Articolo metodologico

Isolamento affidabile dei micronavi del sistema nervoso centrale in cinque gruppi di vertebrati

DOI:

10.3791/60291

⸱

12 gennaio 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Physiology and Cell Biology, University of California Davis, 2University of Veterinary Medicine Hannover Foundation

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'obiettivo di questo protocollo è quello di isolare i microvasi da più regioni del sistema nervoso centrale dei vertebrati lissencefalici e gyrencephalic.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'isolamento dei microvasi dal sistema nervoso centrale (CNS) è comunemente eseguito combinando tessuto corticale da più animali, il più delle volte roditori. Questo approccio limita l'interrogatorio delle proprietà della barriera emato-encefalica (BBB) alla corteccia e non consente il confronto individuale. Questo progetto si concentra sullo sviluppo di un metodo di isolamento che consente il confronto dell'unità neurovascolare (NVU) da più regioni del SNC: corteccia, cervelletto, lobo ottico, ipotalamo, ipofisi, tronco encefalico e midollo spinale. Inoltre, questo protocollo, originariamente sviluppato per i campioni di murini, è stato adattato con successo per l'uso su tessuti CNS da piccole e grandi specie di vertebrati da cui siamo anche in grado di isolare i microvasi dalla materia bianca dell'emisfero cerebrale. Questo metodo, se abbinato all'immunoetichettatura, consente la quantificazione dell'espressione proteica e il confronto statistico tra individui, tipo di tessuto o trattamento. Abbiamo dimostrato questa applicabilità valutando i cambiamenti nell'espressione delle proteine durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE), un modello murino di una malattia neuroinfiammatoria, la sclerosi multipla. Inoltre, i microvessels isolati con questo metodo potrebbero essere utilizzati per applicazioni a valle come qPCR, RNA-seq e macchia occidentale, tra gli altri. Anche se questo non è il primo tentativo di isolare le microvessels CNS senza l'uso di ultracentrifugazione o dissociazione enzimatica, è unico nella sua abilità per il confronto di singoli individui e più regioni del SNC. Pertanto, consente di scandire una serie di differenze che altrimenti potrebbero rimanere oscure: porzioni del SNC (corteccia, cervelletto, lobo ottico, tronco encefalico, ipotalamo, ipofisario e midollo spinale), tipo di tessuto CNS (materia grigia o bianca), individui, gruppi di trattamento sperimentale e specie.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il nostro cervello è l'organo più importante del nostro corpo. Per questo motivo, mantenere l'omeostasi del cervello nonostante fattori esterni che possono innescare una deviazione dalla normalità è una priorità. Secondo alcuni studiosi, circa 400-500 milioni di anni fa1, gli animali vertebrati hanno sviluppato quella che oggi conosciamo come la barriera emato-encefalica (BBB)2,3. Questa "recinto" protettiva esercita la maggiore influenza sull'omeostasi del sistema nervoso centrale (CNS) e sulle funzioni regolando strettamente il trasporto di ioni, molecole e cellule tra sangue e parenchyma del SNC. Quando il BBB viene interrotto, il cervello diventa suscettibile a esposizione tossica, infezione, e infiammazione. Pertanto, la disfunzione BBB è associata a molti, se non tutti, disturbi neurologici e neurosviluppo4 ,5,6.

La sofisticata funzione del BBB è attribuita all'unica microvascolatura CNS conformata dall'unità neurovascolare (NVU)2,3. Cellule endoteliali altamente specializzate, periciti e piedi finali astrociti cisonoci sono i componenti cellulari della NVU2,3. La matrice extracellulare generata da queste cellule è anche essenziale per la fisiologia NVU e BBB2,3. Anche se i componenti cellulari e molecolari essenziali della NVU sono conservati tra i vertebrati, l'eterogeneità è riportata tra gli ordini e le specie7,8. Tuttavia, limitazioni tecniche ostacolano la nostra capacità di considerare pienamente queste differenze nella ricerca neurobiologia, biomedica o traslazionale.

Per questo motivo, abbiamo ampliato un metodo di isolamento dei microvessel specifico della regione CNS per renderlo applicabile a numerose specie di tutti e cinque i gruppi di vertebrati: pesci, anfibi, rettili, uccelli e mammiferi. Il protocollo è descritto per l'uso su vertebrati small-lissencefalici e grandi girocefali, comprese specie con rilevanza traslazionale9. Inoltre, includiamo altre regioni del CNS non studiate prima in questo contesto, ma rilevanti per la neurofisiologia e con enormi implicazioni cliniche: l'ipotalamo, l'ipofisi e la materia bianca. Infine, abbiamo testato la capacità di questo metodo di isolamento come uno strumento affidabile per identificare i cambiamenti nell'espressione proteica lungo l'NVU e/o BBB9,10,11. Come proof-of-concept, abbiamo mostrato come determinare i cambiamenti nell'espressione VCAM-1 e JAM-B durante EAE utilizzando il metodo di isolamento seguito dall'immunofluorescenza.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutte le procedure del presente studio sono conformi alle linee guida stabilite dall'Università della California (UC), Davis Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). La cura degli animali all'UC Davis è regolata da diverse risorse indipendenti ed è stata pienamente accreditata dalla Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) dal 1966. I tessuti CNS porcino sono stati ottenuti dal Dipartimento UCD di Scienze Animali, Meat Sciences Laboratory. I tessuti del CNS dei macachi rhesus sono stati ottenuti dal California National Primate Research Center Pathology Department (NIH P51OD01107). Nessuna anestesia, eutanasia o necropsia è stata eseguita dal personale di laboratorio su maiali e macachi. Pertanto, non ci sono raccomandazioni particolari in merito a tali questioni.

