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Articolo metodologico

Analisi del metabolismo delle cellule staminali ematopoietiche

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DOI:

10.3791/60234

⸱

9 novembre 2019

 ,  ,  ,  , 
1Nationwide Children's Hospital, 2The Ohio State University College of Medicine, 3The Ohio State University Comprehensive Cancer Center

In questo articolo

Sommario

Le cellule progenitrici dello stelo ematopoietico (HPG) passano da uno stato quiescente a uno stato di differenziazione a causa della loro plasticità metabolica durante la formazione del sangue. Qui, presentiamo un metodo ottimizzato per misurare la respirazione mitocondriale e la glicolisi degli HSPC.

Abstract

Le cellule progenitrici dello stelo ematopoietico (HPG) hanno una plasticità metabolica distinta, che permette loro di passare dal loro stato quiescente a uno stato di differenziazione per sostenere le richieste della formazione del sangue. Tuttavia, è stato difficile analizzare lo stato metabolico (respirazione mitocondriale e glicolisi) degli HSPC a causa del loro numero limitato e della mancanza di protocolli ottimizzati per HSPC fragili e non aderenti. Qui, forniamo una serie di chiare istruzioni passo-passo per misurare la respirazione metabolica (tasso di consumo di ossigeno; OCR) e glicolisi (tasso di acidificazione extracellulare; ECAR) di HSPC di midollo osseo murino-Lingo Questo protocollo fornisce una maggiore quantità di HSPC LSK dal midollo osseo murino, migliora la vitalità degli HSPC durante l'incubazione, facilita l'analisi del flusso extracellulare di HSPC non aderenti e fornisce protocolli di iniezione ottimizzati (concentrazione e tempo) per i farmaci che prendono di mira il fosforolazione ossidativa e le vie glicolytiche. Questo metodo consente la previsione dello stato metabolico e della salute degli HPC durante lo sviluppo del sangue e le malattie.

Introduzione

Poiché la durata della vita della maggior parte delle cellule del sangue mature è breve, l'omeostasi del sangue si basa sull'auto-rinnovamento e la differenziazione di una popolazione longeva ma rara di cellule staminali ematopoietiche (HSPN)1. Gli HSPC sono quiescenti, ma sono pronti a proliferare e a subire differenziazione sulla stimolazione per sostenere le esigenze del sistema sanguigno. Poiché ogni stato cellulare HSPC richiede una domanda bioenergetica unica, i cambiamenti metabolici sono i fattori chiave delle decisioni del destino HSPC. Pertanto, la perdita di plasticità metabolica, alterando l'equilibrio tra quiescenza, auto-rinnovamento e differenziazione degli HPG, porta spesso a disturbi mielo- o linfo-proliferativi. Insieme, la comprensione della regolazione metabolica dello sviluppo HSPC è fondamentale per scoprire i meccanismi alla base delle neoplasie ematologiche2,3,4,5.

La respirazione mitocondriale e la glicolisi generano ATP per guidare reazioni intracellulari e produrre gli elementi costitutivi necessari per la sintesi delle macromolecole. Poiché gli HSPC hanno una bassa massa mitocondriale rispetto alle cellule differenziate6 e sostengono la quiescenza nelle nicchie ipossiche del midollo osseo, gli HSPC si basano principalmente sulla glicolisi. L'attivazione di HSPC migliora il loro metabolismo mitocondriale che porta alla perdita di quiescenza e la loro successiva immissione nel ciclo cellulare. Tale plasticità metabolica degli HSPN consente la manutenzione del pool HSPC per tutta la vita adulta6,7,8,9,10,11,12. Pertanto, è fondamentale studiare le loro attività metaboliche, come il tasso di consumo di ossigeno (OCR; indice di fosforo ossidativo) e il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR; indice della glicolisi) per analizzare l'attivazione di HSPC e lo stato di salute. Sia l'OCR che l'ECAR possono essere misurati simultaneamente, in tempo reale, utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare. Tuttavia, il metodo corrente richiede un numero elevato di celle ed è ottimizzato per le celle aderenti13. Poiché gli HSPC non possono essere isolati in grandi quantità dai topi14, richiedono lo smistamento per ottenere una popolazione pura, sono cellule non aderenti15e non possono essere coltivate durante la notte senza evitare la differenziazione16, è stato difficile misurare l'OCR e l'ECAR degli HSPC. Qui, forniamo una serie di chiare istruzioni passo-passo per accompagnare video-based tutorial su come misurare la respirazione metabolica e la glicolisi di poche migliaia di murine osso midollo-LineagenegSca1-c-Kit(LSK) HSPC.

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Protocollo

Questo protocollo è stato approvato dal Comitato nazionale per la cura e l'uso degli animali dell'ospedale pediatrico (IACUC).

NOT: Il protocollo è descritto in ordine cronologico che si estende per il periodo di due giorni. Utilizzare nuovi reagenti come descritto nel protocollo riportato di seguito.

1. Preparazione del reagenti il giorno precedente al test

  1. Idratare la cartuccia del sensore.
    1. Incubare 5 mL del calibro (Tabella dei Materiali) in un incubatore non-CO2 37 gradi centigradi durante la notte.
    2. Aprire il kit di analisi del flusso (Tabella dei materiali) e separare la cartuccia del sensore (verde; superiore) dalla piastra di utilità (trasparente; inferiore). Posizionare quindi la cartuccia del sensore capovolta e adiacente alla piastra di utilità.
    3. Utilizzando acqua sterile, riempire i pozzetto della piastra di utilità (200 ) e le camere intorno ai pozzi (400 .
    4. Immergere la cartuccia del sensore nella piastra di utilità assicurandosi che i sensori siano completamente coperti dall'acqua. Toccare 3x per evitare la formazione di bolle.
    5. Collocare la cartuccia sommersa nella piastra di utilità in un'incubatrice non-CO2 37 gradi centigradi durante la notte. Per evitare l'evaporazione dell'acqua, assicurarsi che l'incubatrice sia adeguatamente umidificata. Posizionare un becher aperto contenente H2O come ulteriore precauzione accanto alla piastra cartuccia-utility, in particolare se si utilizza un forno normale.
  2. Preparare il piatto di assaggio.
    1. Sterilizzare la superficie della biosicurezza cabinet classe 2 utilizzando 70% etanolo. Aprire la piastra di qualità sotto il cofano.
    2. Aggiungete 40 l di soluzione poli-L-ll(PLL) disponibile in commercio a ciascun bene della piastra di s'anguilla sotto il cofano.
    3. Coprire la piastra di prova con il coperchio fornito nel kit. Incubare la piastra di aspetto chiusa a temperatura ambiente (RT) sotto il cofano per 1 h.
      NOT: L'obiettivo dell'incubazione è quello di lasciare PLL rivestire la superficie della piastra di saggio per facilitare l'adesione delle celle di sospensione alla superficie della piastra di saggio.
    4. Dopo 1 h incubazione della piastra di gusto, rimuovere la soluzione in eccesso con un aspiratore sterile a basso vuoto e asciugare l'aria del pozzo sotto il cofano.
      NOT: Ci vogliono 30-60 dollari per asciugare ad aria i pozzetti della piastra di manto a seguito dell'eccessiva rimozione del PLL con l'aspiratore.

