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Articolo metodologico

Generazione di mutanti di eliminazione genica in-frame in Pseudomonas aeruginosa e test per l'attenuazione della virulenza in un semplice modello di infezione del mouse

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DOI:

10.3791/60297

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8 gennaio 2020

 ,  , 
1Progenesis Technologies, LLC, 2Department of Biomedical Sciences, Pediatrics, Joan C. Edwards School of Medicine at Marshall University

In questo articolo

Sommario

Qui, descriviamo un protocollo semplice e riproducibile del modello murino di infezione per valutare l'attenuazione dei ceppi geneticamente modificati di Pseudomonas aeruginosa rispetto alla Escherichia coli approvata dalla FDA (Food and Drug Administration) degli Stati Uniti per applicazioni commerciali.

Abstract

I microrganismi sono geneticamente versatili e diversificati e sono diventati una fonte importante di molti prodotti commerciali e biofarmaceutici. Anche se alcuni di questi prodotti sono prodotti naturalmente dagli organismi, altri prodotti richiedono l'ingegneria genetica dell'organismo per aumentare le rese di produzione. I ceppi avirulenti di Escherichia coli sono stati tradizionalmente le specie batteriche preferite per la produzione di prodotti biofarmaceutici; tuttavia, alcuni prodotti sono difficili da produrre per E. coli. Pertanto, ceppi avirulenti di altre specie batteriche potrebbero fornire alternative utili per la produzione di alcuni prodotti commerciali. Pseudomonas aeruginosa è un batterio Gram-negativo comune e ben studiato che potrebbe fornire un'alternativa adatta a E. coli. Tuttavia, P. aeruginosa è un patogeno umano opportunistico. Qui, dettagliamo una procedura che può essere utilizzata per generare ceppi non patogeni di P. aeruginosa attraverso eliminazioni genomiche sequenziali utilizzando il plasmide pEX100T-NotI. Il vantaggio principale di questo metodo è quello di produrre una deformazione senza marcatori. Questo metodo può essere utilizzato per generare ceppi P. aeruginosa altamente attenuati per la produzione di prodotti commerciali, o per progettare ceppi per altri usi specifici. Descriviamo anche un modello murino semplice e riproducibile di infezione sistemica batterica tramite iniezione intraperitoneale di ceppi di prova convalidati per testare l'attenuazione del ceppo geneticamente ingegnerizzato rispetto al ceppo BL21 approvato dalla FDA di E. coli.

Introduzione

Pseudomonas aeruginosa è un patogeno batterico opportunistico che può causare malattie potenzialmente letali nell'uomo, specialmente nell'immunocompromesso. La patogenicità di P. aeruginosa è dovuta all'espressione di molti fattori di virulenza, tra cui proteasi e lipopolisaccharide, così come la sua capacità di formare un biofilm protettivo1. A causa della sua capacità di produrre fattori di virulenza e causare malattie negli esseri umani, utilizzando P. aeruginosa per fare prodotti commerciali presenta problemi di sicurezza. I ceppi non patogeni di E. coli sono stati tradizionalmente utilizzati per bioingegnerizzare prodotti medici e commerciali per uso umano. Tuttavia, alcuni prodotti sono difficili da fare per E. coli, e molti sono confezionati in corpi di inclusione, rendendo l'estrazione laboriosa. Ceppi batterici ingegnerizzati con la capacità di fare e secernere prodotti specifici è altamente auspicabile, in quanto la secrezione probabilmente aumenterebbe i processi di purificazione della resa e della facilità. Pertanto, i ceppi non patogeni di altre specie di batteri (ad esempio, specie che utilizzano più percorsi di secrezione) possono fornire alternative utili a E. coli. Recentemente abbiamo riportato lo sviluppo di un ceppo di P. aeruginosa, PGN5, in cui la patogenicità e la tossicità dell'organismo è altamente attenuata2. È importante sottolineare che questo ceppo produce ancora grandi quantità di polisaccharide alginata, una componente commercialmente interessante del biofilm P. aeruginosa.

