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Articolo metodologico

Rilevamento del cancro ovarico utilizzando la citometria a flusso fotoacustico

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DOI:

10.3791/60279

⸱

17 gennaio 2020

 ,  , 
1School of Biological and Health Systems Engineering, Arizona State University

In questo articolo

Sommario

Viene presentato un protocollo per rilevare le cellule tumorali ovariche circolanti utilizzando un sistema di flusso fotoacustico su misura e nanoparticelle di solfuro di rame con cofano con clofatura di acido folico mirati.

Abstract

Molti studi suggeriscono che l'enumerazione delle cellule tumorali circolanti (CTC) può mostrare promessa come strumento prognostico per il cancro ovarico. Le strategie attuali per il rilevamento dei CTC includono la citometria di flusso, i dispositivi microfluidici e la reazione a catena della polimerasi in tempo reale (RT-PCR). Nonostante i recenti progressi, i metodi per la rilevazione delle metastasi del cancro ovarico precoce mancano ancora della sensibilità e della specificità necessarie per la traduzione clinica. Qui, viene presentato un nuovo metodo per la rilevazione di cellule tumorali circolanti ovariche da citometria a flusso fotoacustica (PAFC) utilizzando un sistema stampato tridimensionale personalizzato (3D), tra cui una camera di flusso e una pompa di siringhe. Questo metodo utilizza nanoparticelle di solfuro di rame con controllo acido folico (FA-CuS NP) per indirizzare le cellule tumorali ovariche SKOV-3 da PAFC. Questo lavoro dimostra l'affinità di questi agenti di contrasto per le cellule tumorali ovariche. I risultati mostrano la caratterizzazione NP, il rilevamento PAFC e l'assorbimento di NP mediante microscopia a fluorescenza, dimostrando così il potenziale di questo nuovo sistema per rilevare i CTC ovarici a concentrazioni fisiologicamente rilevanti.

Introduzione

Il cancro ovarico è una delle neoplasie ginecologiche più letali e ha provocato circa 184.800 decessi in tutto il mondo nel 20181. Studi multipli hanno dimostrato la correlazione tra la progressione del cancro ovarico (cioè la metastasi) e la presenza di CTC2,3,4. Il metodo più comune per il rilevamento e l'isolamento dei CTC utilizza il sistema Cellsearch, che si rivolge al recettore EpCam5. L'espressione EpCam, tuttavia, è downregolata nella transizione epiteliale a mesenchymic, che è stata implicata nella metastasi del cancro6. Nonostante i progressi compiuti, le attuali tecnologie cliniche soffrono ancora di bassa precisione, costi elevati e complessità. A causa di questi inconvenienti, le nuove tecnologie per la scoperta e l'enumerazione dei CTC ovarici sono diventate un'area importante per la ricerca.

Recentemente, il PAFC è emerso come un metodo efficace per la rilevazione non invasiva delle cellule tumorali, l'analisi dei nanomateriali e l'identificazione dei batteri7,8,9. IL PAFC differisce dalla tradizionale citometria del flusso di fluorescenza rilevando gli analiti nel flusso utilizzando la fotoacustica. L'effetto fotoacustico viene generato quando la luce laser viene assorbita da un materiale che causa l'espansione termoelastica, producendo un'onda acustica che può essere rilevata da un trasduttore ad ultrasuoni10,11. I vantaggi del PAFC rispetto ai metodi tradizionali di citometria di flusso includono semplicità, facilità di traduzione in ambienti clinici e il rilevamento di CTC a profondità senza precedenti nei campioni dei pazienti12,13. Recenti studi hanno utilizzato sistemi PAFC per il rilevamento delle cellule utilizzando contrasto endogeno ed esogeno14,15. Gli agenti di contrasto ad assorbimento della luce vicino all'infrarosso (NIR) come il colorante verde indocianina e gli NP metallici (ad esempio oro e CuS) sono stati utilizzati per l'etichettatura selettiva di cellule e tessuti in combinazione con l'imaging fotoacustico16,17,18. A causa della migliore profondità di penetrazione della luce NIR all'interno dei tessuti biologici, il rilevamento fotoacustico degli assorbitori può essere eseguito a maggiori profondità per le applicazioni cliniche. A causa del suo grande potenziale di utilizzo nella clinica, la combinazione di agenti di contrasto NIR mirati con PAFC ha generato un notevole interesse per il rilevamento dei CTC.

