Standardizzazione di un metodo non letale per caratterizzare lo stato riproduttivo e lo sviluppo larvale delle cozze d'acqua dolce (Bivalvia: Unionida)

Summary

La conservazione delle cozze d'acqua dolce dipende dal monitoraggio dei modelli riproduttivi e dei processi delle specie. Questo studio standardizza un protocollo non letale per il campionamento del contenuto branchiale, la caratterizzazione dello sviluppo larvale e la fornitura di un archivio digitale per i dati raccolti. Questo pacchetto di database di protocollo sarà uno strumento importante per i ricercatori di cozze nel recupero delle specie in pericolo.

Abstract

Il monitoraggio attivo dei tempi, dello sviluppo e dei modelli riproduttivi delle specie in via di estinzione è fondamentale quando si gestisce il recupero della popolazione. Le cozze d'acqua dolce sono tra gli organismi più in pericolo al mondo, ma le informazioni sullo sviluppo precoce (glochidico) e sui periodi di cova sono ancora carenti per molte specie. Studi precedenti si sono concentrati sulla complessa fase della storia della vita in cui le cozze femminili sono pronte a parassitizzare i pesci ospiti, ma pochi studi si sono concentrati sul periodo di rimuginare e sui tempi dello sviluppo larvale. Il protocollo qui descritto consente ai ricercatori di valutare in modo non letale lo stato di gravidità delle cozze femminili. I risultati di questo studio mostrano che questo metodo non influisce sulla capacità di una cozza femminile di rimanere gravida o diventare gravitadi di nuovo dopo che il campionamento è stato eseguito. Il vantaggio di questo metodo può consentire il suo utilizzo su specie minacciate a livello federale o in via di estinzione o altre popolazioni di elevata preoccupazione per la conservazione. Questo protocollo può essere adattato per l'uso sia su individui conservati che vivi ed è stato testato su una varietà di specie di cozze. Il database fornito è un deposito per una vasta gamma di informazioni sui tempi delle abitudini riproduttive e faciliterà i futuri sforzi di ricerca, conservazione e recupero delle cozze d'acqua dolce.

Introduction

La persistenza delle popolazioni nei sistemi di acqua dolce dipende dal successo della riproduzione e del reclutamento. Per gli organismi parassiti, identificare la complessità del ciclo di vita (ad esempio, fasi dello sviluppo larvale e strategie di attrazione ospite) può dare una visione delle abitudini riproduttive e dei processi critici di un organismo che influenzano il reclutamento. Tali informazioni diventano importanti quando le specie sono in pericolo, e il reclutamento di successo è necessario per sostenere le popolazioni rimanenti, o se il recupero richiede l'uso di propagazione in cattività per ristabilire le popolazioni estirpate.

Le cozze d'acqua dolce (Bivalvia: Unionida) sono considerate uno dei gruppi di organismi più in pericolo al mondo e una raccolta di abitudini riproduttive specifiche per specie potrebbe aiutare negli sforzi di ricerca^{1,2,3 ,4,5}. Con oltre 800 specie attualmente riconosciute distribuite in tutto il mondo, le cozze d'acqua dolce hanno punti caldi di diversità in Nord e Sud America, e nell'Asia sudorientale, ma le informazioni essenziali sulla storia della vita sono sconosciute a molte specie^{2, 5,6,7}. Le famiglie all'interno di questo ordine sono caratterizzate da stadi larvali parassitari che completano la metamorfosi in giovani viventi liberi durante l'attaccamento ad un ospite^7,8. Questa fase unica della storia della vita contribuisce alla biodiversità nei sistemi di acqua dolce, che sono attualmente in crisi⁹. Alti livelli di pericolo possono essere attribuiti a molte minacce antropogeniche tra cui l'inquinamento dei corsi d'acqua, l'alterazione e la distruzione dell'habitat, la riduzione dell'abbondanza e della diversità dei pesci ospiti e l'introduzione di specie invasive^{1, 10}. Come alimentatori di filtri bentici, le cozze scavano nel substrato e sono sensibili a contaminanti e inquinanti che drenano nello spartiacque¹¹. Il recupero delle specie di cozze è pertinente in quanto forniscono un'ampia varietà di servizi ecosistemici, tra cui il sequestro del carbonio, una fonte alimentare e la purificazione dell'acqua mediante l'alimentazione filtrata¹¹. Inoltre, sono state trovate cozze per indicare la salute dell'ecosistema, promuovere la biodiversità e, a sua volta, aumentare la resilienza di un ecosistema¹².

