicamente aggiornato¹⁶. Gli strumenti di stima aggiuntivi sono miRanda¹⁷, miRDB¹⁸e DIANA-miRPath¹⁹. Tutti questi programmi sono applicazioni gratuite basate sul web.
      1. Dalla prima pagina di Targetscan, selezionare il miRNA di interesse dal menu a discesa pre-popolato. Fare clic sul pulsante Invia.
      2. Scaricare l'elenco risultante delle destinazioni come foglio di calcolo utilizzando il collegamento Scarica tabella (Supplementary Figure 1).
      3. Per ridurre le possibilità di previsioni di falsi positivi, includere solo gli obiettivi all'interno della colonna siti conservati nelle analisi a valle. Inoltre, è possibile ottenere ulteriore rigore utilizzando ulteriori programmi di previsione del miRNA (vedi sopra) e includendo solo gli obiettivi comuni a tutti gli algoritmi.
   2. Classificare i targetomi risultanti in base alle categorie di Ontologia genica utilizzando ToppGene Suite²⁰ per valutare l'arricchimento dei percorsi comuni a ciascun miRNA.
      1. Incollare l'elenco degli obiettivi ottenuti dal passaggio 1.4.1 nella finestra "Set di geni di formazione", utilizzando il simbolo HGNC come tipo di voce. Fare clic su Invia > Avvia. Il programma fornirà una tabella di output che mostra le categorie "Go" più significative per l'elenco di geni inserito (Figura supplementare 2).
   3. Per stabilire infine il contributo di ciascun miRNA alla regolazione di un percorso comune o di un processo cellulare (in questo caso, regolazione della cromatina), controllare ogni targetoma ottenuto nel passaggio 1.4.1 rispetto all'elenco completo dei geni coinvolti nel processo cellulare specifico ( regola della cromatina), utilizzando la funzione diagramma di Venn fornita nel sito web Bioinformatics and Evolutionary Genomics http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn.
      NOT: Questo programma consente l'intersezione di più gruppi contemporaneamente (Figura 3). Gli obiettivi unici specifici forniti da ogni miRNA vengono quindi annotati e selezionati per esperimenti funzionali a valle.
      1. Nella prima pagina del programma, caricare o copiare/incollare l'elenco se i mRNA di destinazione per ogni miRNA o interesse nelle rispettive finestre. Assegnare un nome a ogni elenco con un identificatore univoco.
      2. Fare clic su Invia. Il programma fornirà un output visivo di un diagramma di Venn con un numero di geni in ogni settore, nonché un elenco completo di mRNA per ogni subset e combinazioni di intersezioni.

2. Assemblaggio di moduli miRNA in un cluster transgenico policistronico

1. Preparazione dello scaffold transgenico a base di locus a grappolo miR-17-92
   1. Ottenere la sequenza nucleotidica dell'ammasso miR-17-92 dal browser genoma Ensembl²¹. Selezionare la sequenza "core" della coppia di basi da 800 dollari che comprende tutte e sei forcine miRNA codificate del locus e almeno 200-nucleotide flanking sequenze sia a monte (5') che a valle (3') della sequenza di core.
   2. Incollare la sequenza precedente in qualsiasi programma di modifica delle parole.
   3. Definire la sequenza di ciascuna delle sei forcine native recuperandole in miRBase²². Contrassegnare ciascuna di queste sequenze nell'intervallo della sequenza "core" identificata in precedenza. Tutte le sequenze tra ogni tornante rappresentano sequenze distanziali, che sono importanti per la corretta elaborazione del transgene.
   4. Rimuovere le sequenze di tornanti nativi dalla sequenza "core", con l'eccezione di 3-5 nucleotidi a entrambe le estremità 5' e 3' di ogni forcina, che servirà come accettatore per le nuove forcine.
2. Costruire un nuovo transgene che codifica più miRNA di scelta
   1. Ottenere sequenze fornacchia di miRNA destinati ad essere sovraespressi nel transgene da miRBase. Notare attentamente i nucleotidi specifici che sono i siti di scissione microprocessore.
   2. Sostituire le forcine rimosse (passaggio 2.1.4) con le sequenze di tornanti dei miRNA desiderati ottenute nel passaggio 2.2.1.
   3. Aggiungere le sequenze di restrizione desiderate in entrambe le regioni di fianco del transgene per facilitare la subclonazione nei vettori di consegna di scelta. Verificare che le sequenze di restrizione scelte non siano presenti all'interno della sequenza stessa.
   4. Per i controlli negativi, utilizzare sequenze criptato a 20 nucleotidi per sostituire la sequenza naturale di 20 nucleotidi di ogni miRNA maturo. Generare queste sequenze criptate utilizzando uno strumento online come https://genscript.com/tool/create-scrambled-sequence.
3. Verifica della struttura bidimensionale del transgene
   1. Copiare la sequenza transgenica completa nel programma software di previsione della struttura dell'RNA RNAweb Fold²³.
   2. Utilizzando le impostazioni standard del programma, fare clic su Procedi.
   3. Analizzare l'output grafico, in particolare per la presenza di forcine ben definite e la presenza di strutture staminali a doppio filamento almeno 11 nucleotidi proximali al sito di scissione microprocessore. Inoltre, cercare l'assenza di punti di diramazione all'interno delle sequenze di tornanti (Figura 4).