NOTA: Questo metodo è stato convalidato per più specie, ma il protocollo fornito corrisponde più direttamente ai tessuti murini e porcini. I dettagli relativi al lobo ottico non si applicano quando si utilizzano campioni di mammiferi. Tutti i materiali biopericolosi devono essere trattati in un adeguato livello di biosicurezza (BSL). Tutti i materiali acutamente tossici devono essere maneggiati sotto un cofano di fumi. Tutti i rifiuti medici biopericolosi e i rifiuti acutamente tossici devono essere smaltiti correttamente.

1. Preparazione

  1. Preparare le soluzioni (Tabella 1) almeno un giorno prima.
    NOTA: È molto difficile sciogliere 70 kDa peso molecolare (MW) dextran. È più efficiente lasciare che la soluzione si agita durante la notte coperta con pellicola paraffina o pellicola. Il protocollo richiede l'uso di due diverse soluzioni MV-2 a seconda del campione in esame. Il 18% dextran separa in modo efficiente la mielina dal pellet del microvaso quando si esegue il protocollo su piccoli esemplari lissencephalic. Tuttavia, sviluppa uno striscio di mielina all'interno dell'interfaccia dei tessuti CNS da grandi esemplari gyrencephalic, così come l'ipotalamo e l'iptuitario da piccoli esemplari. Questo striscio è impedito utilizzando 20% dextran.
  2. Preparare i well-slides caricando 50 -L per pozzo di poli-D-lisina e lasciare asciugare per 2 h a temperatura ambiente (RT), preferibilmente in un armadio di sicurezza biologica-classe 2 (BSC-2). Non asciugare troppo. Sciacquare due volte con la salina con buffer fosfato (PBS) e conservarla in frigorifero fino a quando non è pronta per l'uso.

2. Dissezione dei tessuti CNS dal piccolo esemplare di vertebrato lissencefalico

NOTA: l'articolo illustra l'applicazione del protocollo su un C57BL6/J, 10 settimane di età, 25 g, mouse maschile.

  1. Preparare due tubi conici da 15 mL e un tubo di microcentrifuga da 1,7 mL con 5 mL e 1 mL, rispettivamente, di soluzione MV-1 per campione. Tenere i tubi sul ghiaccio.
  2. Anestesizzazione
    1. Anestetizza i topi mediante iniezione intraperitoneale di una chetamina, xilocina e acepromazina cocktail anestetico a 100/10/3 mg per kg di peso corporeo e spray con 70% di etanolo. Confermare l'anestesia valutando l'assenza di riflessi palpebrali e pedale toccando un occhio e pizzicando un piede, rispettivamente.
    2. Anestesizzai i piccioni per inalazione del 5% di isoflurane usando una scatola di anestesia ad induzione.
    3. Anestesizzare pesci e rane in 1% Tricaina in un acquario o soluzione anfibia Ringer (Tabella dei materiali), rispettivamente.
    4. Anestesizzale le lucertole raffreddandosi a 4 gradi centigradi prima dell'eutanasia.
  3. Decapitare l'animale con forbici chirurgiche, staccare la pelle con pinze per esporre il cranio e tagliare con le forbici LaGrange attraverso il forame magnum (Figura 1A).
  4. Dissezionare il cervello con una spatola e trasferirlo in un tubo conico da 15 mL con soluzione MV-1. Tieni il tubo sul ghiaccio.
  5. Recuperare l'ipofisi dalla sella turcica del cranio con pinze e trasferirlo in un tubo di microcentrifuga da 1,7 mL con soluzione MV-1. Tieni il tubo sul ghiaccio.
  6. Rimuovere la pelle e il muscolo per esporre la colonna vertebrale. Tagliare gli arti, la gabbia toracica e gli organi interni (Figura 1B).
  7. Dissezionare il midollo spinale con uno dei due metodi descritti di seguito. Quindi, trasferire in un tubo conico 5 mL con soluzione MV-1. Tieni il tubo sul ghiaccio.
    1. Eseguire laminectomia tagliando in direzione rostrale a caudale con forbici LaGrange, iniziando attraverso il forame vertebralecervicale , fino a raggiungere il cordone lombare.
    2. Eseguire il lavaggio in direzione caudale in rostrale in tutto il forame vertebrale lombare con un ago da 18 G e una siringa da 10 mL caricata con soluzione MV-1 (Figura 1C,D).
      NOTA: questo metodo funziona solo con campioni molto piccoli, per lo più roditori (<100 g).
  8. Utilizzando un mirino di dissezione, tagliare il sacco durale dal midollo spinale con le forbici a molla e rimuovere le restanti meningi con un plettro a doppio campo (Figura 2).
  9. Trasferire il cervello in un piatto Petri e, utilizzando un mirino di dissezione, rimuovere le meningi con un plettro a doppia pletora (Figura 2A–C).
  10. Accise i bulbi olfattivi e il talamo con pinze, forbici da iride e forbici primaverili. Utilizzando il plettro a doppia puntura, rimuovere il plesso coroideo da tutti i ventricoli cerebrali. Assicurarsi di rimuovere tutto il plesso coroideo.
    NOTA: Il plesso coroideo e i bulbi olfattivi sono una massiccia fonte di contaminazione. A differenza della BBB, questi capillari sono altamente fenestrated e i risultati degli esperimenti successivi saranno compromessi se non vengono rimossi.
  11. Utilizzando pinze, separare le regioni SNC distinte: corteccia, cervelletto, tronco encefalico, lobo ottico (non su esemplari di mammiferi) e ipotalamo.