Molti studi sulle cozze d'acqua dolce si sono concentrati sullo studio dei requisiti di storia della vita precoce per informare meglio le valutazioni dello stato delle specie e le strategie di gestione. Le famiglie di cozze d'acqua dolce rilevanti per questo studio (ad esempio, Hyriidae, Margaritiferidae, Unionidae) hanno una strategia unica di storia della vita in cui le femmine covano larve (glochidia) nella loro branchia marsupiale⁸. Attraverso una varietà di strategie, la cozza femminile espelle la glochidia matura dalle branchie marsupiali per parassitare un ospite vertebrato con glochidia¹³. La ricerca sullo sviluppo glochidico all'interno delle branchie è stata modificata da una tecnica che utilizza siringhe ipodermiche per campionare il liquido gonadale dalle cozze vive e valutare la produzione di gameti^14,15,16. Poiché i ricercatori hanno convalidato questa metodologia non letale per il campionamento delle gonadi, è stata adattata per il campionamento delle branchie marsupiali per valutare lo sviluppo della covata^15,16. Lo sviluppo della covata può essere usato per decifrare le relazioni filogenetiche in quanto alcune specie di cozze possono covare la glochidia solo nelle due branche esterne (ectobranchus), solo le due branchie interne (endobranchus), o in tutte e quattro le branchie (tetrabranchus), ma questa caratteristica non è nota per ogni specie¹⁷. I modelli di cova sono stati precedentemente utilizzati per classificare le specie di cozze in base al fatto che le cozze femmina cotracciano la glochidia durante l'inverno (bradytictic) o per un breve periodo in estate (tatticica)¹⁸. Lo svernamento delle covate di cozze è stato sostenuto quando il ciclo riproduttivo di Anodonta è stato studiato¹⁹. Tuttavia, la biologia riproduttiva di base è stata studiata più a fondo nel corso degli anni e ha scoperto che questa dicotomia era una grossolana generalizzazione e i periodi di meditabondo di alcune specie sono molto più complessi di quanto originariamente si presumesse^20,21. Ad esempio, le specie del genere Hyridella (famiglia Hyriidae), Glebula e Elliptio (famiglia Unionidae) sono state osservate con più di tre nidiate per stagione riproduttiva^{22,23, 24}. La complessità delle abitudini di produzione specifiche delle specie, e talvolta anche della^popolazione,ha portato a una lacuna nella conoscenza dei tempi e della durata della covata e del numero di nidiate che una cozza femmina può produrre.

Anche se le siringhe ipodermiche sono state utilizzate per estrarre il contenuto branchiale, riportare i risultati è complicato a causa della mancanza di standardizzazione per garantire risultati comparabili in tutti gli studi. In precedenza, quattro stadi di sviluppo della glochidia (ad esempio, ovuli, embrioni, immaturi, completamente sviluppati) sono stati identificati in Unionidae, ma non sono stati adottati nella procedura standard^16,25,26. Altri studi che osservano i membri di Margaritiferidae hanno sostituito la classificazione della "glochidia immatura" con 'sviluppo della glochidia', portando a potenziale confusione^27,28. La mancanza di coerenza nel caratterizzare le diverse fasi di sviluppo larvale ha lasciato molti ricercatori a descrivere generalmente le femmine rimuginanti come "gravid", che non comprende la complessità dello sviluppo larvale. Studi sulla storia della vita che conducono sperimentazioni di pesci ospiti hanno dato priorità alla necessità di femmine gravid con glochidia completamente sviluppata, ma queste informazioni sono sparse in tutta la letteratura pubblicata e inedita^29,30. Attualmente, mancano dati sulle abitudini riproduttive di molte specie di cozze, tra cui la tempistica della transizione tra uovo, glochidia immatura e glochidia completamente sviluppata pronta per l'attaccamento agli ospiti. Per la maggior parte delle specie, non è chiaro per quanto tempo le femmine covano glochidia e quanto rapidamente le uova fecondate si sviluppano completamente. Le lacune di conoscenza sono spesso più ampie per le specie di interesse per la conservazione, il che presenta la necessità di un metodo standardizzato per estrarre il contenuto branchiale che è stato testato per gli effetti non letali e può essere promosso alla comunità scientifica per integrare metodologie di raccolta dati tradizionali, senza rappresentare una minaccia per le popolazioni protette^24,31,32.

Questo studio aveva tre obiettivi: 1) formalizzare una tecnica di campionamento branchiale e testarla per gli effetti letali e non letali sulle cozze femminili in situ, 2) caratterizzare le diverse fasi dello sviluppo glochidico e descrivere un metodo standardizzato di identificazione e segnalando varie fasi larvali, e 3) creare un archivio pubblico per i dati raccolti. Le indagini sul campo, i progetti di monitoraggio a lungo termine e le collezioni museali rappresentano tutte opportunità per l'attuazione del protocollo qui descritto e la raccolta di dati aggiuntivi per un più ampio ambito di interesse. Il protocollo formalizzato include immagini e descrizioni dei caratteri per differenziare ogni fase dello sviluppo larvale. Standardizzando le categorie, i risultati raccolti possono essere confrontati tra tutte le occorrenze e le specie. Una volta raccolti i dati, tutti possono essere presentati al Freshwater Mussel Gravidity Almanac (FMGA), che è un database per le informazioni sulla gravidità raccolte utilizzando questo protocollo. Un prodotto finale per memorizzare e compilare tutte le informazioni sulla gravidità raccolte fornirà uno strumento di ricerca per facilitare i futuri sforzi di ricerca, conservazione e recupero. L'incorporazione di questa metodologia in vari progetti di cozze e la presentazione di dati all'FMGA si espanderebbero sull'ampiezza delle conoscenze riguardanti lo stato di gravitismo delle specie di cozze durante tutto l'anno. Come un gruppo altamente in pericolo di organismi, questo protocollo e il database risultante sulle abitudini riproduttive delle cozze d'acqua dolce è essenziale per comprendere le dinamiche della popolazione e facilitare la conservazione di queste specie.

