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Articolo metodologico

Determinazione delle relazioni di auto-compatibilità in Apricot Combinando l'impollinazione manuale, la microscopia e le analisi genetiche

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DOI:

10.3791/60241

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16 giugno 2020

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1Unidad de Hortofruticultura, Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), 2Instituto Agroalimentario de Aragón - IA2 (CITA-Universidad de Zaragoza), 3Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea La Mayora (IHSM La Mayora-UMA-CSIC)

In questo articolo

Sommario

Presentiamo una metodologia per stabilire i requisiti di impollinazione dell'albicocca(Prunus armeniaca L.) che combinano la determinazione dell'auto-in) della microscopia a fluorescenza con l'identificazione del genotipo S mediante l'analisi PCR.

Abstract

L'autoincompatibilità in Rosaceae è determinata da un Gametophytic Self-Incompatibility System (GSI) che è controllato principalmente dal locus multiallelico S. In albicocca, la determinazione delle relazioni di auto-e inter-compatibilità è sempre più importante, poiché il rilascio di un numero importante di nuove cultivar ha portato all'aumento delle cultivar con requisiti di impollinazione sconosciuti. In questo caso, descriviamo una metodologia che combina la determinazione dell'auto-compatibilità mediante impollinazioni manuali e microscopia con l'identificazione del genotipo S mediantel'analisi PCR. Per la determinazione dell'auto-in)compatibilità, i fiori in fase di palloncino da ogni cultivar sono stati raccolti sul campo, impollinati a mano in laboratorio, fissati e macchiati con blu anilina per l'osservazione del comportamento del tubo di polline sotto la microscopia a fluorescenza. Per l'instaurazione di relazioni di incompatibilità tra le cultivar, il DNA di ogni cultivar è stato estratto da foglie giovani e gli alleli Ssono stati identificati dalla PCR. Questo approccio consente di stabilire gruppi di incompatibilità e di chiarire le relazioni di incompatibilità tra le cultivar, che fornisce una preziosa informazione per scegliere i minacciappropriati adatti nella progettazione di nuovi frutteti e per selezionare i genitori appropriati nei programmi di allevamento.

Introduzione

L'autoincompatibilità è una strategia di fioritura delle piante per prevenire l'autoimpollinazione e promuovere l'outcrossing1. In Rosaceae, questo meccanismo è determinato da un Gametophytic Self-Incompatibility System (GSI) che è controllato principalmente dal locus multiallelico S2. Nello stile, il gene RNase codifica il determinante tylar S-s,un RNase3, mentre una proteina F-box, che determina il determinante S-pollen,è codificata dal gene SFB 4. L'interazione di autoincompatibilità avviene attraverso l'inibizione della crescita del tubo di polline lungo lo stile impedendo la fecondazione dell'ovulo5,6.

In albicocca, un rinnovamento varietale ha avuto luogo in tutto il mondo negli ultimi due decenni7,8. Questa introduzione di un numero importante di nuove cultivar, provenienti da diversi programmi di allevamento pubblico e privato, ha portato all'aumento delle cultivar di albicocche con requisiti di impollinazione sconosciuti8.

Diverse metodologie sono state utilizzate per determinare i requisiti di impollinazione nell'albicocca. Nel campo, l'auto-(in)compatibilità può essere stabilita da impollinazioni controllate in alberi in gabbia o in fiori evirati e successivamente registrando la percentuale di set di frutta9,10,11,12. Inoltre, in laboratorio sono state effettuate impollinazioni controllate dalla cultura semi-in vivo dei fiori e dall'analisi del comportamento del tubo di polline sotto microscopia a fluorescenza8,13,14,15,16,17. Recentemente, le tecniche molecolari, come l'analisi pcR e il sequenziamento, hanno permesso la caratterizzazione delle relazioni di incompatibilità basate sullo studio dei geni RNase e SFB 18,19. In albicocca, 33 S-alleli sono stati segnalati (S1 a S20, S22 a S30, S52, S53, Sv, Sx), tra cui un allele correlato con autocompatibilità (S)12,18,20,21,22,23,24. Finora, 26 gruppi di incompatibilità sono stati accoltellati in questa specie secondo la S-genotipo8,9,17,25,26,27. S Le cultivar con gli stessi S-allelisono intercompatibili, mentre le cultivar con almeno un allele Adiverso e, di conseguenza, assegnate in diversi gruppi incompatibili, sono intercompatibili.

