Migrazione, chemio-attrazione, e analisi co-cultura per le cellule endoteliali derivate da cellule staminali umane e neuroni GABAergic

Sommario

Vi presentiamo tre semplici saggi in vitro: il saggio di migrazione a lunga distanza, il saggio di co-cultura sulla migrazione e l'analisi chemio-attrazione-che valutano collettivamente le funzioni delle cellule staminali umane derivate cellule endoteliali periventricolari e le loro interazione con gli interneuroni GABAergic.

Abstract

Ruolo della vascolatura cerebrale nello sviluppo del sistema nervoso e nell'eziologia dei disturbi cerebrali sta guadagnando sempre più attenzione. I nostri studi recenti hanno identificato una popolazione speciale di cellule vascolari, le cellule endoteliali periventricolari, che svolgono un ruolo fondamentale nella migrazione e distribuzione di interneuroni GABAergici del prosencefalo cerebrale durante lo sviluppo embrionale. Questo, unito alle loro funzioni autonome alle cellule, allude a nuovi ruoli di cellule endoteliali periventricolari nella patologia dei disturbi neuropsichiatrici come la schizofrenia, l'epilessia e l'autismo. Qui, abbiamo descritto tre diversi saggi in vitro che valutano collettivamente le funzioni delle cellule endoteliali periventriculari e la loro interazione con gli interneuroni GABAergici. L'uso di questi saggi, in particolare in un contesto umano, ci permetterà di identificare il legame tra le cellule endoteliali periventricolari e i disturbi cerebrali. Questi saggi sono semplici, a basso costo e riproducibili e possono essere facilmente adattati a qualsiasi tipo di cellula aderente.

Introduzione

Le cellule endoteliali formano il rivestimento dei vasi sanguigni e mediano importanti funzioni che includono il mantenimento della permeabilità della parete del vaso, la regolazione del flusso sanguigno, l'aggregazione delle piastrine e la formazione di nuovi vasi sanguigni. Nel cervello, le cellule endoteliali fanno parte di una barriera emato-encefalica critica che controlla strettamente lo scambio di materiali tra il cervello e il flusso sanguigno¹. I nostri studi nell'ultimo decennio hanno identificato nuovi ruoli neurogenici delle cellule endoteliali cerebrali che hanno implicazioni significative per lo sviluppo e il comportamento del cer....

Protocollo

1. Cultura e conservazione delle cellule endoteliali umane

1. Mantenere le cellule endoteliali periventricolari umane su una matrice a membrana sotterranea rivestita a matrice (vedi Tabella dei materiali)di 6 pozzetti in mezzo a cellule endoteliali periventricolari (mezzo E6 contenente 50 ng/mL VEGF-A, 100 ng/mL FGF2 e 5 gannive GABA) a 37 gradi centigradi e 5% di CO₂. Cambia mezzo ogni giorno alternativo.
2. Scongelare la matrice della membrana del seminterrato a 4 gradi centigradi e creare una soluzione 1:100 diluindola in un mezzo DMEM/F12 freddo. Rivestire ogni pozzetto di una piastra di 6 pozze con soluzione a matrice da ....

Risultati

I passaggi per impostare un inserto di coltura a un solo pozzo all'interno di un piatto da 35 mm sono illustrati nella Figura 1. L'analisi della migrazione a lunga distanza e il test sulla migrazione co-culturale hanno utilizzato un inserto monogrado per sedare il numero desiderato di cellule al centro di un piatto rivestito di poli-L-ornina/laminina 35 mm. Il giorno 0, le celle erano presenti come patch rettangolare (Figura 2

Discussione

Qui, abbiamo descritto tre saggi in vitro che insieme forniscono una valutazione quantitativa delle proprietà endoteliali periventriculari umane. Questi saggi saranno preziosi per ottenere intuizioni meccanicistiche sull'interazione delle cellule endoteliali periventriculari umane con gli interneuroni umani. Gli esperimenti che utilizzano ligandi, inibitori o cellule con knockdown o sovraespressione specifici del gene identificheranno o convalideranno i giocatori molecolari che mediano la migrazione di interneuroni guida.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzione di dissociazione accutasi	Millipore Sigma	SCR005	Soluzione di dissociazione cellulare (per cellule endoteliali periventricolari, fase 1.4)
Anticorpo anti-umanoβ-tubulina	Biolegend	802001
Anticorpo anti-umano CD31 Anticorpo	Millipore Sigma	CBL468
Anti-MAP2 Anticorps	Neuromics	CH22103
Anticorpo anti-caspasi 3	Millipore Sigma	AB3623
Controllo delle cellule endoteliali umane	Dinamica cellulare	R1022
Controllo delle cellule endoteliali Integratore di terreno	Dinamica cellulare	M1019
Fiale criogeniche	Fisher Scientific	03-337-7Y
DMEMF/12 medio	Thermofisher Scientific	11320033
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
E6 medio	Thermofisher Scientific	A1516401
FGF2	Thermofisher Scientific PHG0261
Fibronectina	Thermofisher Scientific	33016-015
Contenitore di congelamento	Thermofisher Scientific	5100
GABA	Sigma-Aldrich	A2129
Ematocitometro	Sigma-Aldrich	Z359629
Neuroni GABAergici umani	Dinamica cellulare	R1013
Neuroni GABAergici umani media di base	Dinamica cellulare	M1010
Neurone GABAergico umano Integratore neurale	Dinamica cellulare	M1032
Laminin	Sigma	L2020
Matrigel	Corning	356230	Matrice a membrana seminterrato
Montaggio Medio	Laboratori vettoriali	H-1200
poli-L-ornitina	Sigma	p4957
PBS	Thermofisher Scientific	14190
Trypan blue	Thermofisher Scientific	15250061
TrypLE	Thermofisher 12563011		Soluzione di dissociazione cellulare (per interneuroni GABAergici e cellule endoteliali, sezioni 3 e 4)
VEGF-A	Peprotech	100-20
VascuLife VEGF Medium Kit completo	Lifeline Cell Technologies	LL-0003	Componente di controllo del terreno di coltura in silicone a 2 pozzetti per cellule endoteliali umane
- Inserto	ibidi	80209
silicone a 3 pozzetti Inserto per colture	ibidi	80369
Piastra da 35 mm	Corning	430165
Provetta conica da 15 ml	Fisher Scientific	07-200-886
Soluzione di PFA al 4%	Fisher Scientific	AAJ19943K2
Piastra per coltura tissutale a 6 pozzetti	Fisher Scientific	14-832-11
Microscopio a contrasto di fase invertito	Zeiss	Zeiss Axiovert 40C
Microscopio fluorescente	Olympus	FSX-100

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