L'obiettivo di questo protocollo è quello di isolare i microvasi da più regioni del sistema nervoso centrale dei vertebrati lissencefalici e gyrencephalic.
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Articolo metodologico
Isolamento affidabile dei micronavi del sistema nervoso centrale in cinque gruppi di vertebrati
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'isolamento dei microvasi dal sistema nervoso centrale (CNS) è comunemente eseguito combinando tessuto corticale da più animali, il più delle volte roditori. Questo approccio limita l'interrogatorio delle proprietà della barriera emato-encefalica (BBB) alla corteccia e non consente il confronto individuale. Questo progetto si concentra sullo sviluppo di un metodo di isolamento che consente il confronto dell'unità neurovascolare (NVU) da più regioni del SNC: corteccia, cervelletto, lobo ottico, ipotalamo, ipofisi, tronco encefalico e midollo spinale. Inoltre, questo protocollo, originariamente sviluppato per i campioni di murini, è stato adattato con successo per l'uso su tessuti CNS da piccole e grandi specie di vertebrati da cui siamo anche in grado di isolare i microvasi dalla materia bianca dell'emisfero cerebrale. Questo metodo, se abbinato all'immunoetichettatura, consente la quantificazione dell'espressione proteica e il confronto statistico tra individui, tipo di tessuto o trattamento. Abbiamo dimostrato questa applicabilità valutando i cambiamenti nell'espressione delle proteine durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE), un modello murino di una malattia neuroinfiammatoria, la sclerosi multipla. Inoltre, i microvessels isolati con questo metodo potrebbero essere utilizzati per applicazioni a valle come qPCR, RNA-seq e macchia occidentale, tra gli altri. Anche se questo non è il primo tentativo di isolare le microvessels CNS senza l'uso di ultracentrifugazione o dissociazione enzimatica, è unico nella sua abilità per il confronto di singoli individui e più regioni del SNC. Pertanto, consente di scandire una serie di differenze che altrimenti potrebbero rimanere oscure: porzioni del SNC (corteccia, cervelletto, lobo ottico, tronco encefalico, ipotalamo, ipofisario e midollo spinale), tipo di tessuto CNS (materia grigia o bianca), individui, gruppi di trattamento sperimentale e specie.
Introduzione
Il nostro cervello è l'organo più importante del nostro corpo. Per questo motivo, mantenere l'omeostasi del cervello nonostante fattori esterni che possono innescare una deviazione dalla normalità è una priorità. Secondo alcuni studiosi, circa 400-500 milioni di anni fa1, gli animali vertebrati hanno sviluppato quella che oggi conosciamo come la barriera emato-encefalica (BBB)2,3. Questa "recinto" protettiva esercita la maggiore influenza sull'omeostasi del sistema nervoso centrale (CNS) e sulle funzioni regolando strettamente il trasporto di ioni, molecole e cellule tra sangue e parenc....
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Protocollo
Tutte le procedure del presente studio sono conformi alle linee guida stabilite dall'Università della California (UC), Davis Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). La cura degli animali all'UC Davis è regolata da diverse risorse indipendenti ed è stata pienamente accreditata dalla Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) dal 1966. I tessuti CNS porcino sono stati ottenuti dal Dipartimento UCD di Scienze Animali, Meat Sciences Laboratory. I tessuti del CNS dei macachi rhesus sono stati ottenuti dal California National Primate Research Center Pathology Department (NIH P51OD01107). Nessuna anestesia, euta....
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Risultati
I microvessels isolati dal SNC murino hanno mostrato tutti i componenti cellulari intrinseci dell'unità neurovascolare2,3. Utilizzando sia platelete endoteliale aderenazione delle cellule-1 (PECAM, noto anche come CD31) o isolettica IB4 (una glicoproteina che lega il glicocalyx cellule endotelialiali) per le cellule endoteliali, il fattore di crescita derivato dalle piastrine - (PDGFR) o l'antigene neurone-gliale 2 (NG2) per peric.......