Per definire i requisiti di impollinazione delle cultivar di albicocca, descriviamo una metodologia che combina la determinazione dell'auto-in)compatibilità mediante microscopia a fluorescenza con l'identificazione del genotipo S-mediante l'analisi PCR nelle cultivar di albicocca. Questo approccio consente di stabilire gruppi di incompatibilità e chiarire le relazioni di incompatibilità tra le cultivar.

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Protocollo

1. Determinazione dell'auto-in()compatibilità

  1. Assaggia i fiori nel campo. È necessario raccogliere i fiori in fase di palloncino (Figura 1A), corrispondente alla fase 58 sulla scala BBCH per albicocca28, per evitare l'impollinazione precedente indesiderata.
  2. Auto e cross-impollinazioni in laboratorio
    1. Rimuovere le antre dei fiori in fase di palloncino e metterli su un pezzo di carta per asciugare a temperatura di laboratorio.
    2. Dopo 24 h, setacciare i grani di polline utilizzando una maglia fine (0,26 mm) (Figura 1B).
    3. Esalizzare un gruppo di 30 fiori nello stesso stadio palloncino per ogni autoimpollinazione e impollinazione incrociata e posizionare i pisciature sulla schiuma fioraio in acqua a temperatura di laboratorio (Figura 1C).
    4. Impollinare a mano i pistili con l'aiuto di un pennello con polline da fiori della stessa cultivar 24 h dopo emasculazione. Inoltre, impollinare un altro set di pistili di ogni cultivar con polline da fiori di un impollinante compatibile come controllo (Figura 1D).
    5. Dopo 72 h, fissare i pistili in una soluzione fissativa di etanolo/acido acetico (3:1) per almeno 24 h a 4 gradicentigradi. Quindi scartare il fissativo e aggiungere 75% etanolo assicurando che i campioni sono completamente sommersi nella soluzione. I campioni possono essere conservati in questa soluzione a 4 gradi centigradi fino all'usodi 8,17,30,31,32.
  3. Valutare la vitalità del polline attraverso la germinazione del polline in vitro
    1. Per preparare il mezzo di germinazione, peso 25 g di saccarosio, 0,075 g di acido borico (H3BO3) e 0,075 g di nitrato di calcio (Ca(NO3)2)33.
    2. Aggiungere i componenti del mezzo in 250 mL di acqua distillata e sciogliere completamente.
    3. Solidificare il mezzo aggiungendo 2 g di agarose e mescolare vorticoso.
    4. Controllare il pH del mezzo utilizzando un misuratore di pH e regolare il valore su 7.0 con la soluzione NaOH o HCl.
    5. Autoclave la miscela per sterilizzare il mezzo.
    6. Dopo l'autoclaving, raffreddare il mezzo e distribuirlo nei piatti Petri in una sterile cappa di flusso laminare.
    7. Spargere i grani di polline delle stesse cultivar utilizzate per le impollinazioni controllate nel mezzo di germinazione del polline solidificato e osservarli al microscopio dopo 24 h6.
      NOTA: per sterilizzare il cofano a flusso laminare, pulire la superficie con il 70% di etanolo e accendere la lampada UV durante 10 min.
    8. Conservare i piatti Petri in frigorifero a 4 gradi centigradi fino all'uso.
  4. Osservazioni microscopiche
    1. Lavare i pistilli tre volte per 1 h con acqua distillata e lasciarli nel 5% di solfolito di sodio a 4 gradi centigradi. Dopo 24 h, autoclave a 1 kg /cm2 durante 10 min in solphite di sodio per ammorbidire i tessuti34.
    2. Posizionare i pistili autoclave su un vetrino di vetro e, con l'aiuto di un bisturi, rimuovere i tricomi intorno all'ovaio per ottenere una migliore visualizzazione dei tubi di polline. Quindi, schiacciare i pistili con un vetro di copertura.
    3. Preparare lo 0,1% (v/v) una macchia blu anilina: mescolare 0,1 mL di blu anilina in 100 mL di 0,1 N potassi fosfato tribasic (K3PO4). Applicare una goccia di blu anilina sopra i preparati per macchiare le deposizioni di callosi durante la crescita del tubo di polline.
    4. Osservare i tubi di polline lungo lo stile da un microscopio con epifluorescenza UV utilizzando 340-380 passabanda e 425 filtri longpass.