Il ceppo PGN5 è stato generato utilizzando una procedura di scambio allelico in due fasi con il plasmid pEX100T-NotI per eliminare in sequenza cinque geni (toxA, plcH, phzM, wapR, aroA) noti per contribuire alla patogenicità dell'organismo. pEX100T-NotI è stato generato cambiando il SmaI in un sito di riconoscimento degli enzimi di restrizione NotI all'interno del sito di clonazione multipla del pEX100T pEX100T, sviluppato nellaboratorio3,4di Herbert Schweizer. Il sito di riconoscimento per l'enzima di restrizione NotI è una sequenza di DNA più rara rispetto a SmaI e meno probabilità di essere presente nelle sequenze clonate, quindi è più conveniente per scopi di clonazione. Il plasmide porta geni che consentono la selezione, compreso il gene bla, che codifica la lattamasi e conferisce resistenza alla carbenicillina, e il gene B. subtilissacB, che conferisce sensibilità al saccarosio (Figura 1A). Il plasmide porta anche un'origine di replica (ori) compatibile con E. coli, e un'origine di trasferimento (oriT) che permette il trasferimento di plasmide da E. coli alle specie di Pseudomonas attraverso la coniugazione. Tuttavia, il plasmide manca di un'origine di replica compatibile con Pseudomonas, e quindi non può replicare all'interno di specie Pseudomonas (cioè, è un vettore suicida Pseudomonas). Queste caratteristiche rendono pEX100T-NotI ideale per colpire le delezioni genetiche dal cromosoma Pseudomonas. Le fasi di clonazione plasmide vengono eseguite utilizzando E. coli e il plasmide risultante viene trasferito a Pseudomonas per trasformazione o coniugazione. Quindi, attraverso eventi di ricombinazione omologhi e passaggi selettivi, viene generata l'eliminazione in-frame mirata, senza marcatori. Questo metodo di eliminazione sequenziale delle regioni genomiche dal cromosoma di P. aeruginosa potrebbe essere utilizzato per generare ceppi Pseudomonas altamente attenuati, come PGN5, o per progettare ceppi per altri usi specifici (ad esempio, ceppi carenti in endonuclesi per la propagazione plasmida o ceppi carenti nelle proteasi per la produzione di proteine di interesse).

La virulenza complessiva dei ceppi di batteri è influenzata dalle condizioni di crescita e dalle fasi, durante le quali le mutazioni si verificano frequentemente. Pertanto, misurare la sicurezza dei ceppi geneticamente progettati può essere difficile. Per valutare gli isolati batterici per la virulenza sistemica, abbiamo adattato un protocollo di infezione pubblicato in precedenza mediante iniezione intraperitoneale di topi C57BL/65. Abbiamo modificato questa procedura per utilizzare gli stock batterici congelati per l'iniezione, che ha permesso un dosing preciso e una facile convalida dei ceppi utilizzati. In questo modello, il ceppo E. coli BL21, approvato dalla FDA per la produzione di prodotti biofarmaceutici, è stato utilizzato come standard di sicurezza di controllo per determinare la patogenesi relativa del ceppo6,7,8. Il vantaggio principale dell'utilizzo di questo metodo è che è riproducibile e riduce al minimo le fonti di variazione, in quanto i ceppi infettanti sono convalidati per il numero di cellule batteriche, il fenotipo e i marcatori genetici sia prima che dopo l'infezione. Con questi passaggi controllati, il numero di animali necessari è ridotto. In questo modello, i ceppi di P. aeruginosa che provocano C57BL/6 tassi di mortalità murina uguali o inferiori a E. coli BL21 quando iniettati intraperitonealmente possono essere considerati attenuati. Questo semplice modello murino di infezione può anche essere utilizzato per valutare la patogenicità attenuata dei ceppi geneticamente ingegnerizzati di altre specie utilizzando il ceppo E. coli approvato dalla FDA come riferimento. I passaggi da 1 a 7 descrivono in dettaglio la generazione di eliminazioni genomiche sequenziali in P. aeruginosa (Figura 1) e i passaggi 8-12 dettagliano l'uso di un modello murino per testare la patogenicità dei ceppi P. aeruginosa.

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Protocollo

Prima di iniziare gli esperimenti sugli animali, il protocollo da utilizzare deve essere approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC). L'approvazione per il protocollo descritto è stata ottenuta attraverso l'IACUC presso la Marshall University (Huntington, WV, USA).

1. Progettazione Plasmid

  1. Per generare una delezione genetica utilizzando il plasmide pEX100T-NotI, clonare le regioni di DNA che fiancheggiano la sequenza di delezione desiderata e inserirle nel sito di restrizione NotI del plasmide. L'inserto plasmide deve contenere circa 500 nucleotidi a monte della sequenza di destinazione direttamente adiacente a circa 500 nucleotidi a valle della sequenza di eliminazione di destinazione. Inoltre, l'inserto deve contenere la sequenza di riconoscimento NotI (GCGGCCGC) alle estremità 5' e 3 ' (Figura 1B).

2. Preparazione Plasmid

  1. Opzione 1: utilizzare le procedure di clonazione tradizionali. Utilizzare la PCR per amplificare le regioni genomiche a monte e a valle del gene di interesse, seguita dal crossover PCR9,10 per unire i frammenti generati, la digestione endonuclease restriction del prodotto PCR e del plasmide e la legatura11 ( Figura1B,C).
  2. Opzione 2: Dopo aver progettato la sequenza di eliminazione in silico, contraere un'azienda che de novo la sintetizza per inserirla nel pEX100T-NotI. Molte aziende hanno semplificato il processo di clonazione per generare in modo rapido ed efficiente il plasmid di interesse. Inoltre, la sequenza verifica che i plasmidi siano privi di mutazioni prima della consegna.