3. Dissezione dei tessuti CNS da un grande esemplare di vertebrato ginefalo

NOTA: Questo protocollo utilizza tessuti CNS porcina ottenuti da un mattatoio. Pertanto, nessuna anestesia, eutanasia o necroscopia è descritta o mostrata qui.

  1. Trasportare i tessuti CNS porcine in un contenitore di istologia da 0,946 L (32 oz) caricato con soluzione MV-1 all'interno di un forziere/secchio di ghiaccio.
  2. Utilizzando un mirino di dissezione, rimuovere le meningi con un piccone a doppia punta, pinze, forbici iride, e forbici a molla da ogni tessuto del SNC. Assicurarsi di rimuovere eventuali pezzi di plesso coroideo dai ventricoli cerebrali.

4. Omogeneizzazione dei tessuti del CNS

NOTA: È più efficiente quando due ricercatori si impegnano nel processo di omogeneizzazione: uno seziona le meningi sotto lo stereoscopio e l'altro omogeneizzando i tessuti macinati. In questo modo, i tessuti vengono rapidamente restituiti al secchio di ghiaccio e mantenuti freddi.

  1. Posizionare ogni regione CNS su una piastra Petri con 1 mL di soluzione MV-1. Utilizzando una lama a bordo singolo, macinare il tessuto per ottenere pezzi da 1–2 mm.
    1. Per un piccolo esemplare di vertebrato, utilizzare una piastra Petri da 100 mm x 20 mm.
    2. Per un grande esemplare di vertebrato, utilizzare una parabola Petri da 150 mm x 15 mm.
  2. Omogeneizzazione di un piccolo esemplare di vertebrato (Tabella 2 e Tabella 3)
    1. Trasferire la corteccia, il cervelletto, il tronco encefalico, il lobo ottico e il midollo spinale alla soluzione MV-1 da 1l mL in un'unica smerigliatrice di tessuto in vetro Potter-Elvehjem da 10 mL con un pestello PTFE utilizzando una pipetta di trasferimento. Aggiungere 5 mL di soluzione MV-1 e omogeneizzare ogni tessuto (10 colpi). Trasferire a singoli tubi conici da 15 mL. Tenere i tubi sul ghiaccio.
      NOTA: Per un piccolo vertebrato, 5 o 4, rispettivamente con o senza lobo ottico, sono necessari smerigliatrici Potter-Elvehjem da 10 mL e tubi conici da 15 mL.
    2. Trasferire l'ipotalamo e l'ipofisi con le pinze a 100 dollari di soluzione MV-1 in un tubo individuale da 1,7 mL e omogeneizzare con attenzione con un micropestle di vetro. Sciacquare ogni micropestle con una soluzione MV-1 da 1 mL di MV-1. Tieni il tubo sul ghiaccio.
      NOTA: Per un piccolo vertebrato, sono necessari 2 micropestle di vetro e tubi da 1,7 mL.
  3. Omogeneizzazione di un grande esemplare di vertebrato (Tabella 4 e Tabella 5)
    1. Utilizzando una pipetta di trasferimento, trasferire il tessuto macinato in un macinino in tessuto di vetro Potter-Elvehjem da 55 mL con un pestello PTFE e attaccarlo al mimossere in testa. Aggiungere metà del volume consigliato della soluzione MV-1, in base alla porzione CNS specifica che viene omogeneizzata (Tabella 5).
    2. Accendere lo staffatore in testa a velocità molto bassa (150 giri/min) e spostare con attenzione il tubo di vetro su e giù per circa 30 s.
    3. Spegnere il collegitore dall'alto, aggiungere altra soluzione MV-1 e ripetere il passaggio 4.3.2 fino ad ottenere un liquame omogeneo.
    4. Trasferire su un tubo conico da 50 mL. Tieni il tubo sul ghiaccio.
    5. Lavare la smerigliatrice con acqua deionizzata tra ogni omogeneizzazione del tessuto SNC.
      NOTA: Per un vertebrato di grandi dimensioni 5 o 4, rispettivamente con o senza materia bianca, sono necessari 50 mL di tubi conici. Allo stesso modo, sono necessari due (2) 15 mL di tubi conici per l'ipotalamo e l'ipofisi.

