Articolo metodologico

Visualizzazione del peptide batterico per la selezione di nuovi enzimi biotinylami

DOI:

10.3791/60266

⸱

3 ottobre 2019

 ,  , 
1Department of Molecular Medicine, University of Southern Denmark, 2Department of Nephrology, Odense University Hospital

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui presentiamo un metodo per selezionare per nuove varianti della ligase biotina-proteina E. BirA che biotinyili uno specifico peptide bersaglio. Il protocollo descrive la costruzione di un plasmide per la visualizzazione batterica del peptide bersaglio, la generazione di una libreria BirA, la selezione e la caratterizzazione delle varianti BirA.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La biotina è un'interessante modifica post-traduzionale delle proteine che fornisce un potente tag per l'isolamento e il rilevamento delle proteine. La biotinyalazione enzimatica da parte della ligase biotina-proteina E. tuttavia, l'attuale utilizzo della biotinylazione mediata BirA richiede la presenza di un peptide accettatore sintetico (AP) nella proteina bersaglio. Pertanto, la sua applicazione è limitata alle proteine che sono state progettate per contenere l'AP. Lo scopo del protocollo attuale è quello di utilizzare la visualizzazione batterica di un peptide derivato da una proteina bersaglio non modificata per selezionare per le varianti BirA che biotinyla il peptide. Il sistema si basa su un singolo plasmide che consente la co-espressione delle varianti BirA insieme a un'impalcatura per la visualizzazione del peptide sulla superficie batterica. Il protocollo descrive una procedura dettagliata per l'incorporazione del peptide bersaglio nello scaffold di visualizzazione, la creazione della libreria BirA, la selezione delle varianti BirA attive e la caratterizzazione iniziale delle varianti Isolate BirA. Il metodo fornisce un sistema di selezione altamente efficace per l'isolamento di nuove varianti BirA che possono essere utilizzate per l'ulteriore evoluzione diretta dei ligas proteici biotina che biotinyano una proteina nativa in soluzioni complesse.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La biotinyalazione di una proteina crea un tag potente per il suo isolamento e rilevamento dell'affinità. La biotinylazione delle proteine ezimatiche è una modificazione post-traduzionale altamente specifica catalizzata dai ligas di biotina-proteina. La ligase biotina-proteina E. BirA è estremamente specifica e covalentmente biotinyla solo un numero limitato di proteine naturali a specifici residui di lisina1. I vantaggi della biotinylazione catalizzata BirA sono attualmente sfruttati fondendo la proteina bersaglio con un piccolo peptide biotina aminoacido sintetico (AP) che è efficacemente biotinylated2 e consente l'altamente specifico e biotinylazione in vivo e in vitro efficiente per co-espressione o aggiunta di BirA3,4,5. Anche se la legatura biotina-proteina in vivo e in vitro BirA catalizzata è un'interessante strategia di etichettatura, la sua applicazione è limitata a campioni che contengono proteine Fuse AP. Lo scopo di questo metodo è lo sviluppo di nuovi mutanti di legamenti biotino-proteine che biotinylano selettivamente le proteine native non modificate e, quindi, espandono il numero di applicazioni in cui può essere utilizzata la strategia di biotinylazione enzimatica.

La funzione proteica può essere evoluta attraverso cicli iterativi della mutazione genica, della selezione e dell'amplificazione delle varianti genetiche con la funzione desiderata. Una strategia di selezione forte ed efficiente è fondamentale per l'evoluzione diretta e l'attività della ligase biotina-proteina è facilmente selezionata a causa del forte legame tra biotina e streptavidin ai suoi omologhi6. Le tecnologie di visualizzazione dei fagi consentono la selezione di fagi che visualizzano peptidi biotinylati7,8. Poiché l'amplificazione di fagi isolati richiede l'infezione di un ospite batterico, tuttavia, la selezione dei fagi con streptavidina crea un collo di bottiglia in quanto il legame ad alta affinità della biotina alla streptavidina è praticamente irreversibile sotto non-denatura Condizioni. Per garantire il legame reversibile dei fagi biotinylati, sono stati utilizzati aftaepiine monomeriche con minore affinità che hanno portato a un modesto arricchimento di 10 volte7. Recentemente abbiamo sviluppato un metodo di visualizzazione batterica per l'isolamento delle nuove varianti BirA che elimina la necessità di eguagliare dalla matrice di affinità e quindi rimuove un collo di bottiglia dai precedenti sistemi di selezione BirA9. Infatti, il nostro sistema di visualizzazione batterico consente un >1,000.000 volte l'arricchimento di cloni attivi in un'unica fase di selezione9,fornendo così un sistema di selezione efficace per l'evoluzione diretta di nuove varianti BirA.