3. Trasformazione di E. coli

  1. Trasformare e. coli elettrocompetente con il plasmide secondo le raccomandazioni del produttore. Utilizzando un anello sterile di inoculazione, striscia di 10 l della reazione di trasformazione per le colonie isolate su una piastra di agar Preriscaldata Luria Broth (LB) integrata con 100 g/mL di carbenillina e incubare durante la notte a 37 gradi centigradi.
    NOTA: Tutte le attrezzature e i mezzi utilizzati per i batteri di coltura devono essere trattati secondo le linee guida di sicurezza dell'istituto.
  2. Passaggio due volte.
    1. Rimuovere la piastra dall'incubatrice e identificare una colonia isolata. Utilizzando un anello sterile di inoculazione, raccogliere la colonia e strisciare una piastra preriscaldata LB agar integrato con 100 g / mL di carbenicillina per colonie isolate. Incubare per tutta la notte a 37 gradi centigradi. Ripetere questo passaggio ancora una volta per generare una cultura pura.
  3. Utilizzando un anello sterile inoculante, inoculare 5 mL di LB con una singola colonia dalla piastra finale di agar. Collocare la coltura in un'incubatrice agitante a 37 gradi durante la notte. Il giorno successivo, mescolare 1 mL di questa coltura con 1 mL del 5% in un crioviale e conservare a -80 s C per generare uno stock congelato del ceppo.

4. Preparazione del ceppo batterico e coniugazione triparentale

  1. Utilizzare una singola colonia isolata dalle piastre di agar delle seguenti varietà per inoculare colture di brodo e mettere in un'incubatrice tremante durante la notte a 37 gradi centigradi.
    1. Aggiungere E. coli pEX100T-NotI in 5 mL di LB integrati con 100 g/mL di carbenicillina.
    2. Aggiungere il ceppo P. aeruginosa PAO1 a 5 mL di Pseudomonas Isolation Broth (PIB).
    3. Aggiungere E. coli prk2013 in 5 mL di LB integrato con 50 g/mL di kanamicicina.
      NOTA: Il plasmide prk2013 è un platino che si replica in E. coli ma non P. aeruginosa; porta i geni di trasferimento trans-azione che mobilitano il plasmide pEX100T-NotI dal donatore di E. coli al ricevente P. aeruginosa 12. P. aeruginosa è un agente patogeno di livello di biosicurezza 2 (BSL-2). Si prega di seguire le linee guida dell'istituzione per la sicurezza quando si lavora con organismi BSL-2.
  2. Il giorno successivo, rimuovere le colture notturne dall'incubatrice e aggiungere 0,5 mL di ogni coltura a un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL. Centrifuga a 6.000 x g per 5 min. Scartare il supernatante e sospendere il pellet cellulare in 50-100 l l di LB.
  3. Pipette l'intera sospensione cellulare in una goccia su una piastra preriscaldata LB Agar. Lasciare asciugare la gocciolina. Quindi invertire la piastra e incubare a 37 gradi centigradi per 4-6 h.
  4. Dopo l'incubazione, utilizzare un ciclo di inoculazione sterile per raccogliere le cellule in 1 mL di LB in un tubo di microcentrifuga. Pipette su e giù per mescolare le cellule.
  5. Utilizzando uno spalmatore cellulare, le cellule di streak uniformemente su una piastra secca preriscaldata Pseudomonas Isolation Agar (PIA) integrata con 300 g/mL di carbenicillina. Streak più lastre con volumi crescenti della miscela cellulare (ad es., 10 .L, 100 l, 500 l). Incubare per tutta la notte a 37 gradi centigradi.

5. Rilevamento di ricombinanti a crossover di P. aeruginosa

  1. Rimuovere le piastre dall'incubatrice e ispezionare le colonie isolate resistenti alla carbenicillina. Poiché il plasmidp pEX100T-NotI non può replicarsi in P. aeruginosa, le colonie che sono cresciute su piastre con federate di carbenicillina dovrebbero essere sorte da cellule in cui il plasmide è stato integrato nel cromosoma.
    1. Scegli almeno 4 di queste colonie e striscia per l'isolamento su piastre preriscaldate di PIA integrata con 300 g/mL di carbenicillina. Incubare le piastre durante la notte a 37 .
  2. Togliere le piastre dall'incubatrice e ispezionare la crescita. Le colonie resistenti alla carbenicillina dovrebbero essere ricombinanti a crossover (cioè hanno incorporato il plasmide nel cromosoma attraverso un evento di ricombinazione tra una regione omologa dell'inserto plasmico e il cromosoma di P. aeruginosa).
    1. Patch 8 o più colonie con stuzzicadenti sterili su piastre preriscaldate di: 1) PIA integrato con 300 g/mL di carbenicillin e 2) PIA integrato con 300 g/mL di carbenicillina e 10% di saccarosio (senza glicerolo).
    2. Se non è stata ottenuta alcuna crescita della colonia dal punto 5.1, ripetere la coniugazione e aumentare il volume della miscela cellulare striata nel passaggio 4.5. Se si è verificata troppa crescita, ripetere la coniugazione e diminuire il volume striato.
    3. Se la coniugazione fallisce ripetutamente, preparare le cellule elettrocompetenti del ceppo P. aeruginosa e trasformarsi direttamente con il plasmide pEX100T-NotI. Protocolli dettagliati per la preparazione di elettrocompetente P. aeruginosa e la trasformazione sono disponibili altrove13,14.
  3. Incubare le piastre a 37 gradi durante la notte.
  4. Togliere le piastre dall'incubatrice e ispezionare la crescita. I veri ricombinanti a crossover saranno resistenti alla carbenicillina e sensibili al saccarosio (cioè colonie che sono cresciute sulla PIA completate con carbenicillina, ma non sono cresciute sulla PIA integrata con carbenicillina e saccarosio).
    1. Scegliere 4 o più veri ricombinanti single-crossover e inoculare ciascuno in 5 mL di LB senza selezione. Incubare in un'incubatrice agitazione a 37 gradi durante la notte.
    2. Se non sono stati rilevati ricombinanti a crossover singolo, ripetere la coniugazione.