2. Giorno del Saggio

  1. Preparare la cartuccia.
    1. Sollevare la cartuccia del sensore. Metterlo a testa in giù nella cappa di coltura dei tessuti e scartare l'acqua dalla piastra di utilità.
    2. Riempire i pozze di servizio con 200 gradi del calibro preriscaldato.
    3. Riempire le camere intorno ai pozzi con 400 l del calibratore.
    4. Sommergi la cartuccia del sensore nella piastra di utilità, assicurandoti che i sensori siano completamente coperti dal calibratore. Toccare 3x per evitare la formazione di bolle.
    5. Equilibrate la cartuccia del sensore immersa nella piastra di utilità in un'incubatrice non-CO2 37 gradi centigradi per 45-60 min.
  2. Raccogliere hSPC LSK derivati da murine.
    1. Per accogliere un numero sufficiente di repliche biologiche, si prevede di utilizzare Gli HSPC derivati da un topo per pozzo della piastra di analisi.
      NOT: Questo metodo di raccolta del midollo osseo fornisce 50.000-80.000 LSK HSPC da ogni topo. Questo protocollo per misurare il flusso extracellulare è ottimizzato per HSPC LSK da 70.000 dollari per pozzo di 96 pozzi.
    2. Topi eutanasi che utilizzano sovradosaggio di CO2 e lussazione cervicale, seguendo metodi locali approvati da IACUC.
    3. Sterilizzare la superficie degli utensili di dissezione e la panca utilizzando il 70% di etanolo.
    4. Per ogni topo, precompilare una parabola Petri con 1x salina tamponata da fosfato (PBS) contenente il 2% di siero bovino fetale inattivato dal 2% (FBS) a RT.
      NOT: Non utilizzare PBS preraffreddamento in quanto creerà grumi nei passaggi seguenti.
    5. Spruzzare 70% di etanolo (v/v) sull'intero topo eutanasia. Isolare tutte le ossa, compresi gli arti superiori e inferiori, le ossa dell'anca, lo sterno, la gabbia toracica e la colonna vertebrale, dal topo17,18. Estrarre la materia bianca dal midollo spinale del mouse in quanto può contaminare le cellule LSK. Collocare tutte le ossa in 1x PBS (2% FBS), mentre vengono raccolte, in un piatto Petri fino a nuovo utilizzo.
    6. Invertire un tubo conico da 50 ml (nuovo ogni volta) e utilizzarlo per triturare le ossa sommerse in 1x PBS (-2% FBS) nel piatto Petri.
    7. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, pipetta su e giù (10x) per lavare uniformemente le cellule dalle ossa, dopo aver schiacciato le ossa.
    8. Posizionare un colino a 40 m su un tubo conico da 50 ml. Pre-bagnato della superficie del colino passando 1 mL di 1x PBS (2% FBS).
    9. Raccogliere la sospensione cellulare derivata dal midollo osseo dal punto 2.2.7 e passarla attraverso la superficie pre-bagnata del colino cellulare per rimuovere i detriti ossei.
    10. Ripetere i passaggi da 2.2.6 a 2.2.9 fino a quando tutti i materiali ossei diventano bianchi come marcatore che la maggior parte delle cellule del midollo osseo sono raccolte nel tubo conico da 50 mL.
      NOT: Spesso ci vogliono due tubi conici da 50 mL per mouse per raccogliere tutte le cellule derivate dal midollo osseo.
    11. Centrifuga 50 mL tubi conici contenenti cellule derivate dal midollo osseo per 5 min a 500 x g e RT.
    12. Togliete il super-acletterante. Risospendere le cellule derivate dal midollo osseo (combinare il contenuto di entrambi i tubi da 50 mL) in 5 mL di 1x PBS (-2% FBS) come volume finale e mantenere le cellule a RT.
  3. Raccogliere cellule di midollo osseo murinee mononucleated.
    1. Aggiungere 5 mL di gradiente medio di densità (cioè Ficoll) a un tubo conico da 15 mL. Quindi aggiungere lentamente 5 mL della sospensione della cellula del midollo osseo. Assicuratevi che le celle rimangano come un livello al di sopra del mezzo di sfumatura di densità.
    2. Centrifuga per 30 min a 500 x g e RT. Non usare un freno nella centrifuga. Assicurarsi che la centrifuga sia alla più bassa accelerazione possibile (ad esempio, 1 accelerazione e 0 decelerazione).
    3. Raccogliere l'interfaccia centrale delle cellule mononilleate (colore bianco) dopo la centrifugazione in un tubo conico fresco da 15 mL.