IL PAFC in combinazione con agenti a contrasto mirati fornisce un approccio migliorato per l'analisi ad alta velocità dei campioni dei pazienti con maggiore precisione e rilevamento mirato dei CTC. Una delle principali strategie di rilevamento per i CTC è il targeting specifico delle proteine della membrana presenti sulla cellula di interesse. Una caratteristica notevole dei CTC ovarici è la sovraespressione dei recettori del folato situati sulla loro membrana esterna19. Il targeting del recettore del folato è una strategia ideale per l'identificazione dei CTC ovarici nel sangue perché le cellule endogene, che hanno una maggiore espressione dei recettori degli acidi folichi, sono generalmente luminose e hanno un'esposizione limitata al flusso sanguigno20. Gli NP di solfuro di rame (CUS NP) sono stati recentemente riconosciuti per la loro capacità di indirizzare i recettori del folato espressi sulle cellule cancerose21. In combinazione con la loro biocompatibilità, facilità di sintesi e assorbimento in profondità nella NIR, questi agenti di contrasto NP fanno una strategia di targeting ideale per il rilevamento di TIC ovarici che utilizzano il PAFC.

Questo lavoro descrive la preparazione degli NP FA-CuS e il loro utilizzo per il rilevamento delle cellule tumorali ovariche in un sistema di flusso fotoacustico. Gli NP CuS sono modificati con acido folico per indirizzare specificamente CTC ovarici ed emettono un segnale fotoacustico quando stimolati con un laser da 1.053 nm. I risultati indicano il successo del rilevamento di cellule tumorali ovariche incubate con questi agenti di contrasto fotoacustico all'interno del sistema PAFC. Questi risultati mostrano il rilevamento delle cellule tumorali ovariche fino a concentrazioni di 1 cellula/L, e la microscopia a fluorescenza conferma l'assorbimento di successo di queste particelle da parte delle cellule tumorali ovariche SKOV-322. Questo lavoro fornisce una descrizione dettagliata della sintesi degli NP FA-CuS, la preparazione di campioni per la microscopia a fluorescenza, la costruzione del sistema a flusso fotoacustico e il rilevamento fotoacustico delle cellule tumorali ovariche. Il metodo presentato mostra una corretta identificazione dei CTC ovarici nel flusso che utilizzano gli NP FA-CuS. Il lavoro futuro si concentrerà sull'applicazione clinica di questa tecnologia verso la diagnosi precoce delle metastasi del cancro ovarico.

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Protocollo

1. Sintesi e funzionalizzazione delle nanoparticelle

NOTA: la sintesi degli NP FA-CuS si ottiene utilizzando un metodo di sintesi a un piatto adattato da un protocollo pubblicato in precedenza21.
AVVISO: Tutta la sintesi dovrebbe avvenire in una cappa di fumi chimici ventilata.

  1. Prima della sintesi, filtrare circa 300 mL di acqua deionizzata (DI) attraverso un filtro sterile di 0,2 m.
  2. Pulire un pallone rotondo in vetro da 250 mL con una soluzione detergente e risciacquare con acqua DI. Aggiungere 0,0134 g di CuCl2 in 100 mL di acqua DI per creare una soluzione da 1 mM.
  3. Aggiungere 0,015 g di acido folico (FA) alla soluzione CuCl2 e mescolare per 5 min utilizzando una barra di stiring magnetico.
  4. Aggiungere Na2S-9H2O (0,024 g in 100 gradi l'acqua DI) su circa 10 s alla miscela di reazione utilizzando una pipetta da 200 ll.
    NOTA: Dopo l'aggiunta del Na2S-9H2O, la soluzione cambierà colore da un giallo chiaro a un marrone scuro.
  5. Anteporre la reazione e mettere in un bagno d'olio, impostare a 90 gradi centigradi, e continuare a mescolare con una barra di agitazione magnetica. Dopo circa 15 min, o quando il bagno d'olio ha raggiunto 85-90 gradi centigradi, permetterà alla reazione di procedere per un'ora supplementare. La miscela dovrebbe gradualmente trasformarsi in un colore verde scuro.
    NOTA: Assicurarsi di sfiatare il sistema durante il riscaldamento della miscela di reazione per evitare l'accumulo di pressione.
  6. Rimuovere il recipiente di reazione dal bagno d'olio e raffreddare brevemente a temperatura ambiente per circa 10-15 min prima di passare a un bagno di ghiaccio.
  7. Una volta che la miscela di reazione si è raffreddata al di sotto dei 20 gradi centigradi, regolare il pH a 10 utilizzando 1M NaOH per sciogliere l'acido folico rimanente in soluzione.
  8. Purificare la miscela di reazione FA-CuS utilizzando una colonna di centrifugazione 30 kDa. Aggiungere la soluzione in lotti da 15 mL alla colonna e centrifugare a 3.082 x g per 15 min.
  9. Una volta concentrata tutta la miscela di reazione, ricombinare le frazioni concentrate e lavare 4x con 15 mL di pH 10 NaOH nella colonna di centrifugazione 30 kDa.
  10. Per le misurazioni di massa, prendere 1/3 della soluzione (66 dollari l) e dividere in tre fiale di vetro. Asciugare in forno sottovuoto sotto vuoto di 27 mmHg.
  11. Sciogliere l'altro 2/3 della soluzione concentrata in 250 gradi di PBS e conservare a 4 gradi centigradi fino a un ulteriore utilizzo.
  12. Prima di utilizzare gli NP FA-CuS, sonoroarli per 30 minuti in un sonicatore da bagno su un ambiente elevato.