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Discussione
Il BBB include le proprietà uniche delle cellule endoteliali di microvascolatura cerebrale accoppiate da una sofisticata architettura di stretto, aderenti-, "peg-socket" - giunzioni, e placche di adesione critiche per l'omeostasi CNS2,3,19. Le proprietà delle cellule endote sono indotte e mantenute dai periciti e dall'astroglia circostante i processi di fine piede2,3
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Dr. Cruz-Orengo è stato sostenuto dalla University of California, Davis, School of Veterinary Medicine Start Up Funds.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 10X PBS | ThermoFisher | BP39920 | Utilizzato per il blocco e il diluente anticorpale. |
| 20% PFA | Microscopia Elettronica | Scienze 15713-S | Utilizzato come fissativo (4% PFA) |
| 70.000 MW Destrano | Millipore Sigma | 9004-54-0 | Utilizzato per la soluzione MV-2 |
| Adson Forcipe | Fine Science Tools (FST) | 11006-12 | Utilizzato per la rimozione di muscoli e pelle |
| Pinza Adson, qualità per studenti | FST | 91106-12 | Come sopra ma più economico |
| Siero bovino albumina (BSA) | Millipore Sigma | A7906-100G | Utilizzato per la soluzione MV-3, il bloccante e il diluente anticorpale |
| Corning 100 μ m Filtro cellulare | Millipore Sigma | CLS431752-50EA | |
| Corning 70 μ m Filtro cellulare | Millipore Sigma | CLS431751-50EA | |
| Corning Deskwork punte a basso legame | Millipore Sigma | CLS4151 | Come di seguito ma più economico. |
| Cultrex Poli-D-lisina | R& D | 3439-100-01 | Utilizzato per il rivestimento scorrevole |
| Asino anti-capra IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21432 | Utilizzato come anticorpo secondario. Diluizione consigliata di 1:200. |
| Asino anti-Topo IgG-ALEXA 488 | Thermo | A21202 | Utilizzato come anticorpo secondario. Diluizione consigliata di 1:200. |
| Asino anti-Coniglio IgG-ALEXA 488 | Thermo | A21206 | Utilizzato come anticorpo secondario. Diluizione consigliata di 1:200. |
| Asino anti-coniglio IgG-ALEXA 647 | Thermo | A31573 | Utilizzato come anticorpo secondario. Diluizione consigliata di 1:200. |
| Asino anti-ratto IgG-DyLight 650 | Thermo | SA5-10029 | Utilizzato come anticorpo secondario. Diluizione consigliata di 1:200. |
| Plettro per tessuti a doppia punta | FST | 18067-11 | Utilizzato per la rimozione di meningi e plesso coroideo |
| Dumont #3c Pinza | FST | 11231-20 | Utilizzata per la manipolazione di tessuti del SNC più delicati e/o piccoli (come l'ipofisi) |
| Dumont #7 Pinze | FST | 11274-20 | Utilizzate per la dissezione e la manipolazione del tessuto del SNC |
| Dumont #7 Pinze, studente | FST | 91197-00 | Come sopra ma più economici |
| ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips | Eppendorf | 22493008 | Migliore qualità rispetto ai puntali sopra (più costosi). |
| Pinze Graefe extra fini, seghettate | FST | 11151-10 | Utilizzato per la rimozione dell'osso |
| Forbici fini, affilate | FST | 14060-09 | Utilizzato per la rimozione di sacchi durali di maiale e macaco |
| Pestello di vetro Omogeneizzatore per tritatessuti per microcentrifuga da 1,5 mL, confezione da 10 | Chang Bioscience Inc. (eBay) | GP1.5_10 | Utilizzato per piccoli ipotali e ipofisi. |
| Capra anti-CXCL12, biotinilato | PeproTech | 500-P87BGBT | Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC di tutti i campioni. Diluizione consigliata: 1:20. |
| Capra anti-JAM-B | R& D | AF1074 | Utilizzato come anticorpo primario per valutare la neuroinfiammazione. Concentrazione consigliata: 5 μ g/mL. |