    4. Lavare le cellule, raccolte da un mezzo di pendenza di densità, con 5 mL di 1x PBS (-2% FBS). Centrifuga per 5 min a 500 x g e 4 gradi centigradi. Togliete il super-acletterante.
    5. Ripetere il passaggio 2.3.4.
    6. Risospendere il contenuto della cella del tubo in 300 -L di 1x PBS (-2% FBS). Aliquota 10 di sospensione cellulare per il controllo incontaminato o monocolore in un tubo FACS.
  4. Raccogliere LSK HSPC da cellule mononucleate del midollo osseo murineo.
    1. Preparare un cocktail di biotina-anticorpi mescolando 3 -L per campione dei seguenti anticorpi: Gr1, Cd8a, Cd5, B220, Ter119. Aggiungere 15 l del cocktail biotina-anticorpo a 300 -L di cellule mononucleate del midollo osseo.
      NOT: Ogni anticorpo viene utilizzato a 1:100 diluizione.
    2. Incubare le cellule con il cocktail biotina-anticorpo per 30 min a 4 gradi centigradi con agitazione per evitare che le cellule si aggrovigliano nella parte inferiore del tubo.
    3. Aggiungere 10 mL di PBS pre-raffreddato (2% FBS) alle cellule mescolate con il cocktail biotina-anticorpo.
    4. Centrifugare il tubo per 5 min a 500 x g e 4 gradi centigradi. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 400 -L l of 1x PBS (2% FBS). Aliquota 10 L per il controllo del colore singolo streptavidin.
    5. Brevemente vortice anti-biotina microsfere (Tabella dei materiali) prima dell'uso. Aggiungete 80 l di microsfere ad ogni campione di cellule (di 400 gradi centigradi). Mescolare bene e incubare per ulteriori 20 min a 4 gradi centigradi, con agitazione.
    6. Aggiungere 10 mL di PBS 1x pre-raffreddato alle celle. Centrifugare il tubo per 5 min a 500 x g e 4 gradi centigradi.
    7. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di 1x PBS (-2% FBS). Conservare a 4 gradi centigradi durante la configurazione dell'unità di separazione magnetica.
    8. Collocare una colonna (Tabella dei materiali) nel campo magnetico del separatore di ordinamento delle celle magnetiche assistite (MACS) a 4 gradi centigradi. Preparare la colonna per la separazione magnetica risciacquandola con 3 mL di 1x PBS (-2% FBS) sotto il flusso di gravità a 4 gradi centigradi.
    9. Aggiungere la sospensione della cella dal punto 2.4.7 alla colonna pre-bagnata a 4 gradi centigradi. Lasciare che le cellule passino attraverso la colonna a 4 gradi centigradi e raccogliere gli effluenti in un tubo conico da 15 mL.
      NOT: La frazione con celle senza etichetta in tali effluenti rappresenta le cellule negative di lignaggio arricchite.
    10. Lavare la colonna con 3 mL di 1x PBS (-2% FBS) a 4 gradi centigradi. Ripetere 3x. Raccogliere il flusso attraverso e tenerlo a 4 gradi centigradi. Contare le cellule vitali eluite con l'esclusione blu trypan utilizzando un emocitometro.
    11. Centrifugare il tubo conico da 15 mL contenente il flusso-through per 5 min a 500 x g e 4 gradi centigradi. Scartare il super-attardato. Risospendere le celle in 0,5 mL di 1x PBS (-2% FBS) e trasferire il contenuto in un tubo FACS.
    12. Aggiungere 24 - L del cocktail anticorpo LSK a ogni 107 cellule. Il cocktail anticorpale contiene la stessa concentrazione di anticorpi 450-streptavidin, anticorpo PE-CY7-Sca1, e anticorpo APC-c-Kit.
    13. Incubare per 1 h a 4 gradi centigradi con agitazione sotto scuro (coperto di stagnola).
    14. Aggiungete 3 mL di 1x PBS (-2% FBS) al tubo FACS. Centrifuga per 5 min a 500 x g e 4 gradi centigradi. Scartare il super-attardato.
    15. Risospendere le cellule con etichettatura anticorpo in 1 mL di 1x PBS (-2% FBS). Aggiungere 1 ll di 1 mg/mL di iodio iodio alla sospensione cellulare appena prima dello smistamento.
    16. Filtrare il contenuto del tubo FACS utilizzando un colino da 40 m subito prima di ordinare le celle LSK.
    17. Raccogliere le cellule LSK, tramite lo smistamento FACS, in un tubo da 1,5 mL contenente 0,5 mL di supporto completo integrato con 2 mM di glutammina, 3 mg/mL di glucosio, 1 mM di piravate, 1x trombopoietina (TPO), 1x fattore di cellule staminali (SCF), 0,5x penicillina/streptomycin (P/S), pH 7.4Table).