2. Caratterizzazione NP

  1. Eseguire la dispersione dinamica della luce (DLS) Aggiungere 10 -L di FA-CuS NPS concentrato in soluzione PBS dal punto 1.1.14 a 2 mL di acqua DI. Prima della caratterizzazione da parte delle DLS, sonicare le particelle per 30 minuti in un sonicatore da bagno su un'impostazione alta e filtrare attraverso un filtro sterile da 0,2 m per rimuovere la polvere residua.
  2. Eseguire la microscopia elettronica di trasmissione (TEM): Aggiungere 10 -L di FA-CuS NPS concentrato in soluzione PBS a un pezzo di carta cerata. Invertire una griglia di rame rivestita formvar sulla parte superiore della goccia e lasciare spalare per 2 min. Toccare il bordo della griglia rivestita di formvar per un pezzo di carta da filtro per rimuovere il liquido in eccesso. Lasciare asciugare l'aria. Immagine della griglia di rame che utilizza un microscopio elettronico ad una tensione accelerata di 80 kV.
    NOTA: i risultati tipici della caratterizzazione dei criteri di rete FA-CuS sono presentati nella Figura 1.

3. Cultura cellulare

  1. Questo protocollo utilizza le cellule SKOV-3. Se non diversamente specificato, colture cellule SKOV-3 nel medio 5A di McCoy integrato con 10% FBS, 100 U/mL penicillina, e 100 streptomicino di g/mL, e mantenere a 37 gradi centigradi in un umidito 5% CO2 incubatore.

4. Tagging fluorescente di FA-CuS NPS per la microscopia

  1. Aggiungere Texas-Red-X succinimidyl ester (0,2 mg sciolto in DMSO ad una concentrazione di 10 mg/mL) a una soluzione contenente 2 mg di NP FA-CuS in 1 mL di 0,1 M NaHCO3 (pH 9) tampone.
  2. Mescolare la miscela di reazione utilizzando una barra di agitazione magnetica per 1 h, lontano dalla luce a temperatura ambiente.
  3. Concentrare la miscela di reazione in una colonna di centrifugazione MWCO da 4 mL da 30 kDa mWCO ruotando a 4.000 x g per 10 min.
  4. Lavare la soluzione concentrata 3x con 4 mL di buffer NaHCO3 da 0,1 M (pH 9) in una colonna di centrifugazione. Successivamente, lavare la soluzione concentrata con 4 mL di acqua DI 3x o fino a quando solo una traccia di fluorescenza rimane visibile nel flusso attraverso UV-VIS.

