Questo protocollo è progettato per l'imaging e l'analisi delle dinamiche dell'orientamento cellulare e della crescita dei tessuti nell'epitelio addominale della Drosophila mentre la mosca della frutta subisce la metamorfosi. La metodologia qui descritta può essere applicata allo studio di diverse fasi di sviluppo, tessuti e strutture subcellulari nella Drosophila o in altri organismi modello.
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Articolo metodologico
Imaging e analisi dell'orientamento dei tessuti e delle dinamiche di crescita nell'epiteliale della Drosophila in via di sviluppo durante le fasi pupali
In questo articolo
Sommario
Abstract
All'interno di organismi multicellulari, tessuti e organi maturi mostrano alti gradi di ordine nelle disposizioni spaziali delle loro cellule costituenti. Un esempio notevole è dato da epiteli sensoriali, dove cellule della stessa identità o identità distinte sono riunite attraverso l'adesione delle cellule cellulari che mostra modelli planari altamente organizzati. Le celle si allineano l'una all'altra nella stessa direzione e mostrano polarità equivalente su grandi distanze. Questa organizzazione dell'epitelia matura è stabilita nel corso della morfogenesi. Per capire come si ottiene la disposizione planare dell'epitelio maturo, è fondamentale monitorare l'orientamento cellulare e le dinamiche di crescita con alta fedeltà spatiotemporale durante lo sviluppo in vivo. Strumenti analitici robusti sono inoltre essenziali per identificare e caratterizzare le transizioni da locale a globale. La pupa della Drosophila è un sistema ideale per valutare i cambiamenti di forma cellulare orientata alla base della morfogenesi epiteliale. L'epitelio pupali in via di sviluppo costituisce la superficie esterna del corpo immobile, consentendo l'imaging a lungo termine di animali intatti. Il protocollo qui descritto è progettato per immaginare e analizzare i comportamenti cellulari sia a livello globale che locale nell'epidermide addominale pupale man mano che cresce. La metodologia descritta può essere facilmente adattata all'imaging di comportamenti cellulari in altri stadi dello sviluppo, tessuti, strutture subcellulari o organismi modello.
Introduzione
Per ottenere i loro ruoli, i tessuti epiteliali si basano completamente sull'organizzazione spaziale dei loro componenti cellulari. Nella maggior parte degli epiteli, le cellule non solo sono imballate l'una contro l'altra per creare un preciso strato di ciottoli, ma si orientano rispetto agli assi del corpo.
L'importanza funzionale dell'organizzazione precisa dei tessuti è evidente negli epitelia sensoriali, come l'orecchio interno vertebrato e la retina. Nel primo caso, i capelli e le cellule di supporto si allineano in una direzione assiale specifica per rilevare in modo efficiente gli ingressi meccanici come il suono e il movimento
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Protocollo
NOTA: Questo protocollo è suddiviso in cinque fasi: (1) mettere in scena le pupe, (2) preparare le pupe per l'imaging, (3) l'imaging live della crescita dell'epitelio addominale in crescita, (4) generazione di mosaici genetici, (5) elaborazione e analisi dei dati (comprese le sezioni che descrivono come analizzare la dinamica dell'orientamento cellulare dai contorni di giunzione cellulare e dalla dinamica di crescita dei cloni cellulari).
1. Staging delle pupe di Drosophila prima dell'imaging
- Mosche di coltura del genotipo appropriato su supporto standard in fiale di plastica a 25 gradi centigradi per 5 giorni (12 h) dopo....
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Risultati
Il protocollo sopra descritto riguarda la preparazione delle pupe della Drosophila per l'imaging dal vivo a lungo termine e le procedure per l'analisi dell'orientamento cellulare e delle dinamiche di crescita dell'epidermide addominale. Applicando questa metodologia è possibile generare filmati ad alta risoluzione delle pupe in via di sviluppo per periodi fino a 48 h senza fotosbiancamento significativo o fototossicità. Istantanee che raffigurano l'epidermide addominale (ad esemp.......
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Discussione
L'ordine a lungo raggio è una caratteristica essenziale della maggior parte delle unità fisiologiche funzionali. Durante la morfogenesi, l'ordine si ottiene attraverso l'integrazione di istruzioni complesse implementate con alta precisione temporale e spaziale. I vincoli multipli e multilivello sono integrati in disposizioni tissutali stereotitipati.
Polarità e direzionalità sono fondamentali per una disposizione spaziale ordinata durante lo sviluppo. Polarità implica rottura di simmetria dura.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interessi.
Ringraziamenti
Ringraziamo i membri del laboratorio Martàn-Blanco per le discussioni utili. Ringraziamo anche Nic Tapon (The Crick Institute, Londra, Regno Unito), il Bloomington Stock Center (Università dell'Indiana, USA) e FlyBase (per l'annotazione genica Drosophila). Federica Mangione è stata sostenuta da una borsa di studio pre-dottorato JAE-CSIC. Il laboratorio di Martàn-Blanco è stato finanziato dalla Programa Estatal de Fomento de la Investigaciàn Cient-fica y Técnica de Excelencia (BFU2014-57019-P e BFU2017-82876-P) e dal Fundaciàn Ramàn Areces.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Software di | analisi-ImageJ | Analisi dei dati | |
| Drosophila | Atpa::GFP | - | Ceppi impiegati per la raccolta dei dati |
| Drosophila | hsflp1.22; FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls | - | Ceppi impiegati per la raccolta dei dati |
| Dumont 5 Pinze FST | 11251-20 | Diametro 1,5 mm per la dissezione | |
| Piastre inferiori in vetro | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Pupe di montaggio per la raccolta dei dati |
| Olio alocarbonico 27 | Sigma-Aldrich | 9002-83-9 | Pupe di montaggio |
| Microscopio confocale invertito | Zeiss | LSM700 | Raccolta dati |
| Stereomicroscopio | Leica | DFC365FX | Visualizzazione delle pupe durante la dissezione |
Riferimenti
- Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
- Deans, M. R. A balance of form and function: planar polarity and development of the vestibular maculae....
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Ristampe e permessi
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Epidermide pupale di DrosophilaAnalisi dell'orientamento tissutaleDinamica della crescita cellulareImaging mediante microscopia confocaleTecnica di ricombinazione mitoticaPlugin Orientation JAnalisi della polarità planareTracciamento dei cloni di istoblastiStudio della morfogenesi epitelialeProtocollo di imaging in vivo