| Capra anti-Topo IgG-ALEXA 488 | Thermo | A11001 | Utilizzato come anticorpo secondario. Diluizione consigliata di 1:200. |
| Capra anti-Topo IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21424 | Utilizzato come anticorpo secondario. Diluizione consigliata di 1:200. |
| Capra anti-PDGFRβ | R& D | AF1042 | Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC di tutti i campioni. Concentrazione consigliata: 5 μ g/mL. |
| Capra anti-Coniglio IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21249 | Utilizzato come anticorpo secondario. Diluizione consigliata di 1:200. |
| Capra anti-Coniglio IgG-DyLight 488 | Thermo | 35552 | Utilizzato come anticorpo secondario. Diluizione consigliata di 1:200. |
| Capra anti-ratto IgG-DyLight 650 | Thermo | SA5-10021 | Utilizzato come anticorpo secondario. Diluizione consigliata di 1:200. |
| Pinza Graefe, punta curva, denti 1X2 FST | 11054-10 | Utilizzabile per la tenuta e l'agitazione della rete filtrante in nylon | |
| HBSS, tampone 1X con calcio e magnesio | Corning | 21-022-CM | Utilizzato per la soluzione MV-1 |
| HEPES, tampone liquido | 1M Corning | 25-060-CI | Utilizzato per la soluzione MV-1 |
| Isolectin GS-IB4-Biotin-XX | ThermoFisher Scientific (Thermo) | I21414 | Glicoproteina isolata dalla leguminosa Griffonia simplicifolia che lega i residui di D-galattosilico della glicocalisse delle cellule endoteliali. Utilizzato per microvasi del SNC aviario e suino. Concentrazione consigliata: 5 μ g/mL. |
| Forbici LaGrange, seghettate | FST | 14173-12 | Utilizzate per la dissezione del cranio e la laminectomia (eccetto maiale e macaco) |
| Unità a 8 pozzetti Millicell EZ slide Millipore | Sigma | PEZGS0816 | |
| Topo anti-CLDN5 | Thermo | 35-2500 | Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC di tutti i campioni. Concentrazione consigliata: 5 μ g/mL. |
| Topo anti-GGT1 | Abcam | ab55138 | Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC di tutti i campioni. Concentrazione consigliata: 5 μ g/mL. |
| Topo anti-umano CD31 | R& D | BBA7 | Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC dei primati. Concentrazione consigliata: 16,5 μ g/mL. |
| Topo anti-NFM | Thermo | RMO-270 | Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC di tutti i campioni. Concentrazione consigliata: 5 μ g/mL. |
| Topo anti-αSMA | Thermo | MA5-11547 | Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC di tutti i campioni. Diluizione consigliata di 1:200. |
| Rete filtrante in nylon, rotolo | Millipore Sigma | NY6000010 | Dischi filtranti tagliati al laser a 13 mm di diametro. Utilizzato per piccoli ipotali vetebrati e ipofisi. |
| Reti filtranti in nylon, 25 mm | Millipore Sigma | NY2002500 | Utilizzato sulla maggior parte dei piccoli vertebrati del SNC, ad eccezione dell'ipotalamo e dell'ipofisi. Utilizzato per l'ipotalamo e l'ipofisi di macaco e maiale. |
| Reti filtranti in nylon, 47 mm | Millipore Sigma | NY2004700 | Utilizzate per i tessuti del SNC di macachi e suini, ad eccezione dell'ipotalamo e dell'ipofisi. |
| Reagente antisbiadimento ProLong Gold con DAPI | ThermoFisher | P36935 | Utilizzato per vetrini coprioggetti. |
| Coniglio anti-AQP4 | Millipore Sigma | A5971 | Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC di tutti i campioni. Diluizione consigliata di 1:200. |
| Coniglio anti-LSR | Millipore Sigma | SAB2107967 | Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC di tutti i campioni. Concentrazione consigliata: 5 μ g/mL. |