6. Rilevamento di ricombinanti a doppio crossover di P. aeruginosa

  1. Per ogni coltura di brodo, inoculare 10 anni di coltura su una piastra preriscaldata di PIA integrata con 10% di saccarosio (senza glicerolo) e striscia per colonie isolate. Incubare le piastre durante la notte a 37 .
  2. Il giorno successivo, rimuovere le piastre dall'incubatrice e ispezionarle per la crescita. Le colonie resistenti al saccarosio devono essere ricombinanti a doppio crossover (cioè hanno rimosso il plasmide dal cromosoma attraverso un evento di ricombinazione tra l'altra regione omologa dell'inserto plasmide e il cromosoma P. aeruginosa).
    1. Metti in piedi almeno 20 colonie con stuzzicadenti sterili su piastre preriscaldate di: 1) PIA, 2) PIA integrate con 10% di saccarosio (senza glicerolo) e 3) PIA completate con 300 g/mL di carbenicillina.
  3. Incubare le piastre durante la notte a 37 .
  4. Rimuovere le piastre dall'incubatrice ed esaminarle per la crescita. I veri ricombinanti a doppio crossover saranno sensibili alla carbenicillina e resistenti al saccarosio (cioè colonie che sono cresciute su PIA e PIA completate con saccarosio, ma non sono cresciute su PIA completate con carbenicillina).

7. Conferma eliminazione del gene tramite Colony PCR

  1. Preparare 10-20 colonie per una schermata di cancellazione con PCR.
    1. Raccogliere la crescita da un sospetto ricombinante a doppio crossover con uno stuzzicadenti sterile e sospendere le cellule in 50 -L di 1x fosfato buffered salina (PBS). Bollire la sospensione a 100 gradi centigradi per 10 min, centrifugare per 3 min a 13.000 x g, quindi mettere sul ghiaccio.
  2. Eseguire PCR per le colonie di schermo per la cancellazione mirata.
    1. Utilizzare 1 l' del supernatante come modello in una reazione PCR 25 l per confermare la cancellazione del gene di interesse.
    2. Utilizzare primer specifici genici che amplificano la regione della delezione genomica. Utilizzare i primer che amplificano la regione della cancellazione genomica più 100-200 bp di linee di fianco a monte e a valle.
    3. Preparare un controllo separato della reazione PCR con la deformazione principale (ad esempio, PAO1).
      NOTA: Le condizioni del termociclore variano a seconda della temperatura di annealing ottimale per le coppie di primer, del cocktail di polimerasi utilizzato e della lunghezza della regione da amplificare.
  3. Eseguire l'elettroforesi gel agarose sui prodotti PCR. Le colonie in cui la regione di interesse è stata eliminata producono prodotti di amplificazione più piccoli rispetto alle colonie che non dispongono della delezione (Figura 2).
  4. Scegli una o più colonie con la delezione confermata da PCR. Streak per colonie isolate su una piastra PIA preriscaldata e incubare a 37 gradi centigradi durante la notte.
  5. Passaggio almeno un'altra volta. Rimuovere le pelli dall'incubatrice e identificare una colonia isolata. Utilizzando un anello sterile inoculante, raccogliere la colonia e strisciare una piastra di agar PIA preriscaldato per colonie isolate. Incubare per tutta la notte a 37 gradi centigradi.
  6. Scegli una colonia da ogni piatto finale e usala per inoculare 5 mL di PIB. Mettere in un incubatore agitazione a 37 gradi durante la notte.
    1. Mescolare 1 mL di questa coltura con 1 mL di 5% di latte scremato in una crioviale e conservare a -80 s C per generare uno stock di ceppo.
    2. Utilizzando questa coltura, preparare il DNA genomico dal ceppo (ad esempio, utilizzando un kit di purificazione del DNA). Amplifica la regione di eliminazione genomica usando PCR e primer specifici per la regione di interesse.
      1. Purificare questi prodotti PCR (ad esempio, con un kit di purificazione del DNA o l'estrazione del fenolo cloroformio) e sequenziare direttamente con i primer specifici del gene o migate in un vettore per il sequenziamento con primer specifici del plasmide.
  7. Dopo che la delezione genica è stata confermata tramite il sequenziamento, ripetere questa procedura con il nuovo ceppo di delezione per generare in sequenza numerose eliminazioni genomiche prive di marcatori. Quando viene generato il ceppo desiderato, utilizzare il sequenziamento dell'intero genoma per verificare le delezioni mirate e per rilevare altri cambiamenti nel genoma (rispetto al ceppo di riferimento, ad esempio PAO1) che si sono verificati durante il processo. Dopo aver annotato i geni, depositare la sequenza su GenBank e registrare i numeri di adesione.