Il nostro sistema di visualizzazione batterica è costituito da due componenti, BirA con un terminale C 6xIl suo tag e una proteina scaffold che consente la visualizzazione superficiale di un peptide bersaglio. Abbiamo usato la proteina scaffold potenziata circolaremente permutata proteina della membrana esterna X (eCPX) poiché l'efficace visualizzazione dei peptidi può essere osservata sia al bi-termini N che a quello C10,11. La fusione della sequenza di peptidi di destinazione con il capo"C di eCPX assicura la biotinylaazione dei batteri che esprimono varianti BirA attive. I batteri consentono l'effettiva selezione di streptavidin come il peptide biotinylato ora visualizza sulla superficie (Figura 1a).

Lo scopo di questo metodo è quello di selezionare per nuove varianti di BirA che biotinylas sequenze di peptidi presenti nelle proteine native. Il sistema è codificato da geni presenti sul pBAD-BirA-eCPX-AP, che contiene un promotore arabo-inducibile che controlla BirA (araBAD), e un promotore T7 che controlla eCPX9 (Figura 1b). Il presente protocollo descrive la procedura dettagliata per 1) incorporazione di un peptide derivato da una proteina bersaglio nel terminale C di eCPX, 2) creazione di una libreria mutazionale di BirA mediante PCR soggetto a errori, 3) selezione di batteri leganti streptavidina lo smistamento cellulare attivato magnetica (MACS), 4) la quantificazione dell'arricchimento dei batteri e 5) la caratterizzazione iniziale dei cloni isolati.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Inserimento della sequenza di sequenza di codifica peptide in pBAD BirA-eCPX-AP

NOT: Per selezionare le varianti di BirA che biotinyano una proteina bersaglio nativa, inizia identificando una sequenza di peptidi di 15 aminoacidi nella sequenza primaria delle proteine che contiene almeno un residuo di lisina (K).

