Isolamento e differenziazione dei mioblasti primari dagli esopanti muscolari scheletrici del topo

Sommario

I mioblasti stanno proliferando cellule precursori che si differenziano per formare miotubi polinucleati e infine mitole muscolari scheletriche. Qui, presentiamo un protocollo per un isolamento efficiente e la cultura dei mioblasti primari dai muscoli scheletrici dei topi giovani adulti. Il metodo consente studi molecolari, genetici e metabolici delle cellule muscolari in coltura.

Abstract

I mioblasti primari sono precursori indifferenziati della proliferazione del muscolo scheletrico. Possono essere coltivati e studiati come precursori muscolari o indotti a differenziarsi nelle fasi successive dello sviluppo muscolare. Il protocollo qui fornito descrive un metodo robusto per l'isolamento e la coltura di una popolazione altamente prolifera di cellule mioblaste da espeamanti muscolari scheletrici di topi giovani adulti. Queste cellule sono utili per lo studio delle proprietà metaboliche del muscolo scheletrico di diversi modelli murini, così come in altre applicazioni a valle come la trasfezione con DNA esogeno o la trasduzione con vettori di espressione virale. Il livello di differenziazione e profilo metabolico di queste cellule dipende dalla durata dell'esposizione e dalla composizione dei supporti utilizzati per indurre la differenziazione del mioblasto. Questi metodi forniscono un sistema robusto per lo studio del metabