Caratterizzazione degli effetti degli inibitori espastatici sull'invasione 3D dello spheroid del tumore mediante microscopia confocale ad alta risoluzione

Sommario

Gli effetti degli inibitori migrastatici sulla migrazione delle cellule tumorali del glioma nei saggi di invasione tridimensionale (3D) utilizzando un inibitore della deacetylasi istone (HDAC) sono caratterizzati da microscopia confocale ad alta risoluzione.

Abstract

La scoperta e lo sviluppo di farmaci nella ricerca sul cancro si basa sempre più su schermi di farmaci in formato 3D. Nuovi inibitori mirati al potenziale migratorio e invasivo delle cellule tumorali, e di conseguenza alla diffusione metastatica della malattia, vengono scoperti e considerati come trattamenti complementari in tumori altamente invasivi come i gliomi. Pertanto, è necessaria la generazione di dati che consentano analisi dettagliate delle cellule in un ambiente 3D dopo l'aggiunta di un farmaco. La metodologia qui descritta, che combina i saggi di invasione degli sferoidi con l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione e l'analisi dei dati mediante microscopia a scansione laser confocale (CLSM), ha permesso una caratterizzazione dettagliata degli effetti del potenziale inibitore anti-migranti MI-192 su cellule glioma. Gli spheroid sono stati generati dalle linee cellulari per i saggi di invasione in piastre aderenti di 96 pozze e poi preparati per l'analisi CLSM. Il flusso di lavoro descritto è stato preferito rispetto ad altre tecniche di generazione di sferoidi comunemente utilizzate a causa sia della facilità che della riproducibilità. Questo, combinato con la maggiore risoluzione dell'immagine ottenuta dalla microscopia confocale rispetto agli approcci convenzionali a campo largo, ha permesso l'identificazione e l'analisi di cambiamenti morfologici distinti nelle cellule migratorie in un ambiente 3D a seguito trattamento con il farmaco miestatico MI-192.

Introduzione

Le tecnologie di sferoide tridimensionali per la scoperta preclinica di farmaci e lo sviluppo di potenziali farmaci antitumorali sono sempre più favorite rispetto agli schermi di farmaci convenzionali; vi è quindi un maggiore sviluppo della droga migrastatica , migrazione e invasione. La logica alla base di questi sviluppi nel trattamento del cancro è chiara: i saggi sferoidi 3D rappresentano un approccio più realistico per lo screening di potenziali farmaci anti-cancro in quanto imitano l'architettura tumorale 3D più fedelmente rispetto alle colture di momostrato cellulare, ricapitolare le interazioni farmaco-tumore (cinetiche) in modo più accurato e consentire la caratterizzazione dell'attività farmacologica in un ambiente correlato al tumore. Inoltre, l'aumento della resistenza ai farmaci chemiotossici in molti tipi di cancro e alti tassi di mortalità tra i pazienti oncologici a causa di metastasi potenziati dalla capacità delle cellule tumorali di migrare verso siti tumorali distanti supporta l'inclusione di agenti chemioterapici mirare al potenziale migratorio delle cellule tumorali come trattamento adiuvante in futuri studi clinici sul cancro¹. Ciò è particolarmente vero nei tumori altamente invasivi, come i glioblastomi di alta qualità (GBM). La gestione GBM include chirurgia, radioterapia e chemioterapia. Tuttavia, anche con il trattamento combinato, la maggior parte dei pazienti recidiva entro 1 anno dalla diagnosi iniziale con una sopravvivenza mediana di 11-15 mesi^2,3. Negli ultimi anni sono stati compiuti enormi progressi nel campo della tecnologia 3D: sistemi rotativi, strutture microfabbricate e scaffold 3D, e altri saggi individuali vengono continuamente migliorati per consentire test di routine su larga scala^{4, 5,6,7}. Tuttavia, i risultati ottenuti da questi saggi devono essere analizzati in modo significativo perché l'interpretazione dei dati è spesso ostacolata dai tentativi di analizzare i dati generati in 3D con sistemi di analisi delle immagini 2D.

Nonostante sia preferibile in termini di velocità di acquisizione delle immagini e ridotta foto-tossicità, la maggior parte dei sistemi sul campo aperto rimane limitata dalla risoluzione⁸. Così, a parte le letture dei dati relative all'efficacia dei farmaci, gli effetti dettagliati dell'azione farmacologica sulle strutture cellulari 3D delle cellule migratorie sono inevitabilmente persi se vengono immagini utilizzando un sistema a campo largo. Al contrario, la microscopia a scansione laser confocale (CLSM) cattura immagini di alta qualità sezionati otticamente che possono essere ricostruite e renderizzate in 3D dopo l'acquisizione utilizzando un software per computer. Pertanto, CLSM è facilmente applicabile all'imaging di strutture cellulari 3D complesse, consentendo così l'interrogatorio degli effetti degli inibitori anti-esmigrastati su strutture 3D e analisi approfondite dei meccanismi di migrazione cellulare. Ciò guiderà senza dubbio lo sviluppo futuro di farmaci migrastatici. Qui, viene descritto un flusso di lavoro combinato di generazione di sferoidi, trattamento farmacologico, protocollo di colorazione e caratterizzazione mediante microscopia confocale ad alta risoluzione.

Protocollo

1. Generazione di sferoidi cellulari

Giorno 1

1. Preparare il mezzo di coltura standard come richiesto dalla linea cellulare in esame.
2. Eseguire tutte le fasi associate alla coltura tissutale in una cappa di coltura tissutale utilizzando tecniche di manipolazione sterile.
3. Provare e contare le cellule tumorali. Utilizzare 20 mL di sospensione cellulare per piastra. Mantenere le sospensioni cellulari in tubi universali sterili chiaramente etichettati.
4. Aggiungere un numero predeterminato di celle a ogni pozzo. Sia il numero iniziale di cellule che la dimensione finale dello sferoide richiesto dipende dal tasso di proliferazione della linea cellulare in fase di studio.
   NOT: Per le linee cellulari glioma stabilite come U251 e KNS42^9,10, 5 x 10³ cellule/mL produrrà uno sferoide microscopicamente visibile (200 o 800 m) dopo 4 giorni di incubazione.
5. Risospendere le cellule in tubi universali con una leggera inversione per evitare l'agglomerazione delle cellule. Pipetta 200 L della sospensione cellulare in ogni pozzo di una piastra da 96 pozze. Se tutti i pozzi non sono necessari, si consiglia di aggiungere 200 -L di 1x PBS ad ogni pozzo vuoto per evitare l'evaporazione.
6. Incubare le cellule in un'incubatrice come di consueto a 37 .
   NOT: Linee cellulari come le linee cellulari del cancro del glioma formeranno sferoidi entro 24 h. Permetterà che l'architettura cellulare 3D si formi incubano lo sferoide per 72 h.

Giorno 2

7. Controllare le cellule mediante microscopia a campo luminoso dopo 24 h. A seconda della linea cellulare, le cellule potrebbero aver formato uno sferoide rilevabile nella parte inferiore del pozzo.
   NOT: Le linee cellulari del cancro del glioma stabilite formano facilmente sferoidi entro 24 h. Le linee cellulari del cancro al glioma derivate dal paziente possono richiedere fino a 1-2 settimane.