5. FA-CuS NPS Assorbimento da cellule tumorali ovariche

  1. Prima dell'incubazione con gli NP FA-CuS, incubare le cellule SKOV-3 in un flacone T75 con 8-15 mL di mpMI-1640 senza acido folico con 10% FBS e 1% penicillina /streptomicina per almeno 24 h.
  2. Le cellule di semi in 0,5 mL di RPMI-1640 senza acido folico completano il supporto di crescita ad una densità di 0,1 x 106 cellule / mL in una piastra di 24 pozzetti.
  3. Il giorno seguente, incubare le cellule con 400 g/mL FA-CuS NPS in 0,5 mL di RPMI-1640 senza acido folico per 2 h.
  4. A seguito di questa incubazione, provare le cellule con 0.5 mL di 0.25% trypsin con EDTA. Aggiungere almeno 1 mL di RPMI-1640 senza acido folico per neutralizzare la prova e centrifugare le cellule a 123 x g per 6 min.
  5. Rimuovere il supernatante, riutilizzare le cellule in 2 mL di PBS e centrifugare a 123 x g per 6 min. Eseguire questo passaggio di lavaggio 2x per rimuovere eventuali NP non associati.
  6. Risospendere le cellule in 1-2 mL di PBS con soluzione 2% Tween.
  7. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e trypan blu. Diluire ulteriormente le cellule se i conteggi delle cellule sono troppo alti. Diluire le cellule in PBS con 2% Tween alla concentrazione scelta per il rilevamento.
  8. Le cellule sono ora pronte per essere analizzate dal sistema PAFC.

6. Microscopia a fluorescenza dell'assorbimento di FA-CuS NPS

  1. Ripetere i passaggi elencati nel passaggio 5.1 e procedere con il protocollo riportato di seguito per la microscopia.
  2. Le cellule di semi ad una densità di 0,1 x 106 cellule/mL in 0,5 mL di RPMI-1640 senza acido folico completa su vetro si ripercano in una piastra di 24 pozzetti.
  3. Il giorno seguente, incubare le cellule con TAG fluorescenti FA-CuS IN triplice, a concentrazioni di 100 g/mL, 200 g/mL, 300 g/mL e 400 g/mL in 0,5 mL di foglia di RPMI-1640 senza acido.
  4. Incubare le cellule con le NP per 2 h nell'incubatrice a 37
  5. Dopo questo periodo di incubazione, lavare le cellule 3x con PBS.
    NOTA: Per tutte le fasi di lavaggio, aggiungere con attenzione la soluzione sul lato della piastra del pozzo per non disturbare le cellule. Dopo l'aggiunta, inclinare con attenzione la piastra e ritirare la soluzione dal lato del pozzo.
  6. Incubare le cellule con 0,5 mL di 3,7% paraformaldeide (PFA) in PBS per 15 min e trasferire i coperchi di vetro in una nuova piastra di 24 pozzetti.
    PRUDENTE: PFA è un cancerogeno noto. Eseguire tutte le fissazioni in una cappa di fumi chimici ventilata e indossare adeguati dispositivi di protezione personale.
  7. Incubare le cellule in una soluzione del 3,7% di PFA con 0,1% Triton-X in PBS per 5 min.
  8. Lavare le celle con 0,5 mL di PBS 3x per 5 min ciascuna e trasferire i copricopertine in una nuova piastra.
  9. Incubare le cellule con 0,5 mL di una soluzione PBS contenente DAPI (20 l/mL di una soluzione di riserva di 0,5 mg/mL viene utilizzato per la colorazione) per 5 minuti, lontano dalla luce.
  10. Lavare le cellule con PBS 3x.
  11. Dopo il lavaggio PBS finale, montare i copricopre sui vetrini con supporto di montaggio.
  12. Le cellule sono ora pronte per essere immagini mediante microscopia a fluorescenza. La figura 2 mostra un esempio di caratterizzazione cellulare tipica mediante microscopia a fluorescenza.

