L'integrità della barriera emato-encefalica è fondamentale per la funzione del sistema nervoso. Nella Drosophila melanogaster, la barriera emato-encefalica è formata da cellule gliali durante l'embriogenesi tardiva. Questo protocollo descrive i metodi per la formazione e la manutenzione delle barriere emato-encefalice negli embrioni di D. melanogaster e delle larve instar terze.
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Articolo metodologico
Analisi per l'integrità della barriera del cervello edelico nella Drosophila melanogaster
In questo articolo
Sommario
Abstract
Un corretto sviluppo del sistema nervoso include la formazione della barriera emato-encefalica, la barriera di diffusione che regola strettamente l'accesso al sistema nervoso e protegge il tessuto neurale dalle tossine e dagli agenti patogeni. I difetti nella formazione di questa barriera sono stati correlati con le neuropatie, e la ripartizione di questa barriera è stata osservata in molte malattie neurodegenerative. Pertanto, è fondamentale identificare i geni che regolano la formazione e il mantenimento della barriera emato-encefalica per identificare potenziali bersagli terapeutici. Per comprendere i ruoli esatti che questi geni svolgono nello sviluppo neurale, è necessario testare gli effetti dell'espressione genica alterata sull'integrità della barriera emato-encefalica. Molte delle molecole che funzionano nella creazione della barriera emato-encefalica sono state trovate per essere conservate attraverso le specie eucariotiche, tra cui la mosca della frutta, Drosophila melanogaster. I moscerini della frutta hanno dimostrato di essere un ottimo sistema modello per esaminare i meccanismi molecolari che regolano lo sviluppo e la funzione del sistema nervoso. Questo protocollo descrive una procedura passo-passo per testare l'integrità della barriera emato-encefalica durante le fasi embrionali e larve dello sviluppo di D. melanogaster.
Introduzione
Durante lo sviluppo, la comunicazione cellulare-cellula e le interazioni sono fondamentali per la creazione della struttura e della funzione dei tessuti e degli organi. In alcuni casi, queste interazioni cellula-cellula sigillano gli organi dall'ambiente circostante per garantire la corretta funzione dell'organo. Questo è il caso del sistema nervoso, che è isolato dalla barriera emato-encefalica (BBB). La disfunzione della BBB nell'uomo è stata collegata a disturbi neurologici tra cui l'epilessia, e la rottura della barriera è stata osservata nelle malattie neurodegenerative tra cui la sclerosi multipla e la sclerosi laterale amiotrofica1. Nei ....
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Protocollo
1. Raccolta di campioni
- Raccolta di embrioni
- In ogni gabbia di raccolta embrionale, usa un minimo di 50 femmine vergini con 20-25 maschi per le collezioni. Incubare queste mosche in una bottiglia con cibo di farina di mais-agar (Tabella dei Materiali) per 1/2 giorni prima di iniziare le collezioni23.
NOT: È possibile utilizzare più mosche, ma il rapporto femminile-maschio deve essere mantenuto a 2:1. - Piatti preriscaldati di succo di mela (Tabella 1) a 25 gradi durante la notte.
NOT: Ciò è necessario per una corretta me....
- In ogni gabbia di raccolta embrionale, usa un minimo di 50 femmine vergini con 20-25 maschi per le collezioni. Incubare queste mosche in una bottiglia con cibo di farina di mais-agar (Tabella dei Materiali) per 1/2 giorni prima di iniziare le collezioni23.
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Risultati
I metodi qui descritti consentono la visualizzazione dell'integrità della BBB in tutto il CNS in embrioni e larve di D. melanogaster (Figura 1). Al termine della formazione di BBB nella tarda embriogenesi, il BBB funziona per escludere grandi molecole dal cervello e VNC5. Questo protocollo sfrutta questa funzione per affermare la formazione di BBB. Quando furono iniettati embrioni di tipo selvaggio (Oregon R) in fase avanzata 17 (20-21 h- ) con 10 kDa dextran.......
