Viene presentato un protocollo per rilevare le cellule tumorali ovariche circolanti utilizzando un sistema di flusso fotoacustico su misura e nanoparticelle di solfuro di rame con cofano con clofatura di acido folico mirati.
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Articolo metodologico
Rilevamento del cancro ovarico utilizzando la citometria a flusso fotoacustico
In questo articolo
Sommario
Abstract
Molti studi suggeriscono che l'enumerazione delle cellule tumorali circolanti (CTC) può mostrare promessa come strumento prognostico per il cancro ovarico. Le strategie attuali per il rilevamento dei CTC includono la citometria di flusso, i dispositivi microfluidici e la reazione a catena della polimerasi in tempo reale (RT-PCR). Nonostante i recenti progressi, i metodi per la rilevazione delle metastasi del cancro ovarico precoce mancano ancora della sensibilità e della specificità necessarie per la traduzione clinica. Qui, viene presentato un nuovo metodo per la rilevazione di cellule tumorali circolanti ovariche da citometria a flusso fotoacustica (PAFC) utilizzando un sistema stampato tridimensionale personalizzato (3D), tra cui una camera di flusso e una pompa di siringhe. Questo metodo utilizza nanoparticelle di solfuro di rame con controllo acido folico (FA-CuS NP) per indirizzare le cellule tumorali ovariche SKOV-3 da PAFC. Questo lavoro dimostra l'affinità di questi agenti di contrasto per le cellule tumorali ovariche. I risultati mostrano la caratterizzazione NP, il rilevamento PAFC e l'assorbimento di NP mediante microscopia a fluorescenza, dimostrando così il potenziale di questo nuovo sistema per rilevare i CTC ovarici a concentrazioni fisiologicamente rilevanti.
Introduzione
Il cancro ovarico è una delle neoplasie ginecologiche più letali e ha provocato circa 184.800 decessi in tutto il mondo nel 20181. Studi multipli hanno dimostrato la correlazione tra la progressione del cancro ovarico (cioè la metastasi) e la presenza di CTC2,3,4. Il metodo più comune per il rilevamento e l'isolamento dei CTC utilizza il sistema Cellsearch, che si rivolge al recettore EpCam5. L'espressione EpCam, tuttavia, è downregolata nella transizione epiteliale a mesenchymic, che è stata implicata nella metastasi del cancro....
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Protocollo
1. Sintesi e funzionalizzazione delle nanoparticelle
NOTA: la sintesi degli NP FA-CuS si ottiene utilizzando un metodo di sintesi a un piatto adattato da un protocollo pubblicato in precedenza21.
AVVISO: Tutta la sintesi dovrebbe avvenire in una cappa di fumi chimici ventilata.
- Prima della sintesi, filtrare circa 300 mL di acqua deionizzata (DI) attraverso un filtro sterile di 0,2 m.
- Pulire un pallone rotondo in vetro da 250 mL con una soluzione detergente e risciacquare con acqua DI. Aggiungere 0,0134 g di CuCl2 in 100 mL di acqua DI per creare una soluzione da 1 mM.
- Aggiu....
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Risultati
La figura 1A mostra una tipica immagine TEM delle nanoparticelle sintetizzate. La dimensione media della nanoparticella tipica è di circa 8,6 nm e 2,5 nm. La misurazione delle nanoparticelle è stata eseguita in ImageJ. Sono state applicate funzioni di soglia e spartiacque per separare le particelle per la misurazione. I diametri orizzontali e verticali di ogni particella sono stati misurati perpendicolarmente l'uno all'altro e ulteriormente m.......