Protocol

1. Collezione femminile Gravid

NOTA: fare riferimento al protocollo³³ per l'indagine sulle cove d'acqua dolce del servizio pesca e fauna selvatica per indicazioni su come esaminare adeguatamente un sito di campionamento per le specie minacciate o in via di estinzione. Prima della raccolta sul campo di specie protette e di permessi statali per tutte le specie presenti devono essere ottenuti permessi federali adeguati.

1. Raccogliere le cozze dal campo dal campo utilizzando metodi tattili-visivi (passaggio 1.2) o utilizzare gli esemplari conservati da un museo (passaggio 1.3).
   NOTA: È importante mantenere le cozze vive fresche e bagnate dopo la raccolta per evitare la disidratazione e ridurre lo stress, e la manipolazione minima delle cozze gravide è importante evitare che le femmine rilascino prematuramente il contenuto branchiale³⁴.
2. Valutare la gravità femminile sia mediante ispezione visiva durante la raccolta (ad esempio, presenza di esche del mantello, congorizioni, ecc.) sia mediante ispezione visiva dopo la raccolta (ad esempio, indiscreti valvole aperte sufficienti a guardare all'interno e vedere se le branchie sono gonfiate, vedi Figura 1).
   NOTA: Le specie variano nel modo in cui la glochidia viene covata all'interno delle branchie marsupiali poiché a volte solo le due branchie esterne (ectobranchus), solo le due branchie interne (endobranchus), o tutte e quattro le branchie (tetragenhe) sono marsupiali¹⁷. Il protocollo può essere sospeso qui, e le femmine gravide possono essere trasportate di nuovo al laboratorio per il campionamento branchiale.

Figura 1: Apertura di individui delicatamente indiscreti. Per controllare la gravità di una cozza viva, aprire delicatamente le valvole con i pollici (A) o usare con cautela uno speculum o pinze inverse per aprire le valvole (B). Esaminare il passaggio 2.3 nel protocollo per le avvertenze associate a questo metodo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Eseguire un'ispezione visiva sui campioni conservati aprendo le valvole e ispezionando le branchie per determinare se l'individuo è una femmina gravida(Figura 2).

Figura 2: Come identificare una donna gravida. Le branchie marsupiali di cozze femminili appaiono gonfiate quando la femmina è gravida e meditabondo. Le foto A e C mostrano le branchie da una prospettiva laterale, mentre le foto B e D offrono una vista ventrale delle branchie. Le scatole rosse delineano le branchie per evidenziare le differenze tra una cozza di Lampade silminea gravida (A/B) non gravidiato (C/D). Le lunghezze totali degli individui sono 79 mm (A/B) e 88 mm (C/D). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Campionamento dei contenuti Gill

NOTA: Questo protocollo può essere adattato se il campionamento avviene su cozze vive sul campo e in laboratorio, o su campioni conservati.