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Discussione
Questo protocollo fornisce una descrizione completa dei passi necessari per testare l'integrità di BBB durante gli stadi larvali tardoembrionici e terzi instar dello sviluppo di D. melanogaster. Approcci simili sono stati descritti altrove per testare l'integrità della BBB durante lo sviluppo, così come nelle fasi adulte5,7,29,30. Tuttavia, le descrizioni delle procedure nelle sezioni .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano il Dr. F. Bryan Pickett e il Dr. Rodney Dale per l'uso di attrezzature per l'iniezione. Questo lavoro è stato finanziato da finanziamenti per la ricerca della Loyola University di Chicago a M.D., D.T., e J.J.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 10 kDa sulforhodamine 101 cloruro acido (Texas Red) destrano | ThermoFisher Scientific | D1863 | Il destrano deve essere diluito in ddH2O autoclavato a una concentrazione di 25 mg/mL. |
| 20 μ L Puntali per pipette con caricamento di gel | Eppendorf | 22351656 | |
| 100% etanolo (200 proof) | Pharmco-Aaper | 11000200 | |
| Lievito secco attivo | Star | ||
| Agar | Fisher Scientific | BP1423 | |
| Agarosio | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Compressore d'aria | DeWalt | D55140 | |
| Succo di mela | Candeggina naturale di succo di mela | ||
| Candeggina | per uso domestico | 1-5% | |
| Capillari in vetro borosilicato | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Tappi per bottiglie Fisher | Scientific | AS-277 | |
| Filtri cellulari | BD Falcon | 352350 | |
| Microscopio confocale | Olympus | FV1000 | Campioni ripresi utilizzando l'obiettivo 20x (UPlanSApo 20x/ 0.75) |
| Applicatore con punta in cotone | Puritan | 19-062614 | |
| Nastro biadesivo 1/2" | Pinzetta Scotch | ||
| Dumont; Modello #5; .05 x .01 mm Punta | Roboz | RS-5015 | |
| Bottiglie per alimenti per mosche | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fiale per alimenti per mosche | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Pedale | Treadlite II | T-91-S | |
| Ruote in gel | Bio-Rad | 1704422 | |
| Vassoio per gel | Bio-Rad | 1704436 | |
| vetro Pipetta | VWR | 14673-010 | |
| Glicerolo | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| semolato | Acquistato al supermercato. | ||
| Halocarbon Oil | Lab Scientific, Inc. | FLY-7000 | |
| Sorgente luminosa | Schott | Ace I | |
| Manipolatore Stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Micromanipolatore | World Precision Instruments | KITE-R | |
| Estrattore per micropipette | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Porta ago World | Precision Instruments | MPH310 | |
| Set di filtri Nightsea Microscopia | elettronica Scienza | SFA-LFS-CY | Per la visualizzazione del sistema di adattatori completo YFP |
| Nightsea con testa di luce di colore blu reale | Microscopia elettronica | Scienza SFA-RB | Per la visualizzazione del |
| pennello | Simply Simmons | Chisel Blender #6 | |
| Pipettatore | Fisher Scientific | 13-683C | |
| Pompa pneumatica | World Precision Instruments | PV830 | Questo è anche indicato come microiniettore o regolatore di pressione. Poiché il modello utilizzato nel nostro studio non è più disponibile, questa è un'alternativa. |
| Cloruro di potassio | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Fosfato di potassio bibasico | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Gabbie per la raccolta di piccoli embrioni | Genesee Scientific | 59-100 | |
| Cloruro di sodio | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Fosfato di sodio bibasico anidro | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Piastra di base in acciaio | World Precision Instruments | 5052 | |
| Stereomicroscopio | Carl Zeiss | Stemi 2000 | Utilizzato per la dissezione dei tessuti. |
| Stereomicroscopio con sorgente di luce trasmessa | Baytronix | Utilizzato per iniezioni. | |
| Tegosept (acido p-idrossibenzoico, estere metilico) | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | Tensioattivo non ionico |
| Tappi per fiale Fisher | Scientific | AS-273 |
Riferimenti
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate br....
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Ristampe e permessi