2. Assay invasione del collagene

Giorno 3

1. Mettere il collagene, il mezzo di coltura 5x, 1 M NaOH e un tubo da 20 mL sul ghiaccio.
2. Aggiungere con attenzione e lentamente 10,4 ml di collagene freddo in un tubo di coltura refrigerato. Evitare le bolle. Questa quantità di collagene è sufficiente per una piastra da 96 pozze. L'upscaling è possibile, ma si consiglia di preparare un tubo da 20 mL per piastra alla volta.
3. Aggiungere delicatamente 1,52 mL di mezzo di coltura 5x sterile a freddo. Evitare le bolle.
4. Poco prima dell'uso, aggiungere delicatamente 72 - L of cold sterile 1 M NaOH. Mantenere la soluzione sul ghiaccio.
5. Mescolare delicatamente pipettando. Evitare le bolle. Una miscelazione efficiente porta a un cambiamento di colore (dal rosso al rosso-arancione (pH 7.4) nel mezzo. Lasciare il composto sul ghiaccio fino all'uso.
6. Passo cruciale: Togliere 190 gradi l di supernatante dalla piastra 96-well preparata il giorno 1. Fare molta attenzione a non disturbare gli sferoidi che si sono formati nella parte inferiore del pozzo. Utilizzare la pipetta ad un angolo verso il lato, non il centro, del pozzo.
7. Aggiungere delicatamente 100 l del mix di collagene ad ogni pozzo. Per evitare qualsiasi disturbo sferoide, pipettare il mix lungo il lato del pozzo. Evitare le bolle. Conservare il mix di collagene rimanente nel tubo da 20 mL a temperatura ambiente per valutare la polimerizzazione.
8. Incubare la piastra nell'incubatrice per almeno 10 min per consentire al collagene di polimerizzare. Come linea guida, se il collagene rimasto è impostato, diventando semisolido e spugna-like, gli sferoidi sono pronti per essere trattati con inibitore.
9. Aggiungere i farmaci o gli inibitori a concentrazione 2x al mezzo di coltura. Aggiungere delicatamente il mezzo ad ogni pozzo (100 l per pozzo). Ancora una volta, pipette il mezzo lungo il lato del pozzo per evitare disturbi sferoidi.
10. Osservare e immaginare ogni sferoide con microscopia a campo luminoso a volte T : 0 h, 24 h, 48 h, e 72 h per valutare l'attività del farmaco. Quindi riportare la piastra all'incubatrice.
    NOT: A seconda del comportamento invasivo della linea cellulare, la migrazione lontano dal nucleo sferoide originale può essere osservata a partire da 24 h.

3. Preparazione di sferoidi incorporati di collagene e cellule migratorie per la microscopia confocale

1. Collocare la piastra in una cappa di coltura tissutale e rimuovere delicatamente il supernatante (200 o L). Ancora una volta, fare attenzione a non disturbare lo sferoide ed evitare di toccare il collagene, in quanto ciò potrebbe interferire con la spina di collagene.
2. Sostituire il supernatante con 100 L di 1x PBS. Ripetere questo passaggio 3x.
3. Rimuovere il lavaggio finale e sostituire con il 4% di formaldeide in 1x PBS (100 -L per pozzo).
   ATTENZIONE: La formaldeide è un potenziale cancerogeno. Maneggiare con cura in conformità con le linee guida per la salute e la sicurezza.
4. Mettere la piastra da 96 pozzetto su una panca da laboratorio, coprire con un foglio e lasciare per 24 ore a temperatura ambiente.
5. Rimuovere con attenzione la formaldeide e sostituirla con 1x PBS. Ripetere questo 1x lavaggio PBS 3x.
6. Preparare lo 0,1% Triton X-100 in 1x PBS. Rimuovere il lavaggio 1x PBS e sostituire con 100 gradi della soluzione Triton X-100. Incubare per 30 min a temperatura ambiente. Nel frattempo, preparare la soluzione di blocco con 1x PBS e 0.05% latte scremato in polvere e mescolare accuratamente.
7. Rimuovere Triton X-100 e lavare 3x con 1x PBS. Aggiungere 100 l di soluzione di blocco ad ogni pozzo e incubare per 15 min.
8. Diluire l'anticorpo primario richiesto nel buffer di blocco alla concentrazione predeterminata. Qui, utilizzare anticorpo di tubulina acetoso anti-topo (1:100).
9. Centrifugare la miscela di buffer anticorpo-blocco primario per 5 min a 15,682 x g. Rimuovere con cura la soluzione di blocco e aggiungere il super-atlente (25-50 l) ad ogni pozzo. Incubare al buio a temperatura ambiente per 1 h.
10. Rimuovere la soluzione anticorpale e lavare 3x con 1x PBS (100 gradi l per pozzo).
11. Diluire l'anticorpo secondario nel buffer di bloccaggio alla concentrazione raccomandata o predeterminata oltre a eventuali macchie fluorescenti aggiuntive. Qui, utilizzare 1:500 anti-mouse fluoroforo-488 anticorpo coniugato, phalloidin-594 (1:500) per la colorazione dell'atto, e la macchia di DNA (DAPI).
12. Ancora una volta, centrifugare la soluzione anticorpale secondaria per 5 min a 13.000 rpm.
13. Rimuovere la soluzione di blocco da ogni pozzo e aggiungere 25-50 l della miscela anticorpo/phalloidin/DAPI secondaria. Incubare al buio per 1,5 h a temperatura ambiente.
14. Rimuovere la soluzione di tintura anticorpale secondaria e lavare 3x con 1x PBS (100 per pozzo).
15. Sollevare con cura i singoli tappi di collagene per aspirazione con una pipetta di plastica (200 o L) al centro di uno scivolo in vetro chiaro di alta qualità.
16. Aggiungere una goccia di un montatore adatto alla spina di collagene, assicurando che la spina sia completamente coperta. Evitare le bolle.
17. Applicare coverldello dello spessore ottimale per l'obiettivo del microscopio che verrà utilizzato per l'imaging e consentire di impostare durante la notte. Conservare i vetrini a temperatura ambiente al buio.