  1. Vai al suite di manipolazione della sequenza12.
  2. Incollare la sequenza di peptidi di 15 aminoacidi identificata nella casella di input in formato FASTA e premere Invia.
  3. Selezionare e copiare la traduzione inversa a 45 nucleotidi della sequenza peptide.
  4. Scarica il file GenBank per pBAD-BirA-eCPX-AP di http://n2t.net/addgene:121907.
  5. Caricare il file in un editor plasmide (ad esempio, ApE) e, nella finestra delle caratteristiche, selezionare la sequenza AP designata "AviTag(TM)".
  6. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla sequenza PA evidenziata nella finestra della sequenza DI DNA e selezionare Incolla Rev-Com nel menu contestuale.
    NOT: La sequenza di codifica di eCPX è nella direzione inversa e la sequenza di codifica peptide dovrebbe, quindi, essere incollata come complemento inverso.
  7. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla sequenza evidenziata e selezionare Nuova feature.
  8. Aggiungere un nome descrittivo della sequenza inserita e premere OK.
  9. Selezionare Salva con nome nel menu File per salvare il file modificato.
  10. Progettare il primer in avanti per includere gli ultimi 30 nucleotidi del complemento inverso della sequenza di codifica dei peptidi e aggiungere la sequenza nucleotide di legame plasmid (3'-GCGGCCGCGCGC-5') alla sua estremità 5'.
  11. Progettare il primer inverso in modo da includere i primi 30 nucleotidi del complemento inverso della sequenza di codifica dei peptidi e aggiungere la sequenza nucleotide di legame plasmid (3'- CTTAAGTAGTTTAACGAATTCGAG-5') alla sua fine.
  12. Impostare una reazione PCR da 20 L in un tubo PCR a parete sottile aggiungendo i reagenti elencati nella Tabella 1.
  13. Trasferire il tubo su un ciclore termico ed eseguire la PCR utilizzando un programma con una denitura iniziale a 98 gradi centigradi per 30 s, 30 cicli di [15 s a 98 s, 15 s a 60 gradi centigradi e 3 min a 72 gradi centigradi), estensione finale per 2 min a 72 gradi centigradi e tenere premuto a 4 gradi centigradi.
  14. Eseguire 5 l della reazione PCR su un gel di agarose dell'1% per confermare l'amplificazione di un prodotto PCR da 6 kb.
    NOT: Se non viene osservato alcun prodotto PCR, ottimizzare la condizione PCR in base alle istruzioni del produttore. Il protocollo può essere messo in pausa qui.
  15. Aggiungete 1 - L di DpnI alla reazione PCR e incubate per 1 h a 37 gradi centigradi
  16. Trasformare l'e. coli competente con 2 L di DpnI digerito reazione PCR e piastra su brodo lisonidale (LB)/Piastre Amp. Incubare per tutta la notte a 37 gradi centigradi.
  17. Inoculare 5 mL LB contenente 100 g/mL di ampicillina con una singola colonia. Incubare pernottamento a 37 gradi centigradi con agitazione a 200 giri/min.
    NOT: Si raccomanda di testare almeno 6 colonie.
  18. Fare congelare gli stock di 850 - L di ogni coltura overnight aggiungendo glicerolo ad una concentrazione finale del 15% alla coltura. Conservare a -80 gradi centigradi.
  19. Estrarre il DNA plasmide dalla coltura rimanente da 4 mL con il kit di estrazione del DNA di mini-prep.
  20. Confermare il corretto inserimento della sequenza di codifica del peptide mediante il sequenziamento del DNA utilizzando il primer terminale T7 (GCTAGTTATTGCTGCGG).

2. Generazione di una biblioteca BirA

NOT: La libreria mutazionale di BirA iniziale(Figura 1c, passaggio 1) viene creata dalla PCR soggetta a errori. Altri metodi per generare la libreria mutazionale BirA probabilmente funzioneranno pure.

  1. Synthesize i megaprimer mutanti con BirA-6xIl suo avanti (ATGAAGGATACACCGGCC) e invertire (TCAATGATGATGATGATGATGTTT) primers utilizzando 1 ng di pBAD-BirA-eCPX con la sequenza di peptide target (preparato e confermato nel passaggio 1.20) come modello e 35 cicli PCR con una temperatura di annealing di 60 gradi centigradi secondo le istruzioni del produttore.
  2. Eseguire 5 l della reazione di amplificazione su un gel di agarose dell'1% per verificare l'amplificazione di un prodotto PCR da 984 bp.
  3. Purificare il prodotto PCR dai restanti 45 gradi della reazione di amplificazione utilizzando un kit di purificazione PCR commerciale e utilizzare uno spettrofotometro per quantificare la resa del DNA.
    NOT: La purificazione da una singola reazione di amplificazione di 45 anni produce generalmente una resa sufficiente (>250 ng).
  4. Preparare la reazione del campione in un tubo PCR a parete sottile aggiungendo i reagenti elencati nella tabella 2.
  5. Trasferire la miscela di reazione in un ciclore termico ed eseguire la PCR con i megaprimer mutanti preparati al passo 2.3 utilizzando i seguenti parametri: 1 min a 95 s C e 25 cicli di 50 s a 95 s, 50 s a 60 e 12 min a 68 . Conservare la reazione a 4 gradi centigradi.
  6. Aggiungere 1 enzima di restrizione DpnI direttamente alla reazione di amplificazione e mescolare delicatamente.
  7. Abbassare la miscela di reazione e incubare per 2 h a 37 .
  8. Trasformare le cellule E. coli competenti T7 Express con 2 -L della reazione DpnI.
  9. Inoculare 100 mL di ampicillina di 100 g/mL con le cellule trasformate e incubare durante la notte a 37 sfacio a 200 rpm.
  10. Effettua scorte congelatori con 10 mL della coltura notturna in LB con il 15% di glicerolo e conserva a -80 gradi centigradi.