7. Architettura del sistema di flusso

  1. Costruzione della camera di flusso
    NOTA:Un file SolidWorks di un serbatoio di flusso stampato in 3D è disponibile nei materiali supplementari.
    1. Utilizzando il file SolidWorks fornito, stampare in 3D il serbatoio di flusso utilizzando la termoplastica ABS o la plastica PLA. Le dimensioni sono fornite di seguito se SolidWorks non è disponibile. Figura 3A Mostra una rappresentazione di questo modello. Il corpo del serbatoio di flusso è 2,5 cm x 1,5 cm x 7,5 cm. Le estremità finali del serbatoio di flusso includono fori di circa 5 mm di diametro per consentire l'ingresso di tubi contenenti il tubo capillare.
      NOTA: Il serbatoio di flusso ha un foro di 1 cm, perpendicolare all'orientamento del tubo capillare, per il posizionamento del trasduttore ad ultrasuoni. Un'estrusione cilindrica con lo stesso diametro interno del foro si estende per 6 mm nel serbatoio. Per l'imaging in tempo reale, il serbatoio di flusso ha uno slot da 1 mm x 3 mm direttamente sotto il tubo capillare.
    2. Dopo aver stampato il serbatoio di flusso 3D, pulire e assemblare il sistema per l'uso.
    3. Posizionare le coperture in vetro sopra lo slot di 1 mm x 3 mm e il foro di 1 cm nel sistema di flusso.
    4. Sigillare con attenzione con silicone per evitare perdite.
    5. Montare il tubo capillare nei tubi curati in silicone. Inserire i tubi nella camera di flusso attraverso il lato del serbatoio di flusso in modo che il tubo capillare di vetro è direttamente sopra e davanti allo slot 3 mm e il foro di 1 cm.
    6. Sigillare i tubi con silicone per evitare perdite.
  2. Configurazione del sistema di flusso fotoacustico
    NOTA: figura 3B e Figura 3C mostrano un esempio dell'architettura del sistema di flusso.
    1. Collegare il trasduttore a un pulsatore/ricevitore a ultrasuoni. Amplifica il segnale con un guadagno di 59 dB.
    2. Collegare l'output del filtro a un oscilloscopio riconfigurabile multiuso dotato di un array di cancelli programmabili da campo integrato.
    3. Collegare uno dei tubi provenienti dalla camera di flusso ad una giunzione a T, collegata a due pompe di siringhe ad ogni ramo.
    4. Riempire una delle pompe di siringhe con aria e l'altra pompa con il campione da analizzare. Impostare la pompa contenente aria su una portata di 40 l/min e la pompa contenente il campione fino a una portata di 20 l/min. Il flusso in due fasi risultante produrrà volumi campione di 1 L. A questa portata, il sistema testerà circa 6,4 campioni al minuto.
      NOTA: Per mantenere una distribuzione coerente delle cellule, vorticare leggermente ogni campione immediatamente prima di essere testato. Inoltre, ruotare la siringa ogni pochi minuti per evitare che le cellule si stabiliscano nella soluzione.
    5. Collegare il tubo rimanente in uscita dal sistema di flusso a un contenitore con 10% candeggina, per smaltire le cellule dopo l'uscita dal sistema di flusso.
      NOTA: prima di utilizzare il sistema di flusso, verificare la presenza di perdite, in quanto queste possono influire sul flusso. Le cellule devono essere contenute all'interno di un sistema chiuso per mantenere la sicurezza biologica durante la procedura.
    6. Il design del serbatoio stampato in 3D consente un allineamento coerente e ripetibile tra il trasduttore e la luce laser con una calibrazione minima. Se posizionato correttamente all'interno del serbatoio personalizzato, il tubo capillare al quarzo assicura che il trasduttore e il laser siano allineati direttamente.
    7. Posizionare la sezione del tubo capillare al quarzo in allineamento diretto con il trasduttore, nel campo visivo del microscopio, consentendo un attento posizionamento della fibra ottica sopra il campione in modo da illuminare l'intera larghezza del tubo.
    8. Irradiare il campione utilizzando una fibra ottica che incanala un laser a stato solido pompato a diodo che opera ad una lunghezza d'onda di 1.053 nm. L'incidente della luce laser sul campione e sul trasduttore utilizzato per misurare l'effetto fotoacustico non è stato focalizzato.
    9. L'energia dell'incidente laser sul campione è di circa 8 mJ e la velocità laser a 10 Hz è sufficiente per illuminare ogni campione più volte mentre passa attraverso il sistema.
    10. Posizionare il sistema di flusso su un microscopio invertito e assicurarsi che sia l'impulso laser che il percorso del campione siano visibili man mano che il campione passa attraverso il sistema di flusso. Registrare il flusso utilizzando una telecamera montata al microscopio.
    11. Registrare le acquisizioni di ultrasuoni utilizzando il software di acquisizione dei dati (vedere Tabella dei materiali). Attivare ultrasuoni e laser pulsato utilizzando l'FPGA. Utilizzare PBS con 2% Tween e GLI NP FA-CuS a una concentrazione di 100 g/mL in PBS 2% Tween, rispettivamente come controlli negativi e positivi.
    12. Utilizzando una telecamera montata al microscopio, registrare sia la cottura del laser che il passaggio dei campioni attraverso il sistema di flusso. Queste registrazioni saranno utilizzate per correlare il segnale acustico registrato dal trasduttore con la cottura del laser. Quando i campioni passano davanti alla cottura del laser, il segnale può quindi essere correlato al segnale fotoacustico risultante per l'analisi. Ad una velocità di campionamento di 10 Hz, il laser illuminerà ogni spina più volte.