3. Sospensione mitocondriale e saggi di glicolisi degli HSPC LSK

  1. Semina LSK nella piastra di saggio
    1. Centrifuga cellule LSK da passo 2.4.17 per 5 min a 500 x g e RT. Scartare il sovratalmente.
    2. Risospendere le cellule in supporti completi ad una concentrazione finale di almeno 70.000 cellule/40 .
    3. Contenuto di semi di 40 -L (contenente 70.000 celle) nella lastra di 8 pozze di PLL dal punto 1.2.4. Lasciare vuoti tutti i pozzi d'angolo.
    4. Centrifuga per 1 min a 450 x g e RT. Non applicare il freno. Assicurarsi che le cellule siano attaccate al fondo del pozzo utilizzando il microscopio invertito.
    5. Aggiungete 135 l di supporto completo alle celle in ogni pozzo per un volume finale di 175 gradi.
    6. Incubare le cellule nell'incubatrice nonCO2 per 2 h a 37 .
    7. Impostare un programma per aggiungere farmaci a ogni pozzo della piastra di pozzo nell'analizzatore utilizzando una metrica descritta nella Tabella 2 (test di stress mitocondriale) e nella tabella 3 (test di stress della glicolisi).
      NOTA: Durante l'incubazione delle cellule, accendere lo strumento e assicurarsi che sia a 37 gradi centigradi.
  2. Test di stress mitocondriale
    1. Preparare 45 soluzioni di stock di oligomicina, 50 m di cianuro carbonile 4-(trifluromethoxy)fenylhydrazone (FCCP) e 25 soluzioni di stock m di rotenone/antimicina A. Per preparare una soluzione di 45 oligomicina, sciogliere il contenuto della sacca disponibile in commercio in 280 - L del supporto completo. Per preparare una soluzione di 50 m FCCP, sciogliere il contenuto della sacca disponibile in commercio in 288 - L del supporto completo. Per preparare una soluzione di supporto a 25 M rotenone/antimycin A, sciogliere il contenuto della sacca disponibile in commercio in 216 - L del supporto completo.
    2. Togliere la cartuccia del sensore nella piastra di utilità dall'incubatrice e caricare le sue porte (A, B e C) in modo che ogni pozzo abbia una concentrazione finale di 2 oligomicina M, 1,5 M FCCP e 0,5 M di rotenone/antimicina A come richiesto, seguendo le metriche di diluizione descritte nella tabella 4 (per il tasso di consumo di ossigeno).
    3. Rimuovere il coperchio dalla cartuccia del sensore assemblato nella piastra di utilità e posizionarlo sul vassoio dello strumento. Avviare la calibrazione che richiederà 20 min.
    4. Dopo la calibrazione, rimuovere la piastra di utilità e sostituirla con una piastra di analisi contenente celle LSK, che ora sono aderenti al fondo del pozzo.
    5. Premere Continua per avviare il programma descritto nella tabella 2. Dopo il completamento del programma, recuperare i dati e analizzarli utilizzando il software Wave Desktop.
      NOT: I dati generati dai saggi del flusso extracellulare possono essere tracciati utilizzando il grafico a punti dal software Wave Desktop o esportati in un programma di statistiche basato sul web.
  3. Test di stress della glicolisi
    1. Ricostituire il glucosio in 300 ml (100 mM), oligomycin in 288 L (50 m), glucosio 2D (2-DG) in 300 l (500 mM) di supporti completi dalla sacca disponibile in commercio.
    2. Delicatamente pipette su e giù (10x) per solubilizzare i composti. Vorticare la DG 2 per circa 1 min per garantire una corretta dissoluzione nei supporti.
    3. Togliere la cartuccia del sensore dall'incubatrice. Le porte di carico da A a C in base alle metriche di diluizione descritte nella tabella 5 per ottenere una concentrazione finale di glucosio di 10 mM, 2 oligomicina e 50 mM 2-DG.
    4. Ripetere i passaggi 3.2.3 e 3.2.4.
    5. Premere Continua per avviare il programma descritto nella tabella 3. Dopo il completamento del programma, recuperare i dati e analizzarli utilizzando il software Wave Desktop.

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Risultati

Il nostro metodo di estrazione ci ha permesso di raccogliere fino a 80.000 HSPC LSK per mouse. La vitalità e il numero di cellule LSK sono stati migliorati con il nostro metodo, perché noi: (1) combinato midollo osseo da arti superiori e inferiori, ossa dell'anca, sterno, gabbia toracica, e la colonna vertebrale, (2) evitato utilizzando buffer di lisi a cellule rosse che avrebbe aumentato la morte delle cellule e l'agglomeramento, (3) utilizzato il gradiente di densità media separazione delle cellule mono-nucleate, e (4)...