1. Preparare un tubo di raccolta delle microcentrifuge di plastica da 1,5 ml con circa 1 mL di acqua sterile se il contenuto branchiale viene valutato entro 24 h dall'estrazione³⁵ o dall'etanolo (EtOH) se la valutazione del campione non può essere effettuata entro 24 h dalla raccolta o se il branchia contenuti provengono da un esemplare del museo conservato in EtOH. Se la glochidia è destinata all'imaging a microscopio elettronico a scansione (SEM), utilizzare il 70% EtOH, e se la glochidia verrà utilizzata per i test genetici, utilizzare il 95% EtOH³⁶.
2. Rimuovere l'involucro di carta per un ago sterile da 20 G con la punta a smussatura su una siringa da 10 mL. Svitare il tappo per esporre l'ago e preparare un tubo di plastica da 1,5 ml per la raccolta dei contenuti branchiali. Spingere la maniglia della siringa fino in fondo in modo che il tappo nero sia sulla linea 0 mL/cc.
   NOTA: Ogni volta che viene campionato il contenuto branchiale, è necessario utilizzare una siringa sterile. Una siringa usata può essere sterilizzata sul campo immergendo la punta in una soluzione di candeggina al 10%, quindi risciacquando la siringa riempiendola con 1 mL di acqua sterile e deprimendo lo stantuffo di nuovo a 0 mL/cc, e infine asciugando la siringa con un panno pulito.
3. Raccogliere la femmina gravida e sollevare delicatamente le due valvole utilizzando le punte dei pollici.
   AVVISO: Fare attenzione a non danneggiare l'animale. L'apertura delle valvole troppo larghe o troppo veloci può esagerare i muscoli adduttori e causare mortalità. Gli esemplari a guscio sottile (ad esempio, specie di Anodonta, Leptodea, Utterbackia,ecc.) e i giovani individui sono particolarmente vulnerabili in questo passaggio. La manipolazione forzata di specie dal guscio fragile può rompere i gusci e causare mortalità. In alcuni casi, schiacciare animali dal guscio sottile dai margini anteriore e posteriore del guscio, guardando la superficie ventrale, farà sì che il guscio si flettere e gape leggermente, permettendo di osservare le branchie o aprire i gusci ed evitare di danneggiare il fragile margine della shell.
   NOTA: Gli strumenti possono essere utilizzati per aiutare con questo passaggio, ma possono anche causare mortalità se non utilizzati con cura e devono essere evitati quando possibile. Ad esempio, uno speculum o un insieme modificato di pinze inverse può essere utilizzato per aiutare a far leva l'individuo aperto e un cuneo può essere utilizzato per aiutare a sostenere l'apertura delle valvole. Questi strumenti potrebbero non essere necessari se un'altra persona è disponibile ad assistere (cioè, una persona tiene l'animale aperto mentre un altro manovra la siringa per l'estrazione). Danneggiare o separare il tessuto del mantello dal periostracum può causare deformità di crescita e mortalità³⁷; pertanto, è fondamentale evitare di recidere la connessione tra il tessuto del mantello e il margine esterno del guscio.
4. Utilizzare la punta dell'ago della siringa per penetrare delicatamente un singolo tubo d'acqua della branchia marsupiale gonfiata. Successivamente, raccogliere delicatamente il contenuto della branchia utilizzando la punta smussata dell'ago.
   NOTA: Il contenuto di Gill di solito ha una consistenza bianco latte, che dovrebbe essere visibile sulla punta smussata dell'ago.
   1. Depositare il contenuto della siringa direttamente in una piastra Petri se un microscopio è prontamente disponibile. In caso contrario, conservare il contenuto in un tubo di microcentrifuga di plastica da 1,5 ml con liquido designato (vedere la fase 2.1) per una valutazione successiva.
      NOTA: ridurre al minimo il disturbo e la gestione dei campioni di glochidia durante il trasporto per evitare danni e ridurre la redditività^32,35.
5. Registrare informazioni sull'identificazione delle specie di genere, lo stato di gravidità, la lunghezza della femmina (mm), la collettore e le informazioni di contatto, stato, contea, drenaggio, posizione di raccoltaspecifica, latitudine e longitudine, un identificatore univoco per la branchia esempio, un identificatore univoco per il sito di indagine e la data di raccolta se il contenuto branchiale è stato estratto (Figura 3). Registrare un identificatore univoco su ogni nave di raccolta per garantire record di dati accurati durante il trasporto.
   1. Fotografare la valvola destra esterna della cozza per la convalida dell'identità e includere il tubo etichettato con l'identificatore univoco leggibile nella foto. Facoltativamente, raccogliere altri parametri abiotici e biotici per integrare le informazioni sull'ambiente e la comunità in cui è stata trovata la cozza (vedere la figura 3 per suggerimenti).

Figura 3: Esempio di un foglio dati di gravidità dei campi. Una segnalazione accurata dei dati è necessaria se viene prelevato un campione branchiale per produrre informazioni affidabili. Questo è un esempio di un foglio dati di campo con i campi minimi e parametri abiotici extra da raccogliere insieme a ogni campione branchiale. Per informazioni più complete, vedere il passaggio 4.1 del protocollo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Valutazione di laboratorio del contenuto branchiale

1. Se il contenuto della branchia è in un tubo da 1,5 mL, trasferirli in un piatto Petri e riempire il fondo del piatto con acqua. Ruotare delicatamente il piatto Petri con un movimento circolare per raccogliere i contenuti al centro del piatto per una vista più concentrata del campione.
   NOTA: Potrebbe essere necessario lavare il tubo da 1,5 mL utilizzando una bottiglia di squirt o un tubo di trasferimento riempito con acqua se il contenuto branchiale si attacca alle pareti del tubo.
2. Posizionare la parabola Petri al microscopio dissettivo per valutare il campione. Se possibile, scattare una fotografia del campione branchiale al microscopio ed etichettarlo con l'identificatore univoco per quel campione.
   1. Registrare i risultati di cui sono presenti le fasi di sviluppo in ogni campione branchiale. Utilizzare Figura 4 come guida per caratterizzare ogni fase di sviluppo. In alcuni casi, le femmine possono essere larve rimuginanti in più fasi di sviluppo; pertanto, riferire ogni fase di sviluppo osservata all'interno di un dato campione (ad esempio, "EGG/DG/IMG/FDG"). Una volta valutata la glochidia conservata, procedere alla sezione 4. Se si identifica la glochidia completamente sviluppata e l'EtOH non è stato utilizzato per la conservazione, procedere al passaggio 3.3.
      NOTA: EGG, masse di uova; DG, lo sviluppo di glochidia; IMG, glochidia immatura; FDG, glochidia completamente sviluppata.