3. Selezione di batteri che esprimono peptide biomutato

NOT: Questa parte del protocollo riguarda il passaggio 2-5 della figura 1c. Si consiglia vivamente di utilizzare pBAD-BirA-eCPX-AP e pBAD-BirA-eCPX-AP (K10A) come controlli positivi e negativi.

  1. Inoculare 100 mL di LB contenente 1% di glucosio e 100 g/mL di ampicillina con 1 mL di libreria BirA e incubare durante la notte a 37 s.C con agitazione a 200 rpm.
  2. Inoculare 5 mL di LB contenente 1% di glucosio e 100 g/mL di ampicillina con 100 litri della cultura notturna.
  3. Incubare per 2 h e 30 min fino a quando la coltura raggiunge un OD600 di circa 0,5.
  4. Indurre eCPX e BirA espressione con 0.2% w/v L-arabnose, 100 Sopropyl -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) e 100M biotina e scuotere la coltura a 200 rpm per 1 h a 37 .
  5. Centrifugare la coltura per 10 min a 5.000 x g e rimuovere il supernatante.
  6. Risospendere le cellule in 1 mL del PBS ghiacciato e centrifugare a 5.000 x g per 5 min.
  7. Scartare il supernatante e risospendere nuovamente le cellule in 400 gradi di PBS ghiacciato e conservare le cellule sul ghiaccio.
  8. Rimuovere 10 celle risospese e conservarle sul ghiaccio in un tubo da 1,5 mL con l'etichetta "Input".
  9. Lavare 20 - L di perline magnetiche streptavidin in 1 mL di PBS ghiacciato e posizionare il tubo in un separatore di particelle magnetiche panca superiore prima di rimuovere con attenzione il supernatante.
  10. Risospendere le perle magnetiche di streptavidin a 20 gradi di PBS ghiacciato e trasferire a 390 - L di cellule risospese dal passo 3.8.
  11. Mescolare con filtrando delicatamente e poi incubando per 30 min a 4 gradi centigradi.
    NOT: Non vortice come questo può lamentele le cellule. L'aggregazione di perline è spesso osservata con un'alta abbondanza di batteri che mostrano un peptide biotinylato.
  12. Posizionare una colonna con sfere ferromagnetiche in un separatore di particelle magnetiche e lavare con 5 mL di PBS ghiacciato.
  13. Trasferire le celle e le perle magnetiche streptavidin alla colonna attaccata nel separatore.
  14. Una volta che il serbatoio della colonna è vuoto, aggiungere 500 l di PBS ghiacciato e ripetere fino a quando la colonna non è stata lavata con un volume totale di 5 mL di PBS ghiacciato.
  15. Rimuovere la colonna dal separatore e posizionarla in un tubo da 1,5 mL.
  16. Pipetta 1 mL del PBS ghiacciato sulla colonna ed eluire le cellule etichettate magneticamente applicando lo stantuffo fornito con la colonna.
  17. Trasferire il tubo da 1,5 mL su un separatore panca superiore e lavare la cella etichettata magneticamente con 1 mL di PBS ghiacciato.
  18. Resospendere delicatamente le celle etichettate magneticamente in 1 mL del PBS ghiacciato prima di rimuovere e conservare 10 - L della sospensione in un tubo da 1,5 mL etichettato "Output".
  19. Inoculare 100 mL di LB contenente 1% di glucosio e 100 g/mL di ampicillina con le cellule etichettate magneticamente e incubare durante la notte a 37 sfamicon a 200 giri/mm.
  20. Il giorno successivo, utilizzare 10 mL della coltura durante la notte per effettuare scorte congelatori con celle in LB con 15% glicerolo e conservare a -80 oC e 1 mL della coltura durante la notte per il prossimo ciclo di selezione, vale a dire, passo 3.2.
    NOT: Generalmente, 3-5 cicli di selezione sono raccomandati per l'arricchimento di batteri leganti streptavidin.