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Discussione

Qui, dimostriamo l'isolamento di una quantità massima di popolazione di HSPC murini murini puro e vitale, nonché la misurazione della loro glicolisi e della respirazione mitocondriale con un analizzatore di flusso extracellulare. In particolare, il protocollo supera i seguenti problemi tecnici per l'uso di HSPC LSK : i) la bassa frequenza degli HSPC LSK nel midollo osseo murino14, ii) bassa attività metabolica basale di LSK HSPCs26, iii) la fragilità di LSK HSPCs

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è in parte supportato dal sostegno finanziatorio dei National Institutes of Health (HL131645, CA016058), dalla Fondazione St. Baldrick e dalla Pelotonia Foundation.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Soluzione di poli-L-lisina 0,01% (p/v)SigmaP8920Utilizzato per l'attacco LSK
40 & micro; filtro cellularem Fisher Scientific22-363-547Utilizzato per la filtrazione cellulare dopo la frantumazione ossea
Microsfere anti-biotinaMiltenyi130-090-485Utilizzato per la separazione
della lintina Biotina di ratto Anti-topo CD45R/B220 Clone RA3-6B2BD Biosciences553086Utilizzato per la separazione
della lintina Biotina di ratto Anti-topo CD5 Clone 53-7.3BD Biosciences553019 Utilizzato per la lin- separazione
Biotina ratto Anti-topo CD8a clone 53-6.7BD Biosciences553029utilizzato per la separazione
della lintina Biotina ratto anti-topo Ly-6G e Ly-6C clone RB6-8C5BD Biosciences553125utilizzato per la separazione
lintina Biotina ratto Anti-topo TER-119/cellule eritroidi clone TER-119BD Biosciences553672utilizzato per la separazione della lina
CD117 (c-kit) anticorpo monoclonale (2B8), APCeBioscience17-1171-83Utilizzato per lo smistamento LSK
Provette da centrifuga coniche Falcon 15 mLFalcon-Fischer Scientific14-959-53AUtilizzato nell'isolamento cellulare
Provette da centrifuga coniche Falcon 50 mLFalcon-Fischer Scientific14-432-22Utilizzato nell'isolamento cellulare
Provette in polipropilene a fondo tondo FalconFalcon-Fischer Scientific14-959-11AUtilizzato per Selezione LSK
Siero fetale bovinoNeuromicsFBS001-HIUtilizzato nel tampone FACS
Histopaque-1083Sigma10831Utilizzato per la separazione a gradiente di ficoll
L-glutammina 100xFisher Scientific25-030-081Utilizzato per il terreno di saggio
Colonna LSMiltenyi130-042-401Utilizzato per la separazione Lin-
Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonale Anticorpo (D7), PE-Cianina7eBioscience25-5981-82Utilizzato per la selezione LSK
Fattore di cellule staminali murine (SCF)PeproTech250-03-100UGUtilizzato per il terreno di prova
Trombopoietina murina (TPO)PeproTech315-14-100UGUtilizzato per il terreno di prova
PBS 1%Fisher ScientificSH3002802Utilizzato per il tampone FACS
Penicillina-Streptomicina ( 10.000 U/mL)Fisher Scientific15140122Utilizzato per il terreno di saggio
Ioduro di propidioFisher ScientificP1304MPUtilizzato per la selezione LSK
Cavalluccio marino XFp Coltura cellulare MinipiastraAgilent Technologies103025-100Utilizzato per la semina LSK
Piruvato di sodio (100 mM)ThermoFisher11360070Utilizzato per il terreno di analisi
Streptavidina eFluor 450 ConiugatoeBioscience48-4317-82Utilizzato per lo smistamento LSK
XF CalibrantAgilent Technologies100840-000Utilizzato per l'equilibratura della cartuccia
XF TerreniAgilent Technologies103575-100Utilizzato per il terreno di saggio
Kit per test da sforzo per la glicolisi XFpAgilent Technologies103017100Farmaci per il test da sforzo della glicolisi
XFp Mitocondriale Kit per test da sforzoAgilent Technologies103010100Farmaci per test da sforzo mitocondriale
Cartuccia sensore XFpAgilent Technologies103022-100Utilizzato per test da sforzo glicolitico e mitocondriale
della

Riferimenti

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