In questo studio è stata esaminata l'attività fagocitica dei macrofagi contro le cellule tumorali, in particolare le cellule carcinoma mammario dei topi da 4T1. Il modello di cocoltura a cellule vive è stato stabilito e osservato utilizzando una combinazione di microscopia a contrasto di interferenza fluorescente e differenziale. Questa valutazione è stata immaginata utilizzando un software di imaging per sviluppare video time-lapse multipunto.
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Articolo metodologico
Time-Lapse 2D Imaging dell'attività fagocitica in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures
In questo articolo
Sommario
Abstract
I macrofagi associati al tumore (TAM) sono stati identificati come una componente importante per la crescita del tumore, l'invasione, la metastasi e la resistenza alle terapie tumorali. Tuttavia, i macrofagi associati al tumore possono essere dannosi per il tumore a seconda del microambiente tumorale e possono alterare reversibilmente le loro caratteristiche fenotipiche antagonizzando l'attività citotossica delle cellule immunitarie o migliorando la risposta antitumorale. Le azioni molecolari dei macrofagi e le loro interazioni con le cellule tumorali (ad esempio, la fagocitosi) non sono state ampiamente studiate. Pertanto, l'interazione tra le cellule immunitarie (M1/M2-sottotipo TAM) e le cellule tumorali nel microambiente tumorale è ora al centro della ricerca sull'immunoterapia del cancro. Nel presente studio, è stato sviluppato un modello di cocultura di cellule vive di macrofagi M1 indotti e cellule carcinoma 4T1 mammaria indotta per valutare l'attività fagocitica dei macrofagi utilizzando una funzione video time-lapse utilizzando la microscopia di contrasto di fase, fluorescente e contrasto differenziale (DIC). Il metodo attuale può osservare e documentare l'imaging multipunto a cellule vive della fagocitosi. La fagocitosi di 4T1 cellule da macrofagi M1 può essere osservata utilizzando la microscopia fluorescente prima di colorare le cellule 4T1 con carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE). La pubblicazione attuale descrive come co-cocoltura macrofagi e cellule tumorali in un unico piatto di imaging, polarizzare i macrofagi M1 e registrare eventi multipunto di macrofagi che inghiottiscono le cellule 4T1 durante 13 h di cocultura.
Introduzione
I macrofagi sono la prima linea di difesa immunitaria e svolgono un ruolo nell'orchestrazione delle risposte immunitarie contro agenti patogeni e materiali estranei, comprese le cellule tumorali. Sono un fagocitato specializzato che distrugge e si sbarazza delle particelle indesiderate nel corpo. I macrofagi contribuiscono a funzioni difensive come lo sgombero di cellule e microrganismi apoptotici e il reclutamento di altre cellule immunitarie1. I macrofagi possono differenziarsi in due tipi diversi, i macrofagi M1 e M2, in risposta ai segnali ambientali2. I macrofagi polarizzati M1 (cioè i macrofagi attivati classicamen....
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Protocollo
NOTA: Le sezioni 1-6 descrivono il modello di cocultura delle cellule carcinoma mammario 4T1 e dei macrofagi di topo RAW 264.7. La sezione 7 descrive la valutazione time-lapse delle cellule 4T1 fagicitarie M1.
1. Coltivare cellule carcinoma mammario 4T1 e macrofagi di topo RAW 264.7
- Scongelare una fiala di criogenicamente conservato 4T1 e RAW 264.7 passaggio 6 celle con agitazione delicata in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi o la temperatura di crescita normale per le linee cellulari.
NOTA: Lo scongelamento deve essere fatto rapidamente, approssimativamente entro 2 min. Per evitare la contaminazione, rimuovere la fiala da....
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Risultati
Le immagini bidimensionali (2D) del modello di cocultura 4T1 del carcinoma mammario del topo mostrano che le cellule 4T1 sono inghiottite dai macrofagi M1 durante un periodo di 13 h. È importante garantire una completa polarizzazione dei macrofagi M1 eseguendo l'immunostaining. I risultati (Figura 1) mostrano che la concentrazione di 100 lipopolysaccharides (LPS) e 20 ng/mL IFN -b-polarizzato RAW 264.7 nello stato M1. L'etichettatura delle cellule mirate con un colorante fluorescente e l'abb.......
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Discussione
Il protocollo descritto richiede due passaggi: 1) cocultura di 4T1 cellule carcinoma mammario e macrofagi polarizzati M1, e 2) valutazione dell'attività fagocitica del macrofago utilizzando la microscopia time-lapse. La cocultura delle cellule vive è ampiamente utilizzata nella fagocitosi e nei saggi di migrazione. Il modello di cocoltura a cellule vive qui è un semplice, procedura in vitro adattabile (Figura 2) che utilizza un colore fluorescente, CFSE, che viene utilizzato per etichettare .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato finanziariamente da Geran Putra Berimpak (GBP), Universiti Putra Malaysia: 9542800. Ringraziamo i laboratori Agro-Biotechnology Institute, Malaysia (ABI) e la struttura di microscopia. Un ringraziamento speciale a Mohd Daniel Hazim per l'aiuto nell'editing e nella registrazione del video sperimentale per questo lavoro.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Anticorpo anti-INOS coniugato FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 µ g in 1 mL |
| di carbossifluoresceina succinimidil estere (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 mg |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindolo, Dicloridrato) | Invitrogen | D1306 | 10 mg |
| DMEM/alto glucosio | HyClone | SH30003.04 | 670.0 g |
| Siero fetale bovino | Tico Europe | FBSEU500 | 500 mL |
| Lipopolisaccaridi | Sigma | L4516-1MG | 1 mg |
| Interferone-gamma ricombinante di topo | Stemcell Technologies | 78021 | 100 µ g |
| Soluzione di penicillina-streptomicina | Cellgro | 30-003-CI | 100 mL |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | Confezione da 10 |
| Tripsina EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 mL |
| 1000 &; L puntali per pipette | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 puntali/confezione |
| 2 mL pipetta sierologica | JET BIOFIL | GSP012002 | Non piogenica |
| 200 &; L puntali per pipette | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20.000 tps/cassa |
| 25 cm2 pallone per colture cellulari | Corning | CLS430639 | Coltura tissutale trattata |
| Centrifuga da banco | Dynamica | FA15C | Modello: Velocity 14R |
| Cappa di sicurezza biologica | Nuaire | NU-565-400 | Modello: Home/ LabGard® ES TE NU-565 Classe II, Tipo B2 Cappa di biosicurezza Miscelatore |
| CO2/aria | Chamlide (Live Cell Instrument) | FC-R-20 | FC-5 (CO2/Miscelatore d'aria) con il flussometro |
| Raschiatore per celle | NEST | 710001 | 220 mm |
| Incubatore per celle CO2 | Panasonic | N/A | Modello: MCO-19M(UV) |
| Microscopio confocale | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Ti-Eclipse |
| Piatto inferiore in vetro | Ibidi | 81218-200 | 35 mm |
| NIS elements software | Nikon Instruments Inc. | Disponibile per il download | |
| Pipetta controller | CappAid | PA-100 | CappController, 0,1-100ml |
| Termostato | Shinko | Fuori produzione | JCS-33A 48 x 48 x 96,5mm |
Riferimenti
- Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. Image based Machine Learning for identification of macrophage subsets. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Mantovani, A., Sozzani, S., Locati, M., Allavena, P., Sica, A.
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Ristampe e permessi