4. Microscopia a fluorescenza

1. Cattura immagini fluorescenti utilizzando un microscopio confocale adatto.

Risultati

La tecnologia degli sferidi tridimensionali sta portando avanti la comprensione delle interazioni farmaco-tumorale perché è più rappresentativa dell'ambiente specifico per il cancro. La generazione di sferoidi può essere ottenuta in diversi modi; bassa aderenza sono state utilizzate piastre di 96 pozze in questo protocollo. Dopo aver testato diversi prodotti di diversi produttori, le piastre utilizzate qui sono state scelte perché hanno costantemente funzionato meglio in termini di produz...

Discussione

Viene descritto un nuovo modo per creare sferoidi delle cellule tumorali per l'identificazione dell'attività dei farmaci migrastatici utilizzando la microscopia confocale ad alta risoluzione. L'uso di piastre aderenti basse rispetto ad altre tecniche, come le gocce appese¹⁵, ha facilitato un mezzo di generazione di sferoidi riproducibili e uniformi da utilizzare nei saggi di migrazione e invasione del collagene. I punti critici in questo protocollo sono la rimozione del mezzo di crescita dalla pia...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Collagene I, coda di ratto, 100 mg	Corning	354236	per il test di invasione del glioma; questo è offerto da molti distributori/produttori e dovrà essere determinato sia per il tipo di test previsto che per le linee cellulari utilizzate. Per le linee cellulari di glioma, la coda di ratto al collagene di tipo 1 (ad es. Corning) è la scelta preferita. Il collagene deve essere conservato a 4 ° C, al buio, fino al momento del bisogno. Non è consigliabile mescolare collagene di lotti diversi in quanto ciò potrebbe influire sulla consistenza del collagene polimerizzato.
Vetrini coprioggetti	vari		vari per l'imaging al microscopio
Polvere DMEM	Sigma	D5648	necessaria a concentrazione 5x per soluzione di collagene per il test di invasione del glioma;   Questo può essere acquistato in polvere, composto in acqua bidistillata e, a seconda della composizione finale del substrato di crescita, completato con gli additivi necessari. La soluzione completa 5x deve essere filtrata attraverso un sistema di filtraggio a siringa (0,22 μ m) prima dell'uso.
Siero fetale di vitello	Sigma	F7524-500ML	necessario per la coltura cellulare di linee cellulari di glioma
Vetrini	vari	vari	per l'imaging al microscopio
DMEM ad alto glucosio	Gibco	41965062	necessario per la coltura cellulare di linee cellulari di glioma
Inibitore	Tocris	vari	vari - secondo il disegno sperimentale; gli inibitori possono essere acquistati da produttori come Selleckchem e Tocris. Questi produttori offrono una descrizione dettagliata delle caratteristiche dell'inibitore, collegamenti a riferimenti associati e suggerimenti sulle concentrazioni di lavoro. Come tutti gli inibitori, possono essere potenzialmente tossici e devono essere maneggiati secondo le linee guida per la salute e la sicurezza. Gli inibitori sono preparati come soluzioni madre come raccomandato dal produttore. Come esempio abbiamo utilizzato l'inibitore migrastatico MI-192 per dimostrare l'uso di tali inibitori. In questo modo abbiamo testato una serie di inibitori della migrazione con risultati comparabili.
Montante	vari	vari	per imaging microscopico
NaOH (1 M)	various	vari	NaOH possono essere acquistati alla molarità richiesta o preparati in forma solida. La soluzione preparata deve essere sterilizzata con filtro utilizzando un sistema di filtri a siringa. Un M NaOH è corrosivo e occorre prestare attenzione durante la preparazione della soluzione.