8. Post-elaborazione

  1. Per ogni acquisizione del segnale, s(t), calcolare la trasformazione Hilbert, H[s(t)], al fine di creare un segnale analitico.
  2. Creare un involucro complesso, se(t), calcolando la grandezza figure-protocol-1 del segnale analitico, in modo tale da integrare l'involucro per misurare il segnale totale risultante da ogni acquisizione. Confrontare i segnali di ogni gruppo di test (ad esempio PBS, celle con tag, NP FA-CuS, sole cellule) utilizzando un test t nel software statistico R. I segnali fotoacustici grezzi e le loro trasformazioni di Hilbert sono presentati nella Figura 4.
  3. Per la ricostruzione dell'immagine, normalizzare l'inviluppo complesso in base al picco massimo dell'intera conduzione. Se si confronta una serie di condutture, normalizzare l'involucro complesso utilizzando il picco massimo dell'intera serie. Dopo la normalizzazione, converti ogni acquisizione in una serie di valori di pixel. Rappresenta ogni serie di valori di pixel come colonna nella ricostruzione dell'immagine. Le ricostruzioni rappresentative di PBS e dei segnali NP FA-CuS sono mostrate nella Figura 5, dove entrambe le immagini sono state normalizzate utilizzando il picco massimo in entrambe le esecuzioni.

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Risultati

La figura 1A mostra una tipica immagine TEM delle nanoparticelle sintetizzate. La dimensione media della nanoparticella tipica è di circa 8,6 nm e 2,5 nm. La misurazione delle nanoparticelle è stata eseguita in ImageJ. Sono state applicate funzioni di soglia e spartiacque per separare le particelle per la misurazione. I diametri orizzontali e verticali di ogni particella sono stati misurati perpendicolarmente l'uno all'altro e ulteriormente m...