8. Preparazione della deformazione batterica per i test sugli animali

  1. Per testare la patogenicità attenuata dei ceppi P. aeruginosa, prepara prima colture e stock convalidati. Preparare i ceppi di Interesse P. aeruginosa, un ceppo di tipo selvaggio di P. aeruginosa (virulento), e un ceppo di E. coli approvato dalla FDA (ad esempio, BL21) per fungere da controllo di sicurezza non patogeno.
  2. Streak i ceppi dei batteri sottoposti a test sull'agar selettivo da scorte congelate sequenziate e convalidate. Incubare a 37 gradi durante la notte.
  3. Con un ciclo sterile di inoculazione, prendi di nuovo una singola colonia da ogni ceppo e striscia per colonie isolate su supporti selettivi. Incubare a 37 gradi durante la notte.
  4. Rimuovere le piastre dall'incubatrice. Per ogni ceppo, scegli una singola colonia e una striscia per l'isolamento sulle piastre LB.
  5. Dopo 24 h di crescita a 37 gradi centigradi, inoculare un flacone di 500 mL contenente 250 mL di LB con una singola colonia isolata da ogni ceppo.
    1. Fase di convalida: utilizzando i resti della stessa colonia, convalidare il ceppo utilizzando PCR e primer specifici del ceppo e/o primer per verificare la presenza di modifiche genetiche apportate al ceppo. Utilizzare i numeri di prima necessità riportati di seguito per la verifica dei ceppi nell'esempio presentato:
      E. coli BL21:
      Polimerasi T7 F:TGGCTATCGCTAATGCTCTCTCTTACG
      Polimerasi T7 R:TTACGCGAACGCGAAGTCC

      VE2 e PGN5:
      aroA F: GCGAACGCCAACACCGATAAGC
      aroA R: ATCTGGCTGCGATGCCGGTCC
  6. Incubare le colture in un incubatore agitazione a 160 giri/min e 37 gradi centigradi fino a raggiungere la crescita della fase di log (ad esempio, la misurazione OD600 di 0,4-0,6 su uno spettrofotometro).
  7. Utilizzando il valore OD600 ottenuto al raggiungimento della fase di registrazione, calcolare il volume di brodo necessario per produrre 2,5 x 109 unità formanti colonia (CFU) per mL. Pellet il volume di brodo calcolato in tubi da 50 mL a 4.500 x g per 10 min.
  8. Scartare il supernatante e risospendere il pellet in un tubo utilizzando 50 mL di 1x PBS per lavare le cellule. Centrifuga di nuovo a 4.500 x g per 10 min.
  9. Scartare il supernatante e risospendere nuovamente il pellet in 25 mL di latte scremato del 5% in 1x PBS.
    1. Fase di convalida: Utilizzare un campione della sospensione di 25 mL per eseguire conteggi di lamiere praticabili per determinare il numero di CFU/mL.
  10. Aliquota la risospensione della coltura del latte skim da 25 mL in 2 mL in criovials da 2 mL. Congelare in azoto liquido e conservare a -80 gradi centigradi almeno durante la notte prima dell'uso.

9. Convalida della crescita e della deformazione delle scorte immagazzinate per i test sugli animali.

  1. Per ogni ceppo da testare, rimuovere almeno 3 crioviali di scorte congelate da -80 gradi centigradi e scongelare a 4 gradi centigradi per 2-4 h. Se rimane un supporto congelato, scaldare brevemente a 37 gradi centigradi.
  2. Prelevare piccoli campioni da ogni crioviale per convalidare ogni ceppo.
    1. Eseguire conteggi di piastre praticabili per determinare il numero di CFU/mL. È normale avere meno CFU /mL dopo il congelamento, a causa della morte di alcune cellule batteriche.
    2. Utilizzare PCR e primer specifici della deformazione per convalidare ogni ceppo.
    3. Streak ogni ceppo sul supporto selettivo per verificare il fenotipo.
  3. Dopo aver confermato che i ceppi sono del genotipo e del fenotipo corretti e aver convalidato la CFU/mL, procedere alla sperimentazione animale.