5. Purificazione del recipiente

  1. Omogenei del tessuto di centrifuga derivanti dal passo 4.2.1, 4.2.2, o 4.3.4 a 2.000 g per 10 min a 4 gradi centigradi. Una grande interfaccia bianca di mielina si formerà sulla parte superiore dei pellet rossastri delle microvessels. Scartate i superalatari.
    1. Piccolo esemplare vertebrato (Tabella 2 e Tabella 3)
      1. Risospendere la corteccia, il cervelletto, il tronco encefalico, il lobo ottico e il pellet del midollo spinale in 5 mL di soluzione MV-2 ghiacciata con una pipetta sierologica da 5 mL (10 lavaggi). Aggiungere 5 mL di soluzione MV-2 ghiacciata ad ogni sospensione e mescolare attentamente capovolgendo i tubi.
      2. Risospendere l'ipotalamo e i pellet ipofisari con 1 mL di soluzione MV-2.
    2. Grande esemplare di vertebrato (Tabella 4 e Tabella 5)
      1. Aggiungere 20 mL di soluzione MV-2 ghiacciata alla corteccia, al cervelletto, al tronco encefalico e ai pellet dei recipienti del midollo spinale. Risospendere i pellet mescolando su uno shaker revolver a tubo, mescolando a 40 giri per 5 min. Bilanciare i volumi dei tubi conici della corteccia, cervelletto, tronco encefalico, e sospensioni del midollo spinale con l'aggiunta di più soluzione MV-2.
      2. Risospendere l'ipotalamo e i pellet a micronave pituitaria in 5 mL di soluzione MV-2 con una pipetta sierologica da 5 mL (vampate di calore) da 10 usd. Aggiungere 5 mL di soluzione MV-2 ghiacciata alle sospensioni e mescolare con attenzione capovolgendo il tubo.
  2. Centrifuga a 4.400 x g per 15 min a 4 gradi centigradi.
  3. Staccare con attenzione lo strato di mielina spesso e denso sull'interfaccia liquida dalle pareti di ogni tubo ruotando lentamente i tubi e permettendo al supernatante di passare lungo le pareti.
  4. Scartare la mielina e l'interfaccia liquida e macchiare la parete interna di ogni tubo con una spatola avvolta con una salvietta di carta bassa. Per piccoli campioni di vertebrati, rimuovere lo strato di mielina da ogni ipotalamo e tubo ipofisario aspirando con attenzione con una pipetta di trasferimento.
  5. Pulire il liquido in eccesso con una salvietta di carta contorta a bassa lanella. Risospendere ogni pellet con 1 mL di soluzione MV-3 utilizzando punte a basso legame. Tenere i tubi sul ghiaccio.

6. Eluzione e filtrazione dei recipienti

  1. Versare la soluzione MV-3 ghiacciata in singoli becher per ogni regione del SNC. Tenere a 4 gradi centigradi.
    1. Per piccoli campioni di vertebrati, utilizzare 10 mL di soluzione MV-3 per becher da 50 mL. Un totale di 6-7 becher è necessario a seconda se il lobo ottico è incluso o meno.
    2. Per grandi campioni di vertebrati, utilizzare 30 mL di soluzione MV-3 per becher da 100 mL. Un totale di 6-7 becher è necessario a seconda se la materia bianca è inclusa o meno.
  2. Posizionare un colino cellulare sopra un tubo conico da 50 mL. Usane uno per ogni area CNS. Utilizzare un colino da 100 m per la corteccia, il tronco encefalico, il lobo ottico, il midollo spinale e l'ipofisi. Utilizzare un colino a 70 celle m per il cervelletto e l'ipotalamo.
  3. Umidità di ogni colino con 1 mL di soluzione MV-3 ghiacciata.
  4. Aggiungere più soluzione MV-3 alle sospensioni preparate al punto 5.5 con una pipetta sierologica durante la miscelazione per evitare gli aggregati. Caricare con attenzione i microrecipient sopra il colino. Risciacquare con soluzione MV-3 ghiacciata.
    1. Per piccoli campioni di vertebrati (Tabella 2 e Tabella 3),aggiungere 10-15 mL di soluzione MV-3 con una pipetta sierologica e risciacquare con 5 mL di soluzione MV-3.
    2. Per grandi campioni di vertebrati, aggiungere 20 mL di soluzione MV-3 con una pipetta sierologica e risciacquare con 10 mL di soluzione MV-3.
  5. Assemblare l'unità di filtrazione posizionando un filtro di rete in nylon da 20 m su un supporto di filtro modificato (Figura 2D), uno per ogni regione DEL SNC.
    1. Per i piccoli campioni di vertebrati (Tabella 2 e Tabella 3), utilizzare i supporti filtranti modificati 25 mm per la corteccia, il cervelletto, il tronco cerebrale, il lobo ottico e il midollo spinale. Utilizzare portafiltri modificati da 13 mm per l'ipotalamo e l'ipofisi.
    2. Per i grandi campioni di vertebrati (Tabella 4 e Tabella 5), utilizzare supporti di filtro modificati 47 mm per la corteccia, il cervelletto, il tronco encefalico e il midollo spinale. Utilizzare 25 mm per l'ipotalamo e l'ipofisi.
  6. Posizionare il filtro sopra un tubo conico da 50 mL e un filtro bagnato con 5 mL di soluzione MV-3 ghiacciata assicurandosi che il buffer versa salga il supporto del filtro al tubo conico.
  7. Trasferire i microrecipient eluiti (dal punto 6.4) sopra il filtro a rete in nylon da 20 m e sciacquare i microrecipient con 5-10 mL di soluzione MV-3 ghiacciata.
  8. Recuperare il filtro con pinze pulite e immergerlo nel becher contenente la soluzione MV-3 ghiacciata preparata nel passaggio 6.1.
  9. Staccare i microrecipient dal filtro agitandolo delicatamente per circa 30 s. Per piccoli campioni di vertebrati, versare il contenuto del becher in un tubo conico da 15 mL. Per grandi campioni di vertebrati, versare il contenuto del becher in un tubo conico da 50 mL.
  10. Centrifuga a 2.000 x g per 5 minuti a 4 gradi centigradi e risospendere il pellet in 1 mL di soluzione MV-3 ghiacciata utilizzando una punta di pipetta a bassa legame.
    1. Per piccoli campioni di vertebrati, trasferire la sospensione (dal passo 6.10) in un tubo di microcentrifuga di 1,7 mL e centrifugare a 20.000 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
      NOTA: Questo spin viene eseguito su una centrifuga da banco alla massima velocità (20.000 x g) per garantire una resa robusta.
    2. Per grandi campioni di vertebrati, trasferire la sospensione dalla fase 6,10 in un tubo di microcentrifuga da 5,0 mL, aggiungere 4 mL di soluzione MV-3 e centrifugare a 2.000 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.