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Discussione
Questo protocollo è un metodo semplice per il rilevamento di TIC ovarici che utilizzano PAFC e un agente di contrasto CuS mirato. Sono stati esplorati molti metodi per il rilevamento di CTC ovarici, tra cui dispositivi microfluidici, RT-PCR e citometria del flusso di fluorescenza23,24,25. Questi variano in complessità, costi e precisione, limitando la loro efficacia in ambienti clinici. PAFC introduce diversi vantaggi rispetto a.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori vorrebbero riconoscere Madeleine Howell per il suo aiuto con la sintesi, Matthew Chest per il suo aiuto nella progettazione del sistema di flusso e Ethan Marschall per l'assistenza con SolidWorks.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,025% tripsina con EDTA | Corning | 25-053-CL | |
| 0,2 &; m 1.000 mL Unità di filtrazione sottovuoto | VWR | 10040-440 | Per filtrare grandi volumi di acqua deionizzata. |
| 0,2 µ m filtro per siringa sterile | VWR | 28145-477 | |
| Serbatoio | personalizzata | ||
| National Instruments | PXIe-5170R | 250 MS/s, 8 canali, 14 bit | |
| Alconox | Sigma-Aldrich | 242985-1.8KG | Detergente utilizzato per la pulizia della vetreria. |
| Filtri centrifughi Amicon Ultra-15 | Millipore | UFC903024 | |
| Filtri centrifughi Amicon Ultra-4 | Ematocitometro Millipore | UFC803024 | |
| Bright-Line | Hausser Scientific | 1492 | |
| Cloruro di rame (II) | ACROS ORGANICS | 206532500 | |
| Obiettivo di accoppiamento | Thorlabs | LMH-10x-532 | Accoppiare luce pulsata su fibra ottica. |
| Stadio di accoppiamento | Newport | F-91-C1-T | Stadio per l'accoppiamento della luce pulsata all'obiettivo. Contiene il bagno di pulizia digitale a ultrasuoni FP-1A e LMH-10x-532 |
| serie CPX Fisherbrand | Model CPX3800 | ||
| Software di acquisizione dati | National Instruments | NI LabVIEW 2017 (32-bit) | LabVIEW utilizzato per sincronizzare gli impulsi laser con l'acquisizione dei dati. |
| Software di elaborazione dati | Mathworks | Matlab R2016a | Ricostruzioni e grafici prodotti con il software Matlab. |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Fibra Mandrino | Newport | FPH-DJ | Utilizzato per trattenere la fibra nuda. |
| Accoppiatore in fibra | Newport | FP-1A | Tavolino a 3 assi per il posizionamento del mandrino in fibra e della fibra ottica al centro dell'obiettivo. |
| Acido folico | Sigma-Aldrich | F7876-10G | |
| Griglie TEM rivestite Formvar | Microscopia elettronica Scienze | FCF300-CU-SB | |
| Tubi Masterflex | Cole Parmer | EW-96420-14 | |
| McCoy's 5A Medium | ATCC | 30-2007 | |
| Norm-Ject 10 mL Siringhe | HENKE SASS WOLF | 4100-X00V0 | |
| Fibra ottica | Thorlabs | FG550LEC | Utilizzato per esporre il campione alla luce pulsata. |
| PBS | Alfa Aesar | J62036 | |
| Penicillina Streptomicina | GIBCO | 15140-122 | |
| Laser pulsato | RPMC Lasers Inc | Quantus-Q1D-1053 | Sorgente laser pulsata con specifiche 1053 nm, impulso 8 ns, 10 Hz massimo. |
| Pulsatore/Ricevitore | Olympus | 5077PR | Riceve, filtra e amplifica i segnali fotoacustici. Funziona con un guadagno di 59 dB. |
| Tubo capillare al quarzo | Strumento Sutter | QF150-75-10 | |
| RPMI Midum 1640 (1x) Senza acido folico | Gibco | 27016-021 | |
| Silicone | Momentive Performance Materials, Inc. | GE284 | |
| SKOV-3 Celle | ATCC | HTB-77 | |
| Bicarbonato di sodio | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Carbonato di sodio | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
| Perle di idrossido di sodio | BDH | BDH9292-500G | |
| Solfuro di sodio nonaidrato | Sigma-Aldrich | 431648-50G | |
| Pompe a siringa | New Era Pump Systems Inc | DUAL-1000 | |
| Texas Red-X-Succinimydl ester | Invitrogen | 1949071 | |
| Transducer | Olynmpus | V214-BB-RM | Rivelatore a ultrasuoni con frequenza centrale di 50 MHz e larghezza di banda frazionaria di -6 dB dell'82%. |
| Trypan Blue Solution 0,4% | Amresco | K940-100ML | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML | |
| Gel per ultrasuoni | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic 100 | Gel per ultrasuoni per l'accoppiamento del trasduttore |
Riferimenti
- Ferlay, J., et al. Estimating the global cancer incidence and mortality in 2018: GLOBOCAN sources and methods. International Journal of Cancer. 144 (8), 1941-1953 (2019).
- Zhang, X., et al.
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Ristampe e permessi