10. Inoculazione di animali con ceppi batterici per iniezione

  1. La mattina delle iniezioni, rimuovere i crioviali dei ceppi batterici sottoposti a test e scongelare a 4 gradi centigradi per 3-4 h. Thaw 0,5 mL per ogni topo che verrà iniettato. Tenere le fiale sul ghiaccio dopo lo scongelamento e iniettare i topi entro 2 h.
  2. Dopo lo scongelamento, trasferire ogni crioviale in un nuovo tubo da 2 mL e centrifugare a 4.500 x g per 10 min, eliminare il supernatante e sospendere nuovamente il pellet cellulare in 1 mL di 1x PBS.
  3. Centrifuga di nuovo a 4.500 x g per 10 m. Scartare supernatante e resospendere pellet in 1x PBS ad una concentrazione finale 2,5 x 109 CFU/mL. Per determinare la quantità di 1x PBS necessaria per la sospensione, utilizzare i dati CFU/mL ottenuti da conteggi di lastre praticabili sulle scorte congelate al punto 2.2.1. L'esatta quantità di 1x PBS utilizzata varia leggermente tra i ceppi.
    1. Prelevare 3 campioni dalla sospensione finale di ogni ceppo per convalidare CFU/mL, genotipo e fenotipo come descritto sopra.
  4. Per ogni ceppo, aliquota 1,5 mL di pbS / sospensione cellulare in un tubo 2 mL per 5 topi per limitare il numero di volte in cui il tubo viene inserito. Inoltre, preparare tubi di 1x PBS per iniezioni di controllo.
  5. Raccogli i topi (10 c57BL/6 femmine per gruppo per questo esperimento) e i materiali necessari per le iniezioni (siringhe, aghi, contenitori taglienti, marcatori, penna e carta, ecc. Spostati nella sterile sala operatoria degli animali. Pulire tutte le superfici con salviette igienizzanti.
    1. Per eliminare il disagio e il rischio di lesioni allo sperimentatore, portare solo un sesso e un gruppo sperimentale di topi in sala chirurgica alla volta (ad esempio, un gruppo di 10 topi maschi da infettare con un particolare ceppo). Indossare due paia di guanti di lattice per eliminare la puntura dei guanti se morso. Indossare camice da laboratorio, occhiali di sicurezza e maschera per il viso per evitare la contaminazione.
  6. Iniziare le iniezioni del gruppo di controllo con 1x PBS. Ciò accerta se eventuali effetti negativi derivano solo dall'iniezione.
    1. Rimuovere un mouse dalla gabbia. Rimuovere solo un mouse alla volta.
    2. Pesare il mouse e contrassegnare la coda con marcatore permanente per tenere traccia per la perdita di peso dopo l'iniezione.
    3. Aprire una nuova siringa da 1 mL e un ago da 27 G (utilizzare una nuova siringa e un ago per ogni mouse per eliminare la contaminazione) e iniettare 200 lun di sterile 1x PBS.
      1. Afferrare il mouse dietro le orecchie utilizzando il pollice e l'indice. Pizzica per creare la piega della pelle alla nuca per aggrapparsi - una piega più stretta riduce il movimento del collo e il rischio di essere morso durante l'iniezione. Coda sicura nel palmo della mano usando il mignolo per tenere il mouse piatto con poco movimento.
      2. Girare il mouse e inserire ago ad angolo di 30 gradi nella cavità peritoneale sul lato sinistro o destro della linea mediana. Sollevare leggermente l'ago una volta inserito per assicurarsi che sia stato inserito nell'area intraperitoneale e non negli organi. Iniettare lentamente il PBS e quindi ritirare l'ago.
      3. Posizionare l'ago usato in un contenitore di taglienti biohazard designato. Non riutilizzare la siringa o l'ago. Un bolo nel sito di iniezione è tipico.
    4. Dopo l'iniezione, spostare il mouse in una gabbia separata.
    5. Ripetere la procedura con il mouse successivo. Dopo che tutti i topi di una gabbia vengono iniettati, riportarli immediatamente alla gabbia originale.
  7. Dopo aver iniettato il gruppo di controllo, iniziare a iniettare sospensioni di ceppi da testare seguendo la stessa procedura.
    1. Iniettare 200 l della sospensione cellulare. Quando si inizia con sospensioni cellulari di 2,5 x 109 CFU/mL, ogni mouse riceve 5 x 108 CFU.
      NOTA: Queste concentrazioni sono state ottimizzate con la ricerca animale preliminare per determinare le dosi letali di ogni ceppo. Potrebbe essere necessario regolare il dosso per altri ceppi/specie.
  8. Una volta completate tutte le iniezioni, riportare i topi nella stanza dell'alloggiamento per alleviare il disagio. Pulire l'area di lavoro con salviette igienizzanti.
  9. Monitorare gli animali per la mortalità dopo l'iniezione controllando le gabbie per i topi morti ogni 3 h per 72 h e ogni 12 h per 10 giorni. Registrare il peso dei topi ogni 12 h per determinare la perdita di peso a causa di malattia.
  10. Registrare il comportamento avverso nelle ore successive all'iniezione, come la differenza di postura, la mancanza di toelettatura o la tana, l'immobilità o i cambiamenti nella respirazione. I topi che deceduto da lesioni associate all'iniezione mostreranno un comportamento avverso e muoiono rapidamente dopo l'iniezione. D'altra parte, i topi che decomvengono dall'infezione non inizieranno a mostrare comportamenti avversi o morte fino a dopo 18 h. Tutti i topi che presentano comportamenti avversi o segni estesi di morbilità, tra cui respirazione rapida o lavorata, immobilità, postura ansimante, occhi infossati, grave disidratazione o altri devono essere eutanasia per ridurre le sofferenze inutili (come protocolli IACUC approvati). Tuttavia, nei nostri esperimenti, l'eutanasia non era necessaria per i topi durante l'esperimento. I topi sopravvissuti sono stati eutanasia 10 giorni dopo il completamento dei test.
  11. Dopo il periodo di monitoraggio di 10 giorni, consentire agli animali rimanenti di recuperare completamente e diventare chiaro da qualsiasi infezione somministrata durante il test. Animali eutanasi secondo la procedura IACUC.