| Coniglio anti-NG2 | Millipore Sigma | AB5320 | Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC di tutti i campioni. Diluizione consigliata di 1:200. |
| Coniglio anti-OSP | Abcam | ab53041 | Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC di tutti i campioni. Concentrazione consigliata: 1 μ g/mL. |
| Coniglio anti-VE-Caderina | Abcam | ab33168 | Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC di tutti i campioni. Concentrazione consigliata: 5 μ g/mL. |
| Coniglio anti-ZO-1 | Thermo | 61-7300 | Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC di tutti i campioni. Concentrazione consigliata: 5 μ g/mL. |
| Ratto anti-CD31 | Becton Dickinson | BD 550274 | Utilizzato come anticorpo primario per i microvasi murini del SNC. Concentrazione consigliata: 5 μ g/mL. |
| Anti-GFAP per ratto | Thermo | 13-0300 | Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC di tutti i campioni. Diluizione consigliata di 1:200. |
| Rat anti-VCAM-1 | Becton Dickinson | BD 553329 | Utilizzato come anticorpo primario per valutare la neuroinfiammazione. Concentrazione consigliata: 5 μ g/mL. |
| Soluzione sterile di Ringer, Frog | Aldon Corporation | IS5066 | Utilizzato per l'anestesia amfibiana |
| Streptavidina-ALEXA 555 | Thermo | S32355 | Utilizzato come anticorpo secondario per marcare gli anticorpi primari biotinilati. Diluizione consigliata di 1:500. |
| Streptavidina-ALEXA 647 | Thermo | S32357 | Utilizzato come anticorpo secondario per marcare gli anticorpi primari biotinilati. Diluizione consigliata di 1:500. |
| Forbici chirurgiche, affilate | FST | 14002-12 | Utilizzate per la rimozione di muscoli e pelle |
| Forbici chirurgiche, affilate-smussate | FST | 14001-16 | Utilizzate per la decapitazione (eccetto maiale e macaco) |
| Portafiltro Swinnex, 13 mm | Millipore Sigma | SX0001300 | Modificato mediante taglio laser. Utilizzato per piccoli ipotali vetebrati e ipofisi. |
| Portafiltro Swinnex, 25 mm | Millipore Sigma | SX0002500 | Modificato mediante taglio laser. Utilizzato sulla maggior parte dei piccoli vertebrati del SNC, ad eccezione dell'ipotalamo e dell'ipofisi. Utilizzato per l'ipotalamo e l'ipofisi di macaco e maiale. |
| Portafiltro Swinnex, 47 mm | Millipore Sigma | SX0004700 | Modificato mediante taglio laser. Utilizzato per i tessuti del SNC di macaco e maiale, ad eccezione dell'ipotalamo e dell'ipofisi. |
| Triton X-100 | ThermoFisher | 50-165-7277 | Utilizzato per il blocco e il diluente anticorpale. |
| Wheaton 120 Vac Overhead Stirrer | VWR (Fornitore DWK Life Sciences) | 62400-904 (DWK #903475) | Utilizzato per tessuti del SNC di macachi e suini con macinatore di tessuti da 55 mL, ad eccezione dell'ipotalamo e dell'ipofisi. |
| Macinatore di tessuti Wheaton Potter-Elvehjem con pestello in PTFE, 10 mL | VWR (Fornitore DWK Life Sciences) | 14231-384 (DWK #357979) | Utilizzato sulla maggior parte dei piccoli tessuti del SNC dei vertebrati, ad eccezione dell'ipotalamo e dell'ipofisi. Utilizzato per l'ipotalamo e l'ipofisi di macaco e maiale. |
| Macinatore di tessuti Wheaton Potter-Elvehjem con pestello in PTFE, 55 mL | VWR (Fornitore DWK Life Sciences) | 14231-372 (DWK #357994) | Utilizzato per i tessuti del SNC di macachi e suini, ad eccezione dell'ipotalamo e dell'ipofisi. |
Riferimenti
- Bundgaard, M., Abbott, N. J. All vertebrates started out with a glial blood-brain barrier 4-500 million years ago. Glia. 56, 699-708 (2008).
- Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a020412(2015).
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