2. Estrazione del DNA

  1. Campione 2-3 foglie nel campo in primavera. Si raccomanda di campionare le foglie in giovani stadi poiché il DNA ottenuto è di qualità superiore e livelli più bassi di composti fenolici rispetto alle foglie vecchie.
  2. Estrarre il DNA genomico seguendo i passaggi descritti in un kit disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali).
  3. Analizzare la quantità e la qualità delle concentrazioni di DNA utilizzando lo spettrofotometro UV-vis (260 nm).

3. IdentificazioneS-allele

  1. Impostazione delle reazioni PCR
    1. Preparare una diluizione di 50 ng/L nell'acqua distillata di ogni campione di estrazione del DNA.
    2. Scongelare lentamente i reagenti PCR e tenerli sul ghiaccio. Lasciare la polimerasi del DNA nel congelatore fino a quando necessario.
    3. Preparare le reazioni di amplificazione utilizzando le diverse combinazioni di primer. Creare il mix di reazione PCR combinando i componenti riportatinella Tabella 1 . Vortex la reazione PCR mescolare bene e distribuire il volume indicato per le diverse combinazioni di primer ad ogni pozzo della piastra PCR. Quindi, aggiungere 1 l della diluizione del DNA in ogni pozzo.
    4. Posizionare la piastra PCR nel termociclore ed eseguire il programma PCR corrispondente illustrato nella Tabella 1.
  2. Analizzare i frammenti amplificati. Ci sono principalmente due modi diversi per analizzare i frammenti amplificati PCR: elettroforesi capillare (CE) con primer fluorescenti etichettati o come esorti di elettroforesi gel agarose con primer non etichettati.
    1. Elettroforesi capillare
      1. Per preparare il buffer di carico, mescolare 35 L di formamide deionizzato con 0,45 l di standard di dimensionamento etichettato. Vorticare il reagente per mescolare bene, e poi erogare 35,5 l nel pozzo della piastra del lettore.
      2. Aggiungere 1 ll l del prodotto PCR nel pozzo. Inoltre, aggiungere una goccia di olio minerale per evitare l'evaporazione dell'acqua.
      3. Preparare la piastra di separazione aggiungendo il buffer di separazione.
      4. Utilizzare il software commerciale incluso nell'analizzatore genetico (vedere Tabella dei materiali). Creare una nuova piastra di esempio e salvare i nomi di esempio per tutti i pozzetto sulla piastra.
      5. Selezionare il metodo di analisi. In questo caso, denaturare i campioni a 90 gradi centigradi per 120 s, iniettare a 2,0 kV per 30 s e separarli a 6,0 kV per 35 min.
      6. Inserire le due piastre nell'analizzatore genetico. Riempire la matrice capillare con acqua distillata.
      7. Caricare il gel brevettato in poliacrilammide lineare (LPA). Infine, fare clic su Esegui.
    2. Gel Elettroforesi
      1. Preparare un 1% gel di agarose aggiungendo 1,5 g di agarose di biologia molecolare in 150 mL di 1x TAE (Tris-acetate-EDTA) buffer di elettroforesi (40 mM, 20 mM di acido acetico e 1 mM EDTA a pH 8.0). Sciogliere l'agarose mediante riscaldamento a microonde per 2-3 min.
      2. Per visualizzare il DNA, aggiungere 4 -L di una macchia acida nucleica (vedi Tabella dei materiali) e mescolare delicatamente.
      3. Aggiungere un pettine di gel, con pozzi sufficienti per scale, controlli e campioni, in un vassoio di gel. Quindi, versare lentamente il mix nel mezzo del vassoio di gel ed evitare le bolle.
      4. Lasciare raffreddare il gel per 30-45 min a temperatura ambiente fino a quando il gel si è completamente solidificato. Introdurre il gel nella camera di elettroforesi, rimuovere il pettine di gel e riempire la camera con abbastanza 1x tampone TAE per coprire il gel.
        NOTA: Controllare il posizionamento del gel. I pozze devono essere posizionati vicino al polo negativo poiché il DNA caricato negativamente migra verso il catodo.
      5. Aggiungere 5 l di buffer di carico (0,1% (v/v) di bromofenolo blu) ai prodotti PCR e mescolare bene.
      6. Per stimare le dimensioni delle bande, caricare 5 - L di DNA scala peso molecolare (vedere Tabella dei materiali).
      7. Caricare i campioni nei pozze aggiuntivi del gel.
      8. Una volta caricati tutti i campioni e la scala di peso molecolare del DNA, eseguire il gel a 90 V per 1-1,5 h, fino a quando la linea di tintura blu è approssimativamente al 75% della lunghezza del gel.
      9. Visualizza le bande in un transilluminatore per gli acidi nucleici.