Figura 4: Rappresentazioni per varie fasi dello sviluppo della glochidia nelle branchie marsupiali. (A) Le masse di uova (EGG) hanno una membrana che fa raggruppare le uova. All'interno di ogni membrana dell'uovo c'è una massa sferica opaca di cellule differenzianti. La massa sferica opaca può dividersi in più masse sferiche durante la divisione cellulare precoce, ma deve comunque essere registrata come EGG fino a quando non viene osservata una forma bivalstra distinta. (B) La glochidia immatura (IMG) ha una massa a forma di bivalve distinta contenuta all'interno della membrana dell'uovo. (C) Lo sviluppo della glochidia (DG) ha una forma bivalse distinta, nessuna membrana dell'uovo e tessuto non organizzato all'interno, spesso sfocato in apparenza. Lo sviluppo della glochidia (DG) non è reattivo quando è esposto a NaCl e classificato come "DG(T)" quando i dati vengono registrati. (D) La glochidia completamente sviluppata (FDG) ha la forma bivale distinta e l'evidente tessuto muscolare adduttore che permette alla glochidia di chiudersi. La glochidia completamente sviluppata (FDG) è spesso osservata come due valvole aperte dopo la conservazione. Due valvole aperte di solito si bloccano, o si bloccano e si chiudeno, quando esposte a NaCl e sono classificate come 'FDG(T)'. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Condurre un test di cloruro di sodio (NaCl) per valutare ulteriormente la vitalità di qualsiasi glochidia completamente sviluppata aggiungendo un cristallo di NaCl a una goccia di subset del campione^{branchiale 35}. La glochidia vitale risponderà a NaCl chiudendo le valvole da una posizione aperta. Segnalare qualsiasi glochidia testata al sale con '(T)' alla fine della designazione quando vengono registrati i dati.
   NOTA: la glochidia completamente sviluppata può anche essere osservata scattare attivamente aperta e chiusa senza esposizione a NaCl.

4. Segnala al database

1. Accedi al web FMGA (http://arcg.is/089uee), che è stato sviluppato utilizzando programmi software online^38,39,40. La pagina FMGA fornisce un collegamento al modulo di immissione dati desktop e un download dell'applicazione per dispositivi mobili. L'app mobile consente l'immissione di dati sul campo e la georeferezione automatica⁴¹.
   NOTA: Il calendario di gravità e altre grafiche associate agli eventi di storia della vita delle specie di cozze d'acqua dolce possono essere trovati anche sul cruscotto FMGA.
   1. Utilizzare l'app per dispositivi mobili o il sito desktop per registrare i risultati nel modulo di immissione dati utilizzando i menu a discesa e i campi di immissione testo. Per set di dati preesistenti di grandi dimensioni, contattare gli autori del foglio di calcolo del modello. Immettere i dati registrati sotto le intestazioni di colonna appropriate, tenendo presente che ogni record, o riga del foglio di calcolo, rappresenta le osservazioni di un campione di branchia da un individuo gravid.
   2. Invia i risultati e questi verranno aggiunti al database FMGA dopo essere stati convalidati da un amministratore, che può contattare il raccoglitore per richiedere ulteriori dettagli o foto.
      NOTA: una volta convalidati e compilati i dati nel database FMGA, tutti i calendari di gravidità e altri elementi grafici interattivi visualizzati nel dashboard FMGA verranno aggiornati.

Results

Questo protocollo è stato applicato durante uno studio di cattura-mark-recapture che ha monitorato la comunità di cozze d'acqua dolce all'interno di un tratto di 750 m² di Bruce Creek (Walton County, Florida) da gennaio 2015 a dicembre 2015. Il campionamento sul campo era previsto ogni quattro settimane; tuttavia, a causa di eventi ad alto flusso, il campionamento non è stato condotto nell'aprile o nel settembre del 2015. Agenzie statali e federali, tra cui U.S. Geological Survey, U.S. Fish and Wildlife Service, e Florida Fish and Wildlife Conservation Commission hanno assistito nelle indagini sul campo e nel campionamento delle branchie. Ogni donna gravida riscontrata durante l'indagine è stata sottoposta a campionamento del contenuto branchiale sul campo utilizzando il protocollo sopra descritto, taggato (vedi Tabella dei materiali),e rimesso nel substrato del fiume. I campioni branchiali sono stati conservati nel 95% EtOH e trasportati al laboratorio della Wetland and Aquatic Research Center dello U.S. Geological Survey per la valutazione del contenuto branchiale.

Taggando le femmine e ricatturandole a intervalli mensili durante tutto l'anno, abbiamo valutato gli impatti sia letali che non letali del protocollo di campionamento branchiale su un totale di 90 individui. Le seguenti sette specie sono state riconquistate durante questo studio: Elliptio pullata (n - 5), Fusconaia burkei (n - 1), Hamiota australis (n n n : 19), Obovaria choctawensis (n - 1), Strophitus williamsi (n ) Villosa lienosa (n - 60) e Villosa vibex (n - 3). Il nostro campionamento comprendeva individui che andavano da 24 mm a 80 mm di lunghezza totale e due specie (F. burkei e H. australis) protette dallo U.S. Endangered Species Act. Tutti i dati utilizzati in questo studio sono disponibili al pubblico Abbiamo fornito l'accesso al nostro set di dati su ScienceBase (https://doi.org/10.5066/P90VU8EN)⁴².