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Discussione

Questo protocollo è un metodo semplice per il rilevamento di TIC ovarici che utilizzano PAFC e un agente di contrasto CuS mirato. Sono stati esplorati molti metodi per il rilevamento di CTC ovarici, tra cui dispositivi microfluidici, RT-PCR e citometria del flusso di fluorescenza23,24,25. Questi variano in complessità, costi e precisione, limitando la loro efficacia in ambienti clinici. PAFC introduce diversi vantaggi rispetto a...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori vorrebbero riconoscere Madeleine Howell per il suo aiuto con la sintesi, Matthew Chest per il suo aiuto nella progettazione del sistema di flusso e Ethan Marschall per l'assistenza con SolidWorks.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,025% tripsina con EDTACorning25-053-CL
0,2 &; m 1.000 mL Unità di filtrazione sottovuotoVWR10040-440Per filtrare grandi volumi di acqua deionizzata.
0,2 µ m filtro per siringa sterileVWR28145-477
Serbatoiopersonalizzata
National InstrumentsPXIe-5170R250 MS/s, 8 canali, 14 bit
AlconoxSigma-Aldrich242985-1.8KGDetergente utilizzato per la pulizia della vetreria.
Filtri centrifughi Amicon Ultra-15MilliporeUFC903024
Filtri centrifughi Amicon Ultra-4Ematocitometro MilliporeUFC803024
Bright-LineHausser Scientific1492
Cloruro di rame (II)ACROS ORGANICS206532500
Obiettivo di accoppiamentoThorlabsLMH-10x-532Accoppiare luce pulsata su fibra ottica.
Stadio di accoppiamentoNewportF-91-C1-TStadio per l'accoppiamento della luce pulsata all'obiettivo. Contiene il bagno di pulizia digitale a ultrasuoni FP-1A e LMH-10x-532
serie CPX FisherbrandModel CPX3800
Software di acquisizione datiNational InstrumentsNI LabVIEW 2017 (32-bit)LabVIEW utilizzato per sincronizzare gli impulsi laser con l'acquisizione dei dati.
Software di elaborazione datiMathworksMatlab R2016aRicostruzioni e grafici prodotti con il software Matlab.
FBSSigma-AldrichF2442-500ML
Fibra MandrinoNewportFPH-DJUtilizzato per trattenere la fibra nuda.
Accoppiatore in fibraNewportFP-1ATavolino a 3 assi per il posizionamento del mandrino in fibra e della fibra ottica al centro dell'obiettivo.
Acido folicoSigma-AldrichF7876-10G
Griglie TEM rivestite FormvarMicroscopia elettronica ScienzeFCF300-CU-SB
Tubi MasterflexCole ParmerEW-96420-14
McCoy's 5A MediumATCC30-2007
Norm-Ject 10 mL SiringheHENKE SASS WOLF4100-X00V0
Fibra otticaThorlabsFG550LECUtilizzato per esporre il campione alla luce pulsata.
PBSAlfa AesarJ62036
Penicillina StreptomicinaGIBCO15140-122
Laser pulsatoRPMC Lasers IncQuantus-Q1D-1053Sorgente laser pulsata con specifiche 1053 nm, impulso 8 ns, 10 Hz massimo.
Pulsatore/RicevitoreOlympus5077PRRiceve, filtra e amplifica i segnali fotoacustici. Funziona con un guadagno di 59 dB.
Tubo capillare al quarzoStrumento SutterQF150-75-10
RPMI Midum 1640 (1x) Senza acido folicoGibco27016-021
SiliconeMomentive Performance Materials, Inc.GE284
SKOV-3 CelleATCCHTB-77
Bicarbonato di sodioSigma-AldrichS5761
Carbonato di sodioSigma-AldrichS7795-500G
Perle di idrossido di sodioBDHBDH9292-500G
Solfuro di sodio nonaidratoSigma-Aldrich431648-50G
Pompe a siringaNew Era Pump Systems IncDUAL-1000
Texas Red-X-Succinimydl esterInvitrogen1949071
TransducerOlynmpusV214-BB-RMRivelatore a ultrasuoni con frequenza centrale di 50 MHz e larghezza di banda frazionaria di -6 dB dell'82%.
Trypan Blue Solution 0,4%AmrescoK940-100ML
Tween 20Sigma-AldrichP7949-100ML
Gel per ultrasuoniParker Laboratories Inc.Aquasonic 100Gel per ultrasuoni per l'accoppiamento del trasduttore
stampato in 3D Scheda di acquisizione