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Risultati

Gli studi di impollinazione in albicocca richiedono l'uso di fiori nella fase tarda del palloncino un giorno prima dell'analisi (Figura 1A). Questa fase è considerata la più favorevole sia per la raccolta del polline che per la raccolta del pistilo, poiché le strutture floreali sono quasi mature, ma l'inestesia non si è ancora verificata. Questo impedisce l'interferenza di polline indesiderato, non solo di polline dallo stesso fiore, ma anche da altri fiori, poiché i petali ...

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Discussione

Tradizionalmente, la maggior parte delle cultivar europee di albicocche commerciali erano auto-compatibili36. Tuttavia, l'uso di cultivar auto-incompatibili nordamericane come genitori nei programmi di allevamento negli ultimi decenni ha portato al rilascio di un numero crescente di nuove cultivar auto-incompatibili con requisiti di impollinazione sconosciuti7,8,37. Pertanto, la determinazione delle relaz...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata finanziata dal ministro de Ciencia, Innovaciàn y Universidades-European Regional Development Fund, European Union (AGL2016-77267-R e AGL2015-74071-JIN); Instituto Nacional de Investigaciàn y Tecnolog à Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00, RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragàn-European Social Fund, European Union (Grupo Consolidado A12_17R), Fundaciàn Biodiversidad e Agroseguro S.A.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Agarosio D1 Low EEOConda8010.22
BIOTAQ DNA polimerasi kitBiolineBIO-21060
Microscopio a campo chiaroLeica MicrosystemsDM2500
CEQ Software di sistemaBeckman Coulter
DNeasy Plant Mini KitQIAGEN69106
dNTP Set, 4 x 25 &; molBiolineBIO-39025
GenomeLab DNA Size Standard Kit - 400Beckman Coulter608098
GenomeLab GeXP Sistema di analisi geneticaBeckman Coulter
GenomeLab608012
GenomeLab Gel di separazione LPA-1Beckman Coulter391438
HyperLadder 100bpBiolineBIO-33029
HyperLadder 1kbBiolineBIO-33025
Sistema di analisi delle immaginiLeica Microsystems
Molecular Imager VersaDoc MP 4000Bio-Rad170-8640
NanoDrop One SpettrofotometroThermo Fisher Scientific13-400-518
pH-Metro BASIC 20Crison
Phusion  Kit PCR ad alta fedeltàThermo Fisher ScientificF553S
Power Pack P 25 TBiometra
Primer ForwardIsogen Life Science
Primer ReverseIsogen Life Science
Quantity One SoftwareBio-Rad
Microscopio stereoscopicoLeica MicrosystemsMZ-16
Sub-Cell GTBio-Rad
SYBR Sicuro DNA Gel StainThermo Fisher ScientificS33102
T100 TermociclatoreBio-Rad1861096
Taq DNA PolimerasiQIAGEN201203
Supporto verticale AutoclaveJP Selecta
Beckman Coulter GenomeLab Tampone di separazione

Riferimenti

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Ristampe e permessi

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Autoincompatibilitàmicroscopia a fluorescenzaanalisi PCRidentificazione dell'allele Selettroforesi capillarecolorazione con blu di anilinacrescita del tubetto pollinicogruppi di incompatibilitàcultivar di albicocco
Determinazione delle relazioni di auto-compatibilità in Apricot Combinando l'impollinazione manuale, la microscopia e le analisi genetiche
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