4. Quantificazione dell'arricchimento

NOT: La quantificazione dei batteri vivi nei campioni "input" e "output" viene eseguita dopo ogni round di selezione mediante placcatura di diluizioni seriali dei campioni e il successivo conteggio delle unità formanti colonia (CFU).

  1. Aggiungete 990 PBS ghiacciato all'ingresso (dal punto 3.8) e i campioni di uscita (dal punto 3.18) ed etichettate i tubi "Input 10-2"e "Output 10-2", rispettivamente.
  2. Effettuare diluizioni seriali di 10 volte dei campioni "Input 10-2"e "Output 10-2"in PBS ghiacciato fino a raggiungere una diluizione finale di 10-10 nel campione di input e 10-4 nel campione di output.
  3. Piastra 100 - L di campioni da "Input 10-6","Input 10-8", "Input 10-10", "Output 10-2", "Output 10-3"e "Output 10-4"su piastre LB/Amp e incubare per la notte a 37 gradi centigradi.
  4. Contare il numero di colonie sulle piastre con colonie chiaramente separate. Moltiplicare il conteggio delle colonie con il fattore di diluizione per ottenere il numero di concentrazioni batteriche/100 l.
  5. Calcolare il conteggio batterico totale nei campioni di input e output moltiplicando la concentrazione cellulare con il volume di input (400) e il volume di uscita (1 mL), e stimare l'arricchimento dividendo l'output con il numero di celle di input.
    NOT: Un significativo arricchimento dovrebbe essere visibile dopo 3-5 giri di selezione

5. Caratterizzazione della variante BirA selezionata

NOT: La caratterizzazione può essere eseguita dopo aver selezionato le varianti BirA dalla prima libreria BirA; tuttavia, le varianti BirA hanno generalmente una bassa attività verso il peptide. Pertanto, un ulteriore giro di mutazione e selezione può essere eseguito anche prima della caratterizzazione. Di solito, 10 cloni del round di selezione finale sono isolati per un'ulteriore caratterizzazione.

