Il protocollo descrive la coltivazione di biofilm tra regni costituiti da albicani Candida e Streptococcus mutans e presenta un metodo confocale basato sulla microscopia per il monitoraggio del pH extracellulare all'interno di questi biofilm.
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Articolo metodologico
Monitoraggio del pH extracellulare nei biofilm tra regni incrociati utilizzando la microscopia Confocal
In questo articolo
Sommario
Abstract
I biofilm tra regni composti da cellule fungine e batteriche sono coinvolti in una varietà di malattie orali, come infezioni endodontiche, parodontite, infezioni mucosali e, in particolare, carie della prima infanzia. In tutte queste condizioni, il pH nella matrice del biofilm influisce sulle interazioni microbo-ospite e quindi sulla progressione della malattia. Il presente protocollo descrive un metodo confocale basato sulla microscopia per monitorare le dinamiche del pH all'interno di biofilm tra regni incrociati che comprendono albicani Candida e mutans Streptococcus. Lo spettro a doppia emissione dipendente dal pH e le proprietà di colorazione della sonda ratiometrica C-SNARF-4 sono sfruttati per determinare le gocce di pH nelle aree extracellulari dei biofilm. L'uso di pH ratiometry con la sonda richiede una scelta meticolosa di parametri di imaging, una calibrazione completa del colorante e un'attenta post-elaborazione basata sulla soglia dei dati dell'immagine. Se utilizzata correttamente, la tecnica consente la valutazione rapida del pH extracellulare in diverse aree di un biofilm e quindi il monitoraggio dei gradienti di pH orizzontali e verticali nel tempo. Mentre l'uso di limiti di microscopia confocale per biofilm sottili di 75 m o meno, l'uso di pH ratiometry è ideale per lo studio non invasivo di un importante fattore di virulenza nei biofilm cross-kingdom.
Introduzione
I biofilm tra regni incrociati che comprendono specie sia fungine che batteriche sono coinvolti in diverse condizioni patologiche nella cavità orale. Candida spp. sono stati spesso isolati da infezioni endodontiche1 e da lesioni parodontali2,3. Nelle infezioni mucosali, specie streptococcal del gruppo mitis hanno dimostrato di migliorare la formazione di biofilm fungini, l'invasione dei tessuti e la diffusione in entrambi i modelli in vitro e murini4,5,6,7<....
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Protocollo
Il protocollo per la raccolta della saliva è stato rivisto e approvato dal Comitato Etico della contea di Aarhus (M-20100032).
1. Coltivazione di Biofilm trasversali
- Crescere S. mutans DSM 20523 e C. albicans NCPF 3179 su piastre di agar di sangue a 37 gradi centigradi in condizioni aerobiche.
- Trasferire colonie singole di ogni organismo a provette piene di 5 mL di infusione del cuore cerebrale (BHI). Coltivare per 18 h in condizioni aerobiche a 37 gradi centigradi.
- Centrifugare le colture notturne a 1.200 x g per 5 min. Scartare il supernatante, sospendere nuovamente le cellule in sa....
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Risultati
Dopo 24 h e 48 h, robusti biofilm tra regni si sono sviluppati nelle piastre del pozzo. C. albicans ha mostrato vari gradi di crescita filamentosa, e S. mutans formavano ammassi densi fino a 35 m di altezza. Singole cellule e catene di S. mutans raggruppate intorno alle iphae fungine, e ampi spazi intercellulari indicavano la presenza di una matrice voluminosa (Figura S1).
La calibrazione del tintura ratiometrica produce una curva sigmoidale asimmetr.......
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Discussione
Diversi protocolli per la coltivazione di biofilm tra regni che coinvolgono C. albicans e Streptococcus spp. sono stati descritti in precedenza9,22,23,24,25. Tuttavia, l'attuale configurazione si concentra su condizioni di crescita semplici, un calendario compatibile con i normali giorni lavorativi, una composizione equilibrata delle.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Anette Aakjar Thomsen e Javier E. Garcia sono riconosciute per un eccellente supporto tecnico. Gli autori ringraziano Rubens Spin-Neto per fruttuose discussioni sull'analisi delle immagini.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastre di agar per sangue | Statens Serum Institut | 677 | |
| Infusione di cuore cerebrale | Oxoid | CM1135 | |
| Infusione di cuore cerebrale + 5 % di saccarosio | BDH forniture di laboratorio | 10274 | |
| Candida albicans | Collezione nazionale di funghi patogeni | NCPF 3179 | |
| D-(+)-Glucosio | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| daime: analisi digitale delle immagini in ecologia microbica | Universitä t Wien | N/A Freeware | ; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime |
| Dimetil solfossido | Life Technologies | D12345 | |
| Siero fetale bovino | Gibco Life technologies | 10270 | |
| GS-6R centrifuga refrigerata | Beckman | N/A | |
| ImageJ | National Institutes of Health | N/A | Freeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij |
| Java | Oracle | N/A | Freeware necessario per eseguire ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download |
| µ-Piastra 96 pozzetti Nero | Ibidi | 89626 | |
| MyCurveFit | MyAssays Ltd. | N/A | |
| 2-(N-morfolino)acido etansolfonico (MES) tampone | Bioworld | 700728 | |
| PHM210 pH-meter | Radiometro Piano analitico-Apocromatico | ||
| 63x obiettivo a immersione in olio | Zeiss | N/A | NA=1.4 |
| SNARF®-4F 5-(e-6)-Acido carbossilico | Life Technologies | S23920 | |
| Soluzione fisiologica sterile | VWR | 6404 | |
| Streptococcus mutans | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen | DSM 20523 | |
| Spettrofotometro di vis V-3000PC | VWR | N/A | |
| XL Incubatore | PeCON | N/A | |
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A |
Riferimenti
- Siqueira, J. F., Sen, B. H. Fungi in endodontic infections. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics. 97 (5), 632-641 (2004).
- Matic Petrovic, S., et al. Subgin....
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Ristampe e permessi