7. Immunostaining

NOTA: la colorazione ematossia e eosina (H&E) è stata eseguita su rettili, anfibi e campioni di pesce come prova di concetto della fattibilità del protocollo. Pertanto, non vi è alcuna raccomandazione per l'immunoetichettatura per questi campioni.

  1. Rimuovere il supernatante dai tubi di microcentrifuga.
  2. Risospendere il pellet in PBS sterile 1x utilizzando una punta pipetta a basso legame (Tabella dei materiali). Impedire ai micronavi di formare aggregati tramite pipettaggio più volte. Per i piccoli campioni di vertebrati (tabella 3),utilizzare 100 - L-2.000 - L a seconda della dimensione del pellet. Per i campioni vertebrati di grandi dimensioni (Tabella 5),utilizzare 1.000 USD l-4.000 - L in base alle dimensioni del pellet.
  3. Utilizzando una punta pipetta a bassa rilegatura, trasferire i microrecipient in vetrini di pozzi, facendo attenzione ad aggiungerli al centro di ogni pozzo, evitando le pareti laterali.
  4. Impostare i vetrini del pozzo, scoperti, all'interno di un BSC-2, e lasciare asciugare per 20-30 min a RT.
    NOTA: Un volume relativamente elevato di 1x PBS viene utilizzato per evitare la formazione di aggregati. Per questo motivo, è necessario lasciare asciugare i vetrini prima della fissazione per assicurarsi che i microrecipienti siano tenuti dal rivestimento polid-lysina.
  5. Rimuovere il residuo 1x PBS con una pipetta di trasferimento, aggiungere 200 -L di 4% di paraformaldeide (PFA) e incubare per 30 min a RT.
  6. Pipette fuori la soluzione fixativa e lavare 3x con 200 s L di 1x PBS per 5 min a RT.
    NOTA: a questo punto è stata eseguita la colorazione H&E su pesci, microvessels anfibi e rettili cnsp.
  7. Aggiungere 200 l di tampone di bloccante al vetrino del pozzo e incubare per 60 min a 37 gradi centigradi.
  8. Rimuovere il buffer di blocco con una pipetta di trasferimento e aggiungere 200 l del cocktail anticorpale primario in diluente anticorpo (Tabella dei materiali). Incubare a 4 gradi centigradi.
  9. Pipette fuori il cocktail anticorpale primario e lavare 3x con 200 l- l di 1x PBS per 5 min a RT.
  10. Caricare il cocktail anticorpale secondario (Tabella dei materiali) diluito in 1x PBS e incubare per 2 h a RT, protetto dalla luce.
  11. Pipette fuori il cocktail anticorpo secondario e lavare 3x con 200 l- l of 1x PBS per 5 min a RT, protetto dalla luce. Dopo l'ultimo lavaggio staccare il telaio del pozzo-slide e asciugare blot-secco eventuali in eccesso 1x PBS con una salvietta di carta a bassa pelnella.
  12. Aggiungere un coverslip, un mezzo di montaggio liquido anti-dissolvenza e 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) per la colorazione nucleare. Lasciare asciugare per tutta la notte a RT protetto dalla luce.
  13. Una volta asciutto, tenere al protetto dalla luce su una scatola di scorrimento a 4 gradi centigradi fino a quando non si è pronti per la microscopia confocale e l'acquisizione dei dati.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I microvessels isolati dal SNC murino hanno mostrato tutti i componenti cellulari intrinseci dell'unità neurovascolare2,3. Utilizzando sia platelete endoteliale aderenazione delle cellule-1 (PECAM, noto anche come CD31) o isolettica IB4 (una glicoproteina che lega il glicocalyx cellule endotelialiali) per le cellule endoteliali, il fattore di crescita derivato dalle piastrine - (PDGFR) o l'antigene neurone-gliale 2 (NG2) per peric...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il BBB include le proprietà uniche delle cellule endoteliali di microvascolatura cerebrale accoppiate da una sofisticata architettura di stretto, aderenti-, "peg-socket" - giunzioni, e placche di adesione critiche per l'omeostasi CNS2,3,19. Le proprietà delle cellule endote sono indotte e mantenute dai periciti e dall'astroglia circostante i processi di fine piede2,3