  1. Inoculare 5 mL LB contenente 100 g/mL di ampicillina con cloni selezionati dal round di selezione finale. Inoltre, inoculare 5 mL LB contenente 100 g/mL ampicillina con T7 Express lysY/Iq E. coli trasformato con pBAD-BirA-eCPX-AP, che sarà utilizzato come un controllo positivo per la macchia occidentale descritta di seguito.
  2. Incubare pernottamento a 37 gradi centigradi con agitazione a 200 giri/min.
  3. Fare congelare gli stock di 850 - L di ogni coltura overnight aggiungendo glicerolo ad una concentrazione finale del 15% alla coltura. Conservare a -80 gradi centigradi.
  4. Inoculare 5 mL di LB contenente 100 g/mL di ampicillina con 100 l di coltura notturna e incubare a 37 gradi centigradi con agitazione a 200 rpm per 2 h.
  5. Estrarre il DNA plasmide dalla coltura rimanente 4 mL con il kit di estrazione del DNA commercialmente mini-prep. Eseguire la sequenza del DNA in avanti e in senso inverso delle varianti BirA con pBAD (ATGCCATAGCATTTCTCC) e pTrcHis rev (CTTCTGCGTTCTGATTTACTCTG) primer.
  6. Aggiungete lo 0,2% w/v L-arabinose e 100 IPTG e 100 biotine M alle colture del punto 5.4 e scuotete la coltura a 200 giri per 1 h a 37 gradi per indurre l'espressione delle varianti eCPX e BirA.
  7. Trasferire 65 l della coltura a tubi da 1,5 mL contenenti 25 l del buffer di carico del campione e 10 l dell'agente di riduzione.
  8. Incubare a 95 gradi centigradi per 5 min.
  9. Caricare il campione (compreso il controllo positivo) su un gel 12% SDS-polyacrilmide insieme a un marcatore di dimensione ed eseguire l'elettroforesi gel a 200 V per circa 45 min fino a quando le bande standard 20, 25 e 37 kDa sono chiaramente separate.
  10. Rilasciare il gel dalla cassetta e assemblare il panino per il gonfio del gel su una membrana PVDF.
  11. Elettroblot a 35 V per 2 ore sul ghiaccio.
  12. Rimuovere la membrana PVDF e incubare nel buffer di blocco [PBS, 0.05% Tween-20, 3% Skim Milk Powder] per 1 h a temperatura ambiente con agitazione.
  13. Preparare la soluzione di rilevamento della biotina diluindo streptavidin-HRP 1:1,000 in PBST.
    NOT: Il buffer di blocco contiene biotina e pertanto non deve essere utilizzato come buffer di diluizione per streptavidin-HRP.
  14. Scartare il buffer di blocco, lavare rapidamente la membrana in PBST [PBS, 0,05% Tween-20] e aggiungere la soluzione di rilevamento della biotina. Incubare per 1 h a temperatura ambiente con agitazione.
  15. Scartare la soluzione di rilevamento della biotina e lavare accuratamente la membrana in PBST per 5 min due volte e 10 min una volta con agitazione delicata a temperatura ambiente.
  16. Scartare il PBST, aggiungere 2 mL ECL mix e incubare per 1 min con agitazione.
  17. Asciugare rapidamente la membrana su una carta velina e sviluppare l'immagine su una pellicola a raggi X o in un sistema di imaging gel digitale.
    NOT: Nella corsia carica di controllo positivo, due distinte bande di reazione allo streptavidin dovrebbero essere chiaramente visibili: una proteina biotinylata da 30 kDa e la banda di 22 kDa eCXP-AP. Se le 10 colonie selezionate possono biotinyare il peptide visualizzato, una banda di 22 kDa dovrebbe essere visibile. L'intensità di queste bande è generalmente inferiore al controllo positivo e può, pertanto, richiedere tempi di esposizione più lunghi.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La macchia occidentale di batteri che esprimono pBAD-BirA-eCPX-AP produce una banda che recita la streptavidina da 22 kDa coerente con il peso molecolare di eCPX (Figura 2a). A differenza di BirA-6xHis, eCPX-AP biotinylata era presente sia in colture non indotte che indotte (Figura 2a) a causa di un piccolo grado di attività promotrice di T7 anche in culture non indotte e successiva biotinylazione dell'AP da parte di BirA endoge...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Come per tutti i metodi di selezione, la severità delle fasi di lavaggio è della massima importanza. Poiché i batteri non hanno bisogno di essere eluiti dalle perline prima dell'amplificazione dei cloni selezionati, l'alta affinità di legame tra biotina e streptavidina può essere utilizzata invece di utilizzare avidini di affinità inferiore, come precedentemente fatto con il sistema di visualizzazione dei faghi, per la selezione delle varianti BirA7,8. Ciò garant...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori ringraziano Mohamed Abdullahi Ahmed per l'assistenza tecnica esperta. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Fondazione Lundbeck, della Novo Nordisk Foundation, dell'Associazione danese dei reni, della Fondazione Aase og Ejnar Danielsen, della Fondazione A.P. M'ller per l'avanzamento della scienza medica e di Knud e Edith Eriksen Fondazione Memoriale.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10% prefabbricato poliacrilammide gelBio-Rad4561033
AmpicilinaSigma-AldrichA1593
ApE - Un editor di plasmidi v2.0NANAscaricato da http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/
ArabinosioSigma-AldrichA3256
BiotinaSigma-AldrichB4501
DMSOSigma-AldrichD2650
DPBS (10x), senza calcio, senza magnesioThermoFischer Scientific14200083
enzima di restrizione DpnINew England BioLabsR0176
Dynabeads MyOne Streptavidin C1ThermoFischer Scientific65001
GenElute Plasmid Miniprep KitSigma-AldrichPLN350
GeneMorph II Kit di mutagensis del dominio EZCloneAgilent Technologies200552
glucosioSigma-AldrichG8270
gliceroloSigma-AldrichG5516
membrana PVDF Immobilon-PMilliporeIPVH15150
IPTGSigma-AldrichI6758
LS ColonneMiltenyi Biotec130-042-401
NaClSigma-AldrichS7653
NEB 5-alfa Competente E. coliNew England BioLabsC2987
NuPAGE LDS Tampone per campioni (4x)ThermoFischer ScientificNP0007
NuPAGE Agente riducente per campioni (10x)ThermoFischer ScientificNP0009
pBAD-BirA-eCPX-APAddgene121907Utilizzato un modello e un controllo positivo
pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A)Addgene121908controllo negativo
Q5 DNA polimerasi ad alta fedeltàNew England BioLabsM0491Per l'inserimento della sequenza peptidica in pBAD-BirA-eCPX-AP, qualsiasi polimerasi ad alta fedeltà farà
QuadroMACS SeparatoreMiltenyi Biotec130-090-976
Latte scremato PolvereSigma-Aldrich70166
Streptavidina-HRPTecnologie AgilentP0397
T7 Express lysY/IQ Competente E. coliNew England BioLabsC3013
TriptoneMilliporeT9410
Tween-20Sigma-AldrichP9416
Western Lightning Plus-ECLPerkinElmerNEL103001EA
Estratto di lievitoSigma-AldrichY1625

