Le cellule progenitrici dello stelo ematopoietico (HPG) passano da uno stato quiescente a uno stato di differenziazione a causa della loro plasticità metabolica durante la formazione del sangue. Qui, presentiamo un metodo ottimizzato per misurare la respirazione mitocondriale e la glicolisi degli HSPC.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Analisi del metabolismo delle cellule staminali ematopoietiche
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule progenitrici dello stelo ematopoietico (HPG) hanno una plasticità metabolica distinta, che permette loro di passare dal loro stato quiescente a uno stato di differenziazione per sostenere le richieste della formazione del sangue. Tuttavia, è stato difficile analizzare lo stato metabolico (respirazione mitocondriale e glicolisi) degli HSPC a causa del loro numero limitato e della mancanza di protocolli ottimizzati per HSPC fragili e non aderenti. Qui, forniamo una serie di chiare istruzioni passo-passo per misurare la respirazione metabolica (tasso di consumo di ossigeno; OCR) e glicolisi (tasso di acidificazione extracellulare; ECAR) di HSPC di midollo osseo murino-Lingo Questo protocollo fornisce una maggiore quantità di HSPC LSK dal midollo osseo murino, migliora la vitalità degli HSPC durante l'incubazione, facilita l'analisi del flusso extracellulare di HSPC non aderenti e fornisce protocolli di iniezione ottimizzati (concentrazione e tempo) per i farmaci che prendono di mira il fosforolazione ossidativa e le vie glicolytiche. Questo metodo consente la previsione dello stato metabolico e della salute degli HPC durante lo sviluppo del sangue e le malattie.
Introduzione
Poiché la durata della vita della maggior parte delle cellule del sangue mature è breve, l'omeostasi del sangue si basa sull'auto-rinnovamento e la differenziazione di una popolazione longeva ma rara di cellule staminali ematopoietiche (HSPN)1. Gli HSPC sono quiescenti, ma sono pronti a proliferare e a subire differenziazione sulla stimolazione per sostenere le esigenze del sistema sanguigno. Poiché ogni stato cellulare HSPC richiede una domanda bioenergetica unica, i cambiamenti metabolici sono i fattori chiave delle decisioni del destino HSPC. Pertanto, la perdita di plasticità metabolica, alterando l'equilibrio tra quiescenza, auto-rinnovame....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Questo protocollo è stato approvato dal Comitato nazionale per la cura e l'uso degli animali dell'ospedale pediatrico (IACUC).
NOT: Il protocollo è descritto in ordine cronologico che si estende per il periodo di due giorni. Utilizzare nuovi reagenti come descritto nel protocollo riportato di seguito.
1. Preparazione del reagenti il giorno precedente al test
-
Idratare la cartuccia del sensore.
- Incubare 5 mL del calibro (Tabella dei Materiali) in un incubatore non-CO2 37 gradi centigradi durante la notte.
- Aprire il....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Il nostro metodo di estrazione ci ha permesso di raccogliere fino a 80.000 HSPC LSK per mouse. La vitalità e il numero di cellule LSK sono stati migliorati con il nostro metodo, perché noi: (1) combinato midollo osseo da arti superiori e inferiori, ossa dell'anca, sterno, gabbia toracica, e la colonna vertebrale, (2) evitato utilizzando buffer di lisi a cellule rosse che avrebbe aumentato la morte delle cellule e l'agglomeramento, (3) utilizzato il gradiente di densità media separazione delle cellule mono-nucleate, e (4).......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Qui, dimostriamo l'isolamento di una quantità massima di popolazione di HSPC murini murini puro e vitale, nonché la misurazione della loro glicolisi e della respirazione mitocondriale con un analizzatore di flusso extracellulare. In particolare, il protocollo supera i seguenti problemi tecnici per l'uso di HSPC LSK : i) la bassa frequenza degli HSPC LSK nel midollo osseo murino14, ii) bassa attività metabolica basale di LSK HSPCs26, iii) la fragilità di LSK HSPCs