La sopravvivenza è stata valutata dal numero di individui che sono stati ricatturati vivi dopo la raccolta dei campioni branchiali. Abbiamo osservato un'elevata sopravvivenza (97%) durante lo studio con una certa mortalità, probabilmente ricontrazionibile alla predazione, indicato da osservazioni in loco. I risultati hanno mostrato che circa il 51% degli individui (46 di 90) è rimasto gravid tra eventi di campionamento consecutivi. Un altro 10% degli individui (9 su 90) sono stati trovati gravid, ricatturati non gravid, e trovato gravid di nuovo. Circa il 39% degli individui (35 su 90) in questo studio sono stati trovati gravid, un campione di branchia è stato prelevato, ma quando ricatturato di nuovo durante tutto l'anno, non sono mai stati trovati gravid una seconda volta. I risultati indicano che il protocollo qui descritto non è né letale né subletale e non disturba sostanzialmente l'attuale periodo di cova dopo la campionatità della branchia.

Anche se le dimensioni dei campioni in questo studio sono diseguali tra le specie, i risultati di questo studio evidenziano le applicazioni benefiche e pratiche di questo protocollo. Il calendario di gravidità per V. lienosa illustra le femmine gravid che le femmine meditano FDG sono state trovate in quasi ogni mese dell'anno tranne agosto, quando sono state trovate solo femmine che meditabono EGG (Figura 5A). La femmina H. australis non è stata trovata gravid (NG) nei mesi di luglio, agosto e dicembre. Una percentuale maggiore di femmine stava meditando Gli FDG in gennaio e febbraio, ma sono stati trovati anche in ottobre e novembre(figura 5B). Nessun individuo di E. pullata è stato trovato meditabondamento FDG anche se le femmine stavano meditando EGG da maggio a giugno, e una femmina gravida registrata (GFR) nel mese di giugno (Figura 5C). L'unica donna gravitata di F. burkei è stata trovata GFR a giugno e riconquistata NG nel mese di luglio. Lo stesso individuo O. choctawensis è stato raccolto FDG nel mese di febbraio e ricatturato NG nel mese di luglio. Solo un S. williamsi fu trovato e fu ricatturato tre volte. Questa femmina è stata trovata FDG nel mese di marzo, NG in maggio, GFR nel mese di giugno, e EGG nel mese di agosto (Figura 5C). Tra febbraio e giugno sono state trovate femmine gravidiasse di V. vibex brooding FDG(Figura 5C).

Figura 5: Risultati dello studio in Bruce Creek, FL visualizzati in un formato di calendario di gravidità. (A) Calendario gravitale per Villosa lienosa cattura/ricattura. (B) Il calendario di gravità per Hamiota australis cattura/riacquisisce. (C) Calendari di gravità per tutte le specie con meno di 10 individui campionati. L'asse y include le abbreviazioni per i mesi gennaio (Ja), febbraio (F), marzo (Mr), maggio (My), Giugno (Jn), Luglio (Jl) Agosto (A), Ottobre (O), Novembre (N) e Dicembre (D). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Significato

La conservazione delle specie in pericolo dipende dal successo del reclutamento all'interno delle popolazioni esistenti. In alcuni casi, la propagazione artificiale può essere necessaria per aumentare il reclutamento di queste popolazioni a rischio. Ciò richiede che i ricercatori siano informati sui tempi di riproduzione attiva per ogni specie ed eventualmente applichino diverse metodologie o pratiche di gestione per mitigare l'impatto sul reclutamento. Come gruppo di organismi in pericolo, è fondamentale stabilire un approccio standardizzato e non letale per studiare le abitudini riproduttive e fornire una piattaforma su cui compilare e visualizzare i dati per informare la comunità scientifica con le più aggiornate informazioni disponibili. Questo studio fornisce un protocollo passo-passo per garantire che vengano prese precauzioni, e il contenuto delle branchie può essere adeguatamente campionato e valutato da cozze femminili. Questo protocollo è stato testato per gli effetti letali e non letali, consentendo a i ricercatori e manager di implementare responsabilmente questa metodologia. Abbiamo inoltre sviluppato una suite di strumenti e applicazioni per la gestione dei database per facilitare la compilazione di informazioni sulla gravidità su un dashboard disponibile pubblicamente e di facile utilizzo. Gli studi sull'epidemiologia, la morfologia della glochidia, la storia della vita, la filogenetica, la propagazione e le traslocazioni possono tutti trarre beneficio e utilizzare questo archivio di informazioni sulla gravidità temporale per tutte le specie di cozze d'acqua dolce.

Questo studio da solo ha sostenuto i risultati di studi precedenti di alcune abitudini riproduttive delle specie, ma ha anche rivelato nuove informazioni su altre. Anche se V. vibex è stato raccolto in meno di V. lienosa, le somiglianze possono essere trovate tra i due sulla base dei dati di gravidità. Entrambe le specie di Villosa sembrano covare glochidia completamente sviluppato durante una gran parte dell'anno, che li caratterizza come una covata svernante. Questo è coerente con studi precedenti su altre specie di Villosa ^43,44,45. I risultati di questo studio suggeriscono che H. australis può essere trovato gravid da ottobre e svernamento in giugno, tranne nessuna cattura sono stati trovati gravid nel mese di dicembre. Uno studio pubblicato in precedenza ha identificato il congene H. altilis con un periodo di gravidità di quattro mesi, da marzo a^{giugno 46,47}. Questa scoperta illustra un periodo di gravidità più lungo di quanto si pensasse in precedenza e generalmente raggruppa H. australis come una covata svernante. Come specie protette a livello federale, diversi periodi di cova per H. altilis e H. australis potrebbero influenzare le decisioni di gestione per proteggere meglio le popolazioni durante i tempi di attività riproduttiva. Elliptio pullata sono stati trovati gravid solo con EGG in maggio e giugno che corrisponde alla loro caratterizzazione come una specie tachitica con un brevissimo periodo di cova^{24,48,49, 50}. Poiché i dati vengono compilati sulle specie di Elliptio utilizzando questo protocollo, informazioni dettagliate possono rendere gli sforzi sul campo più efficienti quando determinate fasi di sviluppo glochidico sono mirate, poiché la glochidia si trovano solo pochi mesi all'anno. L'inferenza delle altre specie con dimensioni di campione più basse è limitata, ma man mano che i dati vengono compilati nella banca dati, dimensioni del campione più elevate daranno informazioni sulle abitudini riproduttive di altre specie di cozze.