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Polyak, S. W., Abell, A. D., Wilce, M. C. J., Zhang, L., Booker, G. W. Structure, function and selective inhibition of bacterial acetyl-CoA carboxylase. Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 983-992 (2011).
  2. Schatz, P. J. Use of Peptide Libraries to Map the Substrate Specificity of a Peptide-Modifying Enzyme: A 13 Residue Consensus Peptide Specifies Biotinylation in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).
  3. de Boer, E., Rodriguez, P., et al. Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (13), 7480-7485 (2003).
  4. Tannous, B. A., Grimm, J., Perry, K. F., Chen, J. W., Weissleder, R., Breakefield, X. O. Metabolic biotinylation of cell surface receptors for in vivo imaging. Nature Methods. 3 (5), 391-396 (2006).
  5. Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (21), 7583-7588 (2005).
  6. Michael Green, N. Avidin and streptavidin. Avidin-Biotin Technology. 184, 51-67 (1990).
  7. Fujita, S., Taki, T., Taira, K. Selection of an Active Enzyme by Phage Display on the Basis of the Enzyme's Catalytic Activity in vivo. ChemBioChem. 6 (2), 315-321 (2005).
  8. Iwamoto, M., Taki, T., Fujita, S. Selection of a biotin protein ligase by phage display using a combination of in vitro selection and in vivo enzymatic activity. Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 230-234 (2009).
  9. Granhøj, J., Dimke, H., Svenningsen, P. A bacterial display system for effective selection of protein-biotin ligase BirA variants with novel peptide specificity. Scientific Reports. 9 (1), 4118(2019).
  10. Rice, J. J. Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands. Protein Science. 15 (4), 825-836 (2006).
  11. Rice, J. J., Daugherty, P. S. Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides. Protein Engineering Design and Selection. 21 (7), 435-442 (2008).
  12. Stothard, P. The sequence manipulation suite: JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences. BioTechniques. 28, 1102-1104 (2000).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Varianti di BirASelezione per biotinilazioneSelezione con streptavidinaLibreria plasmidicaAmplificazione PCRAnalisi Western BlotMicrosfere magnetiche di streptavidinaConteggio delle colonieStock in congelatore

Articoli correlati