Riferimenti

  1. Ferlay, J., et al. Estimating the global cancer incidence and mortality in 2018: GLOBOCAN sources and methods. International Journal of Cancer. 144 (8), 1941-1953 (2019).
  2. Zhang, X., et al. Analysis of circulating tumor cells in ovarian cancer and their clinical value as a biomarker. Cellular Physiology and Biochemistry. 48 (5), 1983-1994 (2018).
  3. Zhou, Y., et al. Prognostic value of circulating tumor cells in ovarian cancer: a meta-analysis. PLoS One. 10 (6), e0130873(2015).
  4. Guo, Y. X., et al. Diagnostic value of HE4+ circulating tumor cells in patients with suspicious ovarian cancer. Oncotarget. 9 (7), 7522-7533 (2018).
  5. Lianidou, E., Hoon, D. 9 - Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA. Principles and Applications of Molecular Diagnostics. , 235-281 (2018).
  6. Gorges, T. M., et al. Circulating tumour cells escape from EpCAM-based detection due to epithelial-to-mesenchymal transition. BMC cancer. 12 (1), 178(2012).
  7. Galanzha, E., Zharov, V. Circulating tumor cell detection and capture by photoacoustic flow cytometry in vivo and ex vivo. Cancers. 5 (4), 1691-1738 (2013).
  8. Nedosekin, D. A., et al. In vivo noninvasive analysis of graphene nanomaterial pharmacokinetics using photoacoustic flow cytometry. Journal of Applied Toxicology. 37 (11), 1297-1304 (2017).
  9. Zharov, V. P., Galanzha, E. I., Kim, J., Khlebtsov, N. G., Tuchin, V. V. Photoacoustic flow cytometry: principle and application for real-time detection of circulating single nanoparticles, pathogens, and contrast dyes in vivo. Journal of Biomedical Optic. 12 (5), 1-14 (2007).
  10. Miranda, C., Sampath Kumar, S., Muthuswamy, J., Smith, B. S. Photoacoustic micropipette. Applied Physics Letters. 113 (26), 264103(2018).
  11. Miranda, C., Barkley, J., Smith, B. S. Intrauterine photoacoustic and ultrasound imaging probe. Journal of Biomedical Optics. 23 (4), 1-9 (2018).
  12. Galanzha, E. I., Zharov, V. P. Photoacoustic flow cytometry. Methods. 57 (3), 280-296 (2012).
  13. O'Brien, C. M., et al. Capture of circulating tumor cells using photoacoustic flowmetry and two phase flow. Journal of Biomedical Optics. 17 (6), 061221(2012).
  14. Cai, C., et al. Photoacoustic flow cytometry for single sickle cell detection in vitro and in vivo. Analytical Cellular Pathology. 2016, 11(2016).
  15. Galanzha, E. I., et al. In vivo magnetic enrichment, photoacoustic diagnosis, and photothermal purging of infected blood using multifunctional gold and magnetic nanoparticles. PLoS One. 7 (9), e45557(2012).
  16. Hannah, A., Luke, G., Wilson, K., Homan, K., Emelianov, S. Indocyanine green-loaded photoacoustic nanodroplets: dual contrast nanoconstructs for enhanced photoacoustic and ultrasound imaging. ACS Nano. 8 (1), 250-259 (2013).
  17. Kim, S. E., et al. Near-infrared plasmonic assemblies of gold nanoparticles with multimodal function for targeted cancer theragnosis. Scientific Reports. 7 (1), 17327(2017).
  18. Ku, G., et al. Copper sulfide nanoparticles as a new class of photoacoustic contrast agent for deep tissue imaging at 1064 nm. ACS Nano. 6 (8), 7489-7496 (2012).
  19. Parker, N., et al. Folate receptor expression in carcinomas and normal tissues determined by a quantitative radioligand binding assay. Analytical Biochemistry. 338 (2), 284-293 (2005).
  20. Cheung, A., et al. Targeting folate receptor alpha for cancer treatment. Oncotarget. 7 (32), 52553(2016).
  21. Zhou, M., Song, S., Zhao, J., Tian, M., Li, C. Theranostic CuS nanoparticles targeting folate receptors for PET image-guided photothermal therapy. Journal of Materials Chemistry B. 3 (46), 8939-8948 (2015).
  22. Lusk, J. F., et al. Photoacoustic Flow System for the Detection of Ovarian Circulating Tumor Cells Utilizing Copper Sulfide Nanoparticles. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (3), 1553-1560 (2019).
  23. Lee, M., et al. Predictive value of circulating tumor cells (CTCs) captured by microfluidic device in patients with epithelial ovarian cancer. Gynecologic Oncology. 145 (2), 361-365 (2017).
  24. Blassl, C., et al. Gene expression profiling of single circulating tumor cells in ovarian cancer-Establishment of a multi-marker gene panel. Molecular Oncology. 10 (7), 1030-1042 (2016).
  25. Lu, Y., et al. Isolation and characterization of living circulating tumor cells in patients by immunomagnetic negative enrichment coupled with flow cytometry. Cancer. 121 (17), 3036-3045 (2015).
  26. Bhattacharyya, K., Goldschmidt, B. S., Viator, J. A. Detection and capture of breast cancer cells with photoacoustic flow cytometry. Journal of Biomedical Optics. 21 (8), 087007(2016).
  27. Zharov, V. P., Galanzha, E. I., Shashkov, E. V., Khlebtsov, N. G., Tuchin, V. V. In vivo photoacoustic flow cytometry for monitoring of circulating single cancer cells and contrast agents. Optics Letters. 31 (24), 3623-3625 (2006).
  28. Galanzha, E. I., et al. In vivo liquid biopsy using Cytophone platform for photoacoustic detection of circulating tumor cells in patients with melanoma. Science Translational Medicine. 11 (496), eaat5857(2019).
  29. Cai, C., et al. In vivo photoacoustic flow cytometry for early malaria diagnosis. Cytometry Part A. 89 (6), 531-542 (2016).
  30. Galanzha, E. I., et al. In vivo magnetic enrichment and multiplex photoacoustic detection of circulating tumour cells. Nature Nanotechnology. 4 (12), 855(2009).

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