Osservazioni procedurali

Le cozze d'acqua dolce e la loro glochidia sono noti per essere suscettibili a fattori di stress antropogenici^10,35. Durante l'ispezione della gravidità, le valvole delle cozze potrebbero non essere facili da aprire e forzare con noncuranza le valvole aperte può causare danni involontari e provocare stress o mortalità. Alcune specie a conchiglia fragile (ad esempio, specie di Anodonta, Leptodea, Utterbackia,ecc.) e individui di dimensioni più piccole possono avere gusci molto fragili e muscoli adduttori deboli che possono rompersi e strapparsi facilmente. Il campionamento della branchia può essere considerato un fattore di stress se la manipolazione non viene eseguita in modo responsabile e con cautela. Uno studio precedente ha scoperto che la manipolazione e l'esposizione aerea delle cozze durante i periodi di attività riproduttiva possono causare vari stress fisiologici, tra cui il rilascio prematuro del contenuto^{branchiale 34}. Tuttavia, uno studio che utilizza va su una metodologia simile a quella descritta qui, ha scoperto che la gestione delle cozze femminili gravidate durante il campionamento delle branchie non ha interrotto l'attuale covata o ha causato un rilascio prematuro sia nelle specie di covata a breve che a lungo termine¹⁶. Inoltre, una siringa sterile deve essere utilizzata durante questo protocollo per prevenire qualsiasi infezione involontaria o contaminazione incrociata quando si perforano branchie di più individui. Inoltre, la glochidia è fragile e le nidiate possono essere maturate e stressate ma non espulse. La glochidia matura in cattive condizioni di salute può portare a un minor numero di individui che reagiscono ai test del sale³⁵. Quando si effettua la distinzione tra DG(T) e FDG(T) è importante testare il sale con un campione di grandi dimensioni, prendere nota sulle osservazioni per identificare attentamente le distinzioni tra DG e Glochidia FDG utilizzando le descrizioni fornite in questo studio. Quando si fa cura adeguata, lo stress minimo indotto da questa procedura può consentire alle cozze femminili di continuare a meditare la glochidia naturalmente e ridurre gli impatti sul reclutamento nella popolazione.

Ulteriori dati possono essere registrati per integrare il database e fornire un ampio contesto per le abitudini riproduttive delle cozze d'acqua dolce. Alcune specie (ad esempio, specie di Fusconaia), sono state osservate avere branchie di colori diversi in base allo stadio di sviluppo della glochidia⁵¹. Durante un controllo iniziale della gravità della femmina, una descrizione del colore branchiale può essere inclusa nei dati riportati per consentire indagini future. Inoltre, a questo punto del protocollo, i ricercatori possono notare se la femmina covata è stata trovata glochidia meditabonda nelle due branchie esterne (ectobranchus), due branchie interne (endobranchus), o tutte e quattro le branchie (tetragenhe)¹⁷. Queste informazioni possono essere aggiunte all'FMGA e aiutano a colmare le lacune di dati relative alla cova per ogni specie studiata. Le condizioni ambientali, in particolare la temperatura dell'acqua, possono essere raccolte e registrate sul campo per un'osservazione più completa dello stato di gravidità e dei tempi delle specie a varie gamme latitudinali. La ricerca mostra che i parametri ambientali, come la temperatura, il fotoperiodo, la portata e la disponibilità di cibo, possono indurre eventi riproduttivi nelle cozze d'acqua dolce^{52,53,54,55 ,56}. Ulteriori campi possono essere aggiunti alla banca dati in quanto vengono presentati per promuovere la ricerca futura sui fattori abiotici che influenzano la gravità. Una modifica di cattura-mark-recapture modellata dopo il nostro studio può anche essere aggiunto a questo protocollo, che consentirebbe ai ricercatori di monitorare le abitudini riproduttive di una cozza specifica e rivelare informazioni su più nidiate all'anno.