Paraformaldeide	vari	vari	per il fissaggio di sferoidi e cellule; compongono al 4%, attenzione pericolo per la salute, garantire che le norme di salute e sicurezza siano rispettate per la soluzione di collagene per il test
di invasione Pastettes (pipetta graduata, 3 mL)	vari	vari	per il test di invasione, rimozione della soluzione
PBS, sterile per coltura tissutale	Sigma	D1408-500ML	Necessario per la coltura cellulare di linee cellulari di glioma e lavaggi per la colorazione
Pen/strep (antibiotici)	Sigma	P4333	necessario per la coltura cellulare di linee cellulari di glioma
Anticorpo primario, anticorpo secondario, DAPI, falloidina	vari	vari ci	sono molti produttori per questi reagenti, per gli anticorpi secondari marcati consigliamo Alexa Fluor (Molecular Probes). Qui abbiamo usato per gli anticorpi primari l'anticorpo anti-tubulina acetilata di topo (1/100, Abcam). Per gli anticorpi secondari abbiamo utilizzato l'anticorpo coniugato Alexa Fluor 488 anti-topo 1/500, Molecular Probes. Per la colorazione nucleare abbiamo usato DAPI (molti produttori) e la colorazione di actina Phalloidin (molti produttori) entrambe utilizzate alla diluizione raccomandata di 1/500.
Bicarbonato di sodio	Sigma	S5761	necessario per la soluzione di collagene per il test di invasione del glioma a concentrazione 5x
Piruvato di sodio	Sigma	P5280	necessario per la soluzione di collagene per il test di invasione del glioma a concentrazione 5x
Tripsina	Sigma	T4049	per la tripsinizzazione
Piastre di attacco ultra basse	Sigma/Nunc	CLS7007-24EA	per il test di invasione del glioma; È necessaria una piastra a bassa aderenza, con piastre a 96 pozzetti preferite per consentire lo screening su larga scala dei composti in esame. In commercio sono disponibili diverse placche a bassa aderenza; Si consiglia di testare una varietà di piastre per una generazione ottimale di sferoidi. Nella nostra esperienza Costar Ultra Low Cluster con coperchio, fondo rotondo, funziona al meglio per la generazione di sferoidi da cellule tumorali di glioma in termini di formazione di sferoidi al 100% e riproducibilità. Queste piastre sono state utilizzate con successo anche per la generazione di gliomi sferoidi da materiale derivato da pazienti, cellule tumorali della vescica e dell'ovaio nel nostro laboratorio. Inoltre, in queste piastre possono essere utilizzate neurosfere staminali o progenitrici per facilitare la generazione di neurosfere-sferoidi standardizzate
Stripettes (pipette sierologiche, sterili, da 5 mL e 10 mL)	varie ad es. Costar	CLS4488-50; CLS4487-50	per la coltura dei tessuti e la preparazione del collagene
Vari multicanale (50 - 250 μ L) e pipette monocanale (10 μ L, 50 μ L, 200 μ L 1 mL)	vari	vari	per la manipolazione di cellule e sferoidi
Microscopia a campo largo	vari	varie	per l'osservazione della generazione di sferoidi e l'imaging degli sferoidi; qui le immagini a fluorescenza ad ampio campo sono state catturate utilizzando un sistema di imaging cellulare EVOS FL (Thermo Fisher Scientific)
Zeiss LSM 880 CLSM dotato di un obiettivo per olio Plan Apochromat 63x 1.4 NA	Citazione Zeiss dal produttore		confocali sono state catturate utilizzando un Laser LSM 880 CLSM equipaggiato con un obiettivo per olio Plan Apochromat 63x 1.4 NA. I laser a diodi da 405 nm, 458/488/514 nm argon multilinea e HeNe 594 nm sono stati utilizzati per eccitare rispettivamente la falloidina 594, Alexa Fluor 488 e DAPI. Per ogni immagine è stata catturata una singola sezione ottica rappresentativa, con tutte le impostazioni, sia pre che post-acquisizione dell'immagine, mantenute a scopo comparativo. Tutte le immagini sono state successivamente elaborate utilizzando il software di imaging Zen associato e Adobe Photoshop.

Le immagini