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è in parte supportato dal sostegno finanziatorio dei National Institutes of Health (HL131645, CA016058), dalla Fondazione St. Baldrick e dalla Pelotonia Foundation.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione di poli-L-lisina 0,01% (p/v) | Sigma | P8920 | Utilizzato per l'attacco LSK |
| 40 & micro; filtro cellulare | m Fisher Scientific | 22-363-547 | Utilizzato per la filtrazione cellulare dopo la frantumazione ossea |
| Microsfere anti-biotina | Miltenyi | 130-090-485 | Utilizzato per la separazione |
| della lintina Biotina di ratto Anti-topo CD45R/B220 Clone RA3-6B2 | BD Biosciences | 553086 | Utilizzato per la separazione |
| della lintina Biotina di ratto Anti-topo CD5 Clone 53-7.3 | BD Biosciences | 553019 Utilizzato per la lin- separazione | |
| Biotina ratto Anti-topo CD8a clone 53-6.7 | BD Biosciences | 553029 | utilizzato per la separazione |
| della lintina Biotina ratto anti-topo Ly-6G e Ly-6C clone RB6-8C5 | BD Biosciences | 553125 | utilizzato per la separazione |
| lintina Biotina ratto Anti-topo TER-119/cellule eritroidi clone TER-119 | BD Biosciences | 553672 | utilizzato per la separazione della lina |
| CD117 (c-kit) anticorpo monoclonale (2B8), APC | eBioscience | 17-1171-83 | Utilizzato per lo smistamento LSK |
| Provette da centrifuga coniche Falcon 15 mL | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-53A | Utilizzato nell'isolamento cellulare |
| Provette da centrifuga coniche Falcon 50 mL | Falcon-Fischer Scientific | 14-432-22 | Utilizzato nell'isolamento cellulare |
| Provette in polipropilene a fondo tondo Falcon | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-11A | Utilizzato per Selezione LSK |
| Siero fetale bovino | Neuromics | FBS001-HI | Utilizzato nel tampone FACS |
| Histopaque-1083 | Sigma | 10831 | Utilizzato per la separazione a gradiente di ficoll |
| L-glutammina 100x | Fisher Scientific | 25-030-081 | Utilizzato per il terreno di saggio |
| Colonna LS | Miltenyi | 130-042-401 | Utilizzato per la separazione Lin- |
| Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonale Anticorpo (D7), PE-Cianina7 | eBioscience | 25-5981-82 | Utilizzato per la selezione LSK |
| Fattore di cellule staminali murine (SCF) | PeproTech | 250-03-100UG | Utilizzato per il terreno di prova |
| Trombopoietina murina (TPO) | PeproTech | 315-14-100UG | Utilizzato per il terreno di prova |
| PBS 1% | Fisher Scientific | SH3002802 | Utilizzato per il tampone FACS |
| Penicillina-Streptomicina ( 10.000 U/mL) | Fisher Scientific | 15140122 | Utilizzato per il terreno di saggio |
| Ioduro di propidio | Fisher Scientific | P1304MP | Utilizzato per la selezione LSK |
| Cavalluccio marino XFp Coltura cellulare Minipiastra | Agilent Technologies | 103025-100 | Utilizzato per la semina LSK |
| Piruvato di sodio (100 mM) | ThermoFisher | 11360070 | Utilizzato per il terreno di analisi |
| Streptavidina eFluor 450 Coniugato | eBioscience | 48-4317-82 | Utilizzato per lo smistamento LSK |
| XF Calibrant | Agilent Technologies | 100840-000 | Utilizzato per l'equilibratura della cartuccia |
| XF Terreni | Agilent Technologies | 103575-100 | Utilizzato per il terreno di saggio |
| Kit per test da sforzo per la glicolisi XFp | Agilent Technologies | 103017100 | Farmaci per il test da sforzo della glicolisi |
| XFp Mitocondriale Kit per test da sforzo | Agilent Technologies | 103010100 | Farmaci per test da sforzo mitocondriale |
| Cartuccia sensore XFp | Agilent Technologies | 103022-100 | Utilizzato per test da sforzo glicolitico e mitocondriale |
Riferimenti
- Dharampuriya, P. R., et al. Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).
- Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. The hematopoietic stem cell diet. Internationa....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
Tag