11. Analisi statistica della mortalità animale

  1. Eseguire analisi statistiche utilizzando un software di grafica. Qualsiasi software in grado di produrre grafici ed eseguire analisi statistiche è adatto.
  2. Per tracciare i dati sulla mortalità, utilizzare la colonna X per rappresentare il tempo (h) e la colonna Y per rappresentare i gruppi testati.
  3. Rappresentare ogni mouse o soggetto nello studio utilizzando il codice 0 (zero) o il codice 1, indicando rispettivamente la sopravvivenza o la morte.
    1. Per ogni animale che muore, posiziona un 1 nella colonna Y di quel gruppo al momento della morte sulla colonna X. Se sono presenti più decessi in un singolo punto temporale all'interno di un gruppo, una copia di tale punto temporale può essere inserita nella colonna X. Ad esempio, se tre soggetti all'interno di un gruppo muoiono a 3 h, il punto temporale di 3 h apparirà tre volte nella colonna X.
    2. Per tutti gli animali sopravvissuti all'interno di un gruppo, inserire uno zero nella colonna Y nel punto temporale finale misurato. Ad esempio, se quattro mouse sopravvivono, posizionate quattro punti temporali finali nella colonna X contrassegnati con quattro zeri nella colonna Y.
  4. Dopo aver immesso i dati sugli animali per tutti i gruppi, utilizzare un modello di grafico di sopravvivenza per produrre un grafico di sopravvivenza.
    1. Lasciare la codifica predefinita su 0 e 1.
    2. Impostare i parametri per il grafico come percentuale.
  5. Una volta selezionati i parametri per la curva di sopravvivenza, eseguire l'analisi statistica utilizzando un test Mantel-Cox (log rank).
  6. Formattare i grafici Kaplan-Meier utilizzando dati statistici.
    NOTA: I ceppi che presentano tassi di mortalità inferiori o uguali al ceppo principale e il ceppo approvato dalla FDA (ad esempio, E. coli BL21) possono essere considerati attenuati.

12. Visualizzazione dell'infezione da bioluminescenza

  1. Per visualizzare l'avanzamento dell'infezione, inserire un operone cromosomico bioluminescente (luxCDABE) nel ceppo PGN5 e VE2 testato. I plasmidi e il protocollo utilizzati per etichettare questi ceppi sono stati sviluppati nel laboratorio Schweizer e potrebbero non essere compatibili con tutte le specie/ceppi di batteri13. È importante sottolineare che la visualizzazione dell'infezione è facoltativa; pertanto, l'inserimento genomico di questo operone non è necessario per eseguire lo studio sulla mortalità descritto in precedenza.
  2. Preparare e convalidare i ceppi utilizzando il metodo descritto in precedenza. Inoltre, verificare la bioluminescenza nei ceppi etichettati in ogni fase di convalida.
  3. Dopo aver preparato i ceppi, iniettare gli animali in gruppi di 10 con i ceppi bioluminescenti seguendo i passaggi precedenti.
  4. Immagina gli animali ogni 3 h per 24 h utilizzando un sistema di imaging animale in grado di bioluminescenza.
    1. In primo luogo preparare l'imager impostando i parametri della fotocamera e riscaldando il palco per gli animali. Impostare anche il flusso di ossigeno su 1,5 L per min (o seguendo le raccomandazioni del produttore).
    2. Dopo che l'imager e lo stadio sono stabilizzati, mettere un topo nella camera di anestesia subito dopo l'iniezione e somministrare 3,5% isoflurane nella camera con flusso O2 per circa 4 min. I metodi di anestesia possono variare a seconda della camera e/o dell'agente anestetico utilizzato; seguire le raccomandazioni del produttore. Determinare l'anestesia corretta tramite il test di riflesso di ritiro.
    3. Spostare il mouse sullo stadio stabilizzato a temperatura. Posizionare il mouse sulla schiena con le braccia tese e montare il mouse con un cono naso per la somministrazione del 2,5% isoflurane durante tutta la procedura di imaging.
    4. Chiudi la porta e scatta immagini bioluminescenti e raggi X del mouse.
    5. Una volta completata l'imaging, riportare il mouse alla sua gabbia e monitorarlo. Il topo dovrebbe riprendere conoscenza entro 3-5 min.
    6. Continuare a visualizzare i mouse ogni 3 h per 24 h, ogni volta utilizzando un mouse diverso da ogni gruppo. Non riimmaginare un topo entro 24 h a causa della possibilità di effetti avversi dovuti alla riesposizione all'anestesia. Un singolo topo deve ricevere una sola dose di anestesia ogni 24-36 h. Pulire la piattaforma di imaging dopo l'immagine di ogni mouse. Disattivare l'imager tra i punti temporali di imaging.
      NOTA: La bioluminescenza svanirà, indipendentemente dal ceppo iniettato. L'intensità e la longevità della bioluminescenza variano a seconda di molti fattori, tra cui il numero di batteri iniettati, ceppo di topo, ceppo batterico, ecc.