L'accuratezza delle informazioni nell'FMGA dipende dalla fonte. Ad esempio, l'errata identificazione delle cozze d'acqua dolce è comune a causa di molte specie con caratteristiche esterne simili che rendono difficile distinguere tra le specie⁵⁷. Un campione branchiale di un individuo non identificato in modo improprio potrebbe creare confusione e false informazioni per il periodo di cova di una specie. Se viene prelevato un campione branchiale, è necessario fotografare entrambe le valvole (se l'individuo non è vivo), all'esterno della valvola destra e l'umbo (cerniera dove si connettono due valvole) e inviarle con dati di gravidità attraverso il sito desktop o l'applicazione mobile. Accogliamo anche le foto dei contenuti branchiali. All'interno dei moduli di presentazione c'è un menu a discesa che consente al collettore di indicare il loro livello di confidenza per quanto riguarda l'identificazione delle specie. Prima che il record venga convalidato, queste informazioni saranno prese in considerazione quando si verifica l'identificazione del collettore rispetto alla distribuzione plausibile, ecc. A causa dell'elevato grado di variazione morfologica intraspecifica nelle specie di Unionidae, la presentazione di campioni di tessuto è incoraggiata e può essere necessaria per facilitare l'identificazione molecolare.

Implicazioni future

Come metodo non letale, questo protocollo può essere applicato sia alle specie comuni che a quella in pericolo. I calendari di gravità per le specie in pericolo possono aiutare i responsabili della conservazione coinvolti nella legislazione sulle specie in via di estinzione e nella pianificazione del recupero fornendo informazioni sui periodi di tempo in cui le specie sono riproduttivamente attive. Le agenzie statali e federali che gestiscono le specie a rischio possono consigliare meglio l'assegnazione dei permessi per i periodi in cui la specie non è vulnerabile e riproduttiva, e persino limitare la raccolta di pesci ospiti durante i periodi in cui le cozze stanno rimuginando glochidia completamente sviluppate. Inoltre, le indagini sul campo possono colpire le specie durante i periodi non riproduttivi per ridurre al minimo l'impatto sui processi di reclutamento. La banca dati accessibile al pubblico, FMGA, fornisce uno strumento per ricercatori e manager per ottenere importanti informazioni riproduttive su qualsiasi specie di cozze d'acqua dolce bersaglio. La banca dati metterà inoltre in evidenza le lacune nei dati, incoraggiando ulteriori ricerche sui modelli di cova specifici delle specie. Poiché la comprensione di un modello riproduttivo delle specie consente di attuare decisioni di gestione adeguate, ci auguriamo che il nostro protocollo e il nostro database facilitino la futura ricerca, conservazione e recupero delle cozze d'acqua dolce.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Provette da centrifuga con tappo a scatto da 1,5 mL	USA Scientific	1615-5510	Le provette con tappo a scatto sono importanti sul campo in modo che il tappo a vite allentato non vada perso.
Ago da 20 G su siringa monouso da 10 mL	Exelint International	26255	siringa monouso sterile da 10 mL con ago Modello: 10ml Luer Lock Tip W/20G X 1 1/2"
Microscopio da dissezione	qualsiasi
qualsiasi penna per marcatura	Fisher Scientific	13-379-4	Questo è quello che abbiamo usato, ma qualsiasi pennarello in grado di scrivere su piccoli tubi di plastica andrà bene. Questo è abbastanza resistente all'etanolo e all'acqua.
Etanolo di grado molecolare	qualsiasi		necessario se si conserva il contenuto delle branchie. Il 95% non denaturato è necessario per il lavoro genetico, il 70% è necessario per il lavoro di imaging SEM.
Carta	qualsiasi	necessario	per registrare le informazioni sui campioni raccolti.
Penna/matita	qualsiasi		Se sul campo, meglio scrivere su carta impermeabile con la matita in modo che non si sbava. Se sei nel museo/laboratorio, qualsiasi strumento di scrittura va bene.
Piastra di Petri	DWK Life Sciences (Kimble)	23000-9050	Questo è quello che abbiamo usato, ma qualsiasi capsula di Petri disponibile va bene. È più bello avere le pareti più alte nel caso in cui si usi troppa acqua.
Cloruro di sodio	qualsiasi	necessario	per il test NaCl per i glochidi reattivi. I campioni conservati non ne hanno bisogno.
Speculum	qualsiasi	qualsiasi necessario	solo se si desidera aiuto per aprire le valve di una cozza viva.
Acqua sterile	, qualsiasi		Aggiunto ai campioni branchiali da valutare per la reattività entro 24 ore dalla raccolta.
Super colla	Gorilla	Gorilla super colla gel	Utilizzato per applicare etichette ed è necessario solo se si conduce uno studio di cattura-segno-ricattura.
Tags	Hallprint	FPN 8x4	Necessario solo se si conduce uno studio di cattura-marcatura-ricattura.
Pipetta di trasferimento	Thermo Scientific Samco	225	Questo è ciò che usiamo, ma è applicabile qualsiasi pipetta di trasferimento o flacone a spruzzo.
Pinzette	qualsiasi	necessario	per spostare i cristalli di NaCl per il test del sale. I campioni conservati non ne hanno bisogno.
Carta impermeabile	RainWriter	qualsiasi	Necessario solo se si svolge un lavoro sul campo. Ciò consente di registrare informazioni su ogni singola branchia da cui vengono estratti i contenuti.
Piccone di legno	qualsiasi	necessario	solo se vuoi aiuto per aprire le valve di una cozza viva.