3. Ottenere i Transgeni mediante sintesi del DNA

1. Dopo la progettazione e la convalida in silico dell'ammasso di miRNA chimerico, ottenere la sequenza di lavoro utilizzando la sintesi del DNA da fornitori commerciali²⁴ e procedere con la clonazione a valle in vettori e consegna transgenica. Abbiamo usato vettori lentivirali per la consegna in vitro¹⁰ e virus adeno-associati (AAV) per la consegna invivo intracranica²⁵.

Risultati

Questo metodo ha permesso la caratterizzazione di un modulo di tre miRNA che sono costantemente downregolati nei tumori cerebrali, che sono co-espressi specificamente durante la differenziazione neuronale (Figura 1) e coinvolti nella risposta di sopravvivenza del tumore dopo terapia (Figura 2). Ciò si ottiene regolando un complesso percorso repressivo della cromatina oncogenica. Questo modello di co-espressione ha suggerito una f...

Discussione

Questo protocollo si basa sulla nozione che, invece di funzionare in isolamento, i miRNA sono biologicamente rilevanti lavorando in gruppi, e questi gruppi sono stabiliti trascrizionalmente da contesti cellulari specifici²⁶. Per giustificare questo approccio da una prospettiva traslazionale, viene introdotto un protocollo di follow-up che consente la ricreazione di questo modello multi-miRNA nelle cellule/tessuti. Ciò è possibile sfruttando la biogenesi relativamente semplice dei miRNA, per cui il...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,4% agarosio a bassa temperatura di fusione	IBI Scientific	IB70058
0,45 µ Unità filtrante sterile M	Merck Millipore	SLH033RS
Provetta per microcentrifuga da 1,5 mL	Eppendorf	22431081
piastre a 6 pozzetti	Greiner Bio-One	657160
Topi atimici (FoxN1 nu/nu)	Envigo	069(nu)/070(nu/+)
B-27 Supplemento	Thermo Fisher Scientific	12587010
Pallone per colture cellulari	Greiner Bio-One	660175
Raschietto cellulare, 16cm	Sarstedt	83.1832
Cesio 137 irradiatore	JL Sheperd and Associates	Core Facility (Harvard Medical School)
Cloroformio	Sigma-Aldrich	439142-4L
DMEM, alto glucosio, piruvato	Thermo Fisher Scientific	11995040
Dulbecco' soluzione salina tamponata con fosfati	Soluzione Gibco	14190144
Eosin Y	Sigma-Aldrich	E4009
Siero fetale bovino	Soluzione di formalina Sigma-Aldrich	F9665
	Sigma-Aldrich	HT501128
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEK-293	Collezione di colture di tipo americano	ATCC CRL-1573
Soluzione di ematossilina	Sigma-Aldrich	1051750500
Cellule staminali primarie di glioma umano (GBM62)			Fornito dal Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women' s Hospital, Boston, MA)
Cellule staminali primarie umane di glioma (MGG4)			Fornito dal Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA)
Vettore lentivirale pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP	System Biosciences	CD511B-1
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
Microcentrifuga refrigerata	Eppendorf	modello n. 5424 R, n. cat. 5404000138
Mezzo di montaggio	Thermo Fisher Scientific	4112APG
Nalgene Provette per centrifuga a fondo tondo in policarbonato ad alta velocità	Thermo Fisher Scientific	3117-0380PK
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	2000c
Cellule progenitrici neurali (NPC)			Fornito dal Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women' s Hospital, Boston, MA)
Terreno neurobasale	Thermo Fisher Scientific	21103049
Nikon eclipse Ti sistema di microscopio a fluorescenza motorizzato	Nikon, Giappone	14314
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific 31985088
provette per PCR	Sigma-Aldrich	CLS6571-960EA
Penicillina-Streptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140122
Piastre di Petri 94/16	Greiner Bio-One	632180
Poli-D-Lisina	Sigma-Aldrich	P4707
EGF umano ricombinante	PeproTech	AF-100-15
FGF umano ricombinante-basic	PeproTech	AF-100-18B
Acido retinoico	Gibco	12587-010
Kit di miniprep RNA	Direct-zol	R2050
S1000 Termociclatore	Bio-RAD	1852196
Micro Irradiatore Guidato da Immagini per Piccoli Animali	Xstrahal Life Sciences, Regno Unito	Stabilimento principale (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA)
Sorvall WX+ Ultracentrifuge	Thermo Fisher Scientific
StemPro Accutase	Thermo Fisher Scientific	A1110501
StepOne Sistema di PCR in tempo reale	Biosistemi applicati
Cabina di biosicurezza SterilGARD	The Baker Company	SG403A-HE
		S9378
T98-G	Cultura di tipo americano Collecti	ATCC CRL-1690
TaqMan MicroRNA Kit di trascrizione inversa	Thermo Fisher Scientific	4366596
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4324018
Temozolomide	Tocris Bioscience	2706
Tissue-Tek temperatura di taglio ottimale	Fisher Scientific	NC9636948
Reagente TRIzol	Thermo Fisher Scientific	15596026	Reagente per lisi
U251-MG	Coltura di tipo americano Collecti	ATCC HTB-17
U87-MG	ViraPower Collecti	ATCC HTB-14
ViraPower	Thermo Fisher Scientific	K4970-00
Acqua, grado HPLC	Fisher	W54
Xilene	Sigma-Aldrich	534056