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Risultati

Come mostrato nella Figura 2, la cancellazione genomica mirata può essere confermata utilizzando colonia PCR con primer specifici che amplificano la regione di interesse. Le colonie che portano una delezione genomica produrranno una dimensione più breve della banda PCR rispetto alle colonie di tipo selvaggio. Uno schermo PCR di 10-12 colonie è di solito sufficiente per rilevare almeno una colonia che porta la delezione mirata. Se dopo più turni di schermate n...

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Discussione

Il plasmide pEX100T-Not1 è un efficiente mediatore di eliminazioni genomiche sequenziali prive di marcatori e in-frame. Quando si ingegnerizzano ceppi batterici per la virulenza attenuata, la delezione di intere sequenze geniche piuttosto che la generazione di mutazioni puntiformi riduce la probabilità di ritorno a un fenotipo virulento. Inoltre, ogni delezione genica patogenicity attenua ulteriormente l'agente patogeno, rafforzando la stabilità dell'attenuazione.

Questo metodo può essere util...

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Dichiarazioni

L'autore Hongwei D. Yu è Chief Science Officer e co-fondatore di Progenesis Technologies, LLC.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dai National Institutes of Health (NIH) sovvenzioni R44GM113545 e P20GM103434.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provette da 0,2 mL con tappi piattiThermoScientificAB-0620via Fisher Scientific
Siringa da 1 mLBD22-253-260via Fisher Scientific
Cuvetta monouso in polistirene da 1,5 mL FisherScientific 14955127
Provette per microcentrifuga da 1,5 mLFisher Scientific05-408-129
Fiale criogeniche da 2,0 mLCorning430659tramite Fisher Scientific
Ago 27GBD14-821-13Btramite Fisher Scientific
Provette da 50 mLFisher Scientific05-539-13tramite Fisher Scientific
Accu block Bagno a secco digitaleLabnetNC0205808tramite Fisher Scientific
Centrifuga da banco 5804REppendorf04-987-372tramite Fisher Scientific
Microcentrifuga da bancoSorvall75-003-287tramite Fisher Scientific
Incubatoreper armadio VWR1540
Carbenicillina sale disodicoFisher Scientific
, polistireneFisher Scientific14-956-6Dtramite Fisher Scientific
Anelli di inoculazione monousoFisher Scientific22-363-597
Kit microbico Dneasy UltraClean (50)Qiagen12224-50o metodo/fornitore preferito
E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50)Omega bio-tekD6493-01o metodo/fornitore preferito
EcoRI-HF, endonucleasi di restrizioneNew England BioLabsR3101L
Cuvette per elettroporazioneBulldog BioNC0492929via Fisher Kit di
legatura del DNA Scientific FastLink IIEpicentre TechnologiesLK6201Htramite Fisher Scientific
Gentamycin SulfateFisher ScientificBP918-1
GliceroloFisher ScientificBP229-4
GoTaq G2 Mastermix incolorePromegaM7833tramite Fisher Scientific
Isothesia IsofluraneHenry Schein Salute animale29405
IVIS Lumina XRMS Serie III Sistema di imaging in vivoPerkins and ElmerCLS136340
Kanamicina monosolfatoFisher ScientificBP906-5
LE agarosioGenemate3120-500via Fisher Scientific
Luria BrodoDifco240230via Fisher Scientific
MicroPulser ElettroporatoreBioRad1652100
agar nobile, ultrapuroAffymetris/USBAAJ10907A1via Fisher Scientific
NotI-HF, endonucleasi di restrizioneNew England BioLabsR3189
One Shot TOP10 Electrocomp E. coliInvitrogenC404052via Fisher Scientific
Polveresalina tamponata con fosfatoSigmaP3813-10PAKSigma-Aldrich
Prism 7GraphPadhttps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
Pseudomonas isolamento agarDifco292710tramite Fisher Scientific
Pseudomonas isolamento brodoAlpha BiosciencesP16-115Lotto su misura
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)Qiagen27106o metodo/fornitore preferito
Incubatore a scuotimentoNew Brunswick ScientificInnova 4080a 200 giri/min
SimpliAmp TermociclatoreApplied BiosystemsA24811
Latte scrematoDifcoDF0032-17-3via Fisher Scientific Piccole
piastre (100 O.D. x 10 mm)Fisher ScientificFB0875713
SmartSpec Plus SpettrofotometroBio-Rad170-2525o metodo/fornitore
preferito SaccarosioFisher ScientificS5-500
Stuzzicadenti, rotondoDiamantemarca di stuzzicadenti, autoclavato
TOPO TA Kit di clonazione, per la sequenza.Invitrogen45-0030
XAF-8 Perkinsand Elmer118999
XGI 8 Pinza per sistema di anestesia a gasScienze della vita/Xenogeno
Provetta per colture BP2648250 Qualsiasi Filtri per sistema di anestesia

Riferimenti

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