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Cruz-Orengo è stato sostenuto dalla University of California, Davis, School of Veterinary Medicine Start Up Funds.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10X PBSThermoFisherBP39920Utilizzato per il blocco e il diluente anticorpale.
20% PFAMicroscopia ElettronicaScienze 15713-SUtilizzato come fissativo (4% PFA)
70.000 MW DestranoMillipore Sigma9004-54-0Utilizzato per la soluzione MV-2
Adson ForcipeFine Science Tools (FST)11006-12Utilizzato per la rimozione di muscoli e pelle
Pinza Adson, qualità per studentiFST91106-12Come sopra ma più economico
Siero bovino albumina (BSA)Millipore SigmaA7906-100GUtilizzato per la soluzione MV-3, il bloccante e il diluente anticorpale
Corning 100 μ m Filtro cellulareMillipore SigmaCLS431752-50EA
Corning 70 μ m Filtro cellulareMillipore SigmaCLS431751-50EA
Corning Deskwork punte a basso legameMillipore SigmaCLS4151Come di seguito ma più economico.
Cultrex Poli-D-lisinaR& D3439-100-01Utilizzato per il rivestimento scorrevole
Asino anti-capra IgG-ALEXA 555ThermoA21432Utilizzato come anticorpo secondario. Diluizione consigliata di 1:200.
Asino anti-Topo IgG-ALEXA 488ThermoA21202Utilizzato come anticorpo secondario. Diluizione consigliata di 1:200.
Asino anti-Coniglio IgG-ALEXA 488ThermoA21206Utilizzato come anticorpo secondario. Diluizione consigliata di 1:200.
Asino anti-coniglio IgG-ALEXA 647ThermoA31573Utilizzato come anticorpo secondario. Diluizione consigliata di 1:200.
Asino anti-ratto IgG-DyLight 650ThermoSA5-10029Utilizzato come anticorpo secondario. Diluizione consigliata di 1:200.
Plettro per tessuti a doppia puntaFST18067-11Utilizzato per la rimozione di meningi e plesso coroideo
Dumont #3c PinzaFST11231-20Utilizzata per la manipolazione di tessuti del SNC più delicati e/o piccoli (come l'ipofisi)
Dumont #7 PinzeFST11274-20Utilizzate per la dissezione e la manipolazione del tessuto del SNC
Dumont #7 Pinze, studenteFST91197-00Come sopra ma più economici
ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention TipsEppendorf22493008Migliore qualità rispetto ai puntali sopra (più costosi).
Pinze Graefe extra fini, seghettateFST11151-10Utilizzato per la rimozione dell'osso
Forbici fini, affilateFST14060-09Utilizzato per la rimozione di sacchi durali di maiale e macaco
Pestello di vetro Omogeneizzatore per tritatessuti per microcentrifuga da 1,5 mL, confezione da 10Chang Bioscience Inc. (eBay)GP1.5_10Utilizzato per piccoli ipotali e ipofisi.
Capra anti-CXCL12, biotinilatoPeproTech500-P87BGBTUtilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC di tutti i campioni. Diluizione consigliata: 1:20.
Capra anti-JAM-BR& DAF1074Utilizzato come anticorpo primario per valutare la neuroinfiammazione. Concentrazione consigliata: 5 μ g/mL.
Capra anti-Topo IgG-ALEXA 488ThermoA11001Utilizzato come anticorpo secondario. Diluizione consigliata di 1:200.
Capra anti-Topo IgG-ALEXA 555ThermoA21424Utilizzato come anticorpo secondario. Diluizione consigliata di 1:200.
Capra anti-PDGFRβR& DAF1042Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC di tutti i campioni. Concentrazione consigliata: 5 μ g/mL.
Capra anti-Coniglio IgG-ALEXA 555ThermoA21249Utilizzato come anticorpo secondario. Diluizione consigliata di 1:200.
Capra anti-Coniglio IgG-DyLight 488Thermo35552Utilizzato come anticorpo secondario. Diluizione consigliata di 1:200.
Capra anti-ratto IgG-DyLight 650ThermoSA5-10021Utilizzato come anticorpo secondario. Diluizione consigliata di 1:200.
Pinza Graefe, punta curva, denti 1X2 FST11054-10Utilizzabile per la tenuta e l'agitazione della rete filtrante in nylon
HBSS, tampone 1X con calcio e magnesioCorning21-022-CMUtilizzato per la soluzione MV-1
HEPES, tampone liquido1M Corning25-060-CIUtilizzato per la soluzione MV-1
Isolectin GS-IB4-Biotin-XXThermoFisher Scientific (Thermo)I21414Glicoproteina isolata dalla leguminosa Griffonia simplicifolia che lega i residui di D-galattosilico della glicocalisse delle cellule endoteliali. Utilizzato per microvasi del SNC aviario e suino. Concentrazione consigliata: 5 μ g/mL.
Forbici LaGrange, seghettateFST14173-12Utilizzate per la dissezione del cranio e la laminectomia (eccetto maiale e macaco)
Unità a 8 pozzetti Millicell EZ slide MilliporeSigmaPEZGS0816
Topo anti-CLDN5Thermo35-2500Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC di tutti i campioni. Concentrazione consigliata: 5 μ g/mL.
Topo anti-GGT1Abcamab55138Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC di tutti i campioni. Concentrazione consigliata: 5 μ g/mL.
Topo anti-umano CD31R& DBBA7Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC dei primati. Concentrazione consigliata: 16,5 μ g/mL.
Topo anti-NFMThermoRMO-270Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC di tutti i campioni. Concentrazione consigliata: 5 μ g/mL.
Topo anti-αSMAThermoMA5-11547Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC di tutti i campioni. Diluizione consigliata di 1:200.
Rete filtrante in nylon, rotoloMillipore SigmaNY6000010Dischi filtranti tagliati al laser a 13 mm di diametro. Utilizzato per piccoli ipotali vetebrati e ipofisi.
Reti filtranti in nylon, 25 mmMillipore SigmaNY2002500Utilizzato sulla maggior parte dei piccoli vertebrati del SNC, ad eccezione dell'ipotalamo e dell'ipofisi. Utilizzato per l'ipotalamo e l'ipofisi di macaco e maiale.
Reti filtranti in nylon, 47 mmMillipore SigmaNY2004700Utilizzate per i tessuti del SNC di macachi e suini, ad eccezione dell'ipotalamo e dell'ipofisi.
Reagente antisbiadimento ProLong Gold con DAPIThermoFisherP36935Utilizzato per vetrini coprioggetti.
Coniglio anti-AQP4Millipore SigmaA5971Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC di tutti i campioni. Diluizione consigliata di 1:200.
Coniglio anti-LSRMillipore SigmaSAB2107967Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC di tutti i campioni. Concentrazione consigliata: 5 μ g/mL.
Coniglio anti-NG2Millipore SigmaAB5320Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC di tutti i campioni. Diluizione consigliata di 1:200.
Coniglio anti-OSPAbcamab53041Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC di tutti i campioni. Concentrazione consigliata: 1 μ g/mL.
Coniglio anti-VE-CaderinaAbcamab33168Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC di tutti i campioni. Concentrazione consigliata: 5 μ g/mL.
Coniglio anti-ZO-1Thermo61-7300Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC di tutti i campioni. Concentrazione consigliata: 5 μ g/mL.
Ratto anti-CD31Becton DickinsonBD 550274Utilizzato come anticorpo primario per i microvasi murini del SNC. Concentrazione consigliata: 5 μ g/mL.
Anti-GFAP per rattoThermo13-0300Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC di tutti i campioni. Diluizione consigliata di 1:200.
Rat anti-VCAM-1Becton DickinsonBD 553329Utilizzato come anticorpo primario per valutare la neuroinfiammazione. Concentrazione consigliata: 5 μ g/mL.
Soluzione sterile di Ringer, FrogAldon CorporationIS5066Utilizzato per l'anestesia amfibiana
Streptavidina-ALEXA 555ThermoS32355Utilizzato come anticorpo secondario per marcare gli anticorpi primari biotinilati. Diluizione consigliata di 1:500.
Streptavidina-ALEXA 647ThermoS32357Utilizzato come anticorpo secondario per marcare gli anticorpi primari biotinilati. Diluizione consigliata di 1:500.
Forbici chirurgiche, affilateFST14002-12Utilizzate per la rimozione di muscoli e pelle
Forbici chirurgiche, affilate-smussateFST14001-16Utilizzate per la decapitazione (eccetto maiale e macaco)
Portafiltro Swinnex, 13 mmMillipore SigmaSX0001300Modificato mediante taglio laser. Utilizzato per piccoli ipotali vetebrati e ipofisi.
Portafiltro Swinnex, 25 mmMillipore SigmaSX0002500Modificato mediante taglio laser. Utilizzato sulla maggior parte dei piccoli vertebrati del SNC, ad eccezione dell'ipotalamo e dell'ipofisi. Utilizzato per l'ipotalamo e l'ipofisi di macaco e maiale.
Portafiltro Swinnex, 47 mmMillipore SigmaSX0004700Modificato mediante taglio laser. Utilizzato per i tessuti del SNC di macaco e maiale, ad eccezione dell'ipotalamo e dell'ipofisi.
Triton X-100ThermoFisher50-165-7277Utilizzato per il blocco e il diluente anticorpale.
Wheaton 120 Vac Overhead StirrerVWR (Fornitore DWK Life Sciences)62400-904 (DWK #903475)Utilizzato per tessuti del SNC di macachi e suini con macinatore di tessuti da 55 mL, ad eccezione dell'ipotalamo e dell'ipofisi.
Macinatore di tessuti Wheaton Potter-Elvehjem con pestello in PTFE, 10 mLVWR (Fornitore DWK Life Sciences)14231-384 (DWK #357979)Utilizzato sulla maggior parte dei piccoli tessuti del SNC dei vertebrati, ad eccezione dell'ipotalamo e dell'ipofisi. Utilizzato per l'ipotalamo e l'ipofisi di macaco e maiale.
Macinatore di tessuti Wheaton Potter-Elvehjem con pestello in PTFE, 55 mLVWR (Fornitore DWK Life Sciences)14231-372 (DWK #357994)Utilizzato per i tessuti del SNC di macachi e suini, ad eccezione dell'ipotalamo e dell'ipofisi.

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bundgaard, M., Abbott, N. J. All vertebrates started out with a glial blood-brain barrier 4-500 million years ago. Glia. 56, 699-708 (2008).
  2. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a020412(2015).
  3. Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).
  4. Kealy, J., Greene, C., Campbell, M. Blood-brain barrier regulation in psychiatric disorders. Neuroscience Letters. , (2018).
  5. Sweeney, M. D., Kisler, K., Montagne, A., Toga, A. W., Zlokovic, B. V. The role of brain vasculature in neurodegenerative disorders. Nature Neuroscience. 21, 1318-1331 (2018).
  6. Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back. Physiological Reviews. 99, 21-78 (2019).
  7. Wilhelm, I., Nyul-Toth, A., Suciu, M., Hermenean, A., Krizbai, I. A. Heterogeneity of the blood-brain barrier. Tissue Barriers. 4, e1143544(2016).
  8. O'Brown, N. M., Pfau, S. J., Gu, C. Bridging barriers: a comparative look at the blood-brain barrier across organisms. Genes & Development. 32, 466-478 (2018).
  9. Cruz-Orengo, L., et al. CXCR7 influences leukocyte entry into the CNS parenchyma by controlling abluminal CXCL12 abundance during autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 208, 327-339 (2011).
  10. Serres, S., et al. VCAM-1-targeted magnetic resonance imaging reveals subclinical disease in a mouse model of multiple sclerosis. FASEB Journal. 25, 4415-4422 (2011).
  11. Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
  12. Sohet, F., et al. LSR/angulin-1 is a tricellular tight junction protein involved in blood-brain barrier formation. Journal of Cell Biology. 208, 703-711 (2015).
  13. Cruz-Orengo, L., et al. Enhanced sphingosine-1-phosphate receptor 2 expression underlies female CNS autoimmunity susceptibility. Journal of Clinical Investigation. 124, 2571-2584 (2014).
  14. Dayton, J. R., Franke, M. C., Yuan, Y., Cruz-Orengo, L. Straightforward method for singularized and region-specific CNS microvessels isolation. Journal of Neuroscience Methods. 318, 17-33 (2019).
  15. Smyth, L. C. D., et al. Markers for human brain pericytes and smooth muscle cells. Journal of Chemical Neuroanatomy. 92, 48-60 (2018).
  16. Granberg, T., et al. In vivo characterization of cortical and white matter neuroaxonal pathology in early multiple sclerosis. Brain. 140, 2912-2926 (2017).
  17. Datta, G., et al. Neuroinflammation and its relationship to changes in brain volume and white matter lesions in multiple sclerosis. Brain. 140, 2927-2938 (2017).
  18. Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging Techniques to Assess Inflammation in Multiple Sclerosis. Neuroscience. 403, 4-16 (2019).
  19. Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
  20. Cornford, E., Hyman, S. Localization of brain endothelial luminal and abluminal transporters with immunogold electron microscopy. NeuroRx. 2, 27-43 (2005).
  21. Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M. Purification of Mouse Brain Vessels. Journal of Visualized Experiments. , 53208(2015).
  22. Paul, D., Cowan, A. E., Ge, S., Pachter, J. S. Novel 3D analysis of Claudin-5 reveals significant endothelial heterogeneity among CNS microvessels. Microvascular Research. , (2012).
  23. Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. Journal of Neuroscience Methods. 207, 80-85 (2012).
  24. Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
  25. Bourassa, P., Tremblay, C., Schneider, J. A., Bennett, D. A., Calon, F. Beta-amyloid pathology in human brain microvessel extracts from the parietal cortex: relation with cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 137, 801-823 (2019).
  26. Porte, B., et al. Proteomic and transcriptomic study of brain microvessels in neonatal and adult mice. PLoS One. 12, e0171048(2017).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Propriet della barriera ematoencefalicaConfronto dell unit neurovascolareTecnica di isolamento dei microvasiDissezione del tessuto del SNCOmogeneizzazione in soluzione MV 1Protocollo di purificazione dei microvasiMetodi di rilevazione dell immunomarcaturaEncefalomielite autoimmune sperimentaleQuantificazione dell espressione proteica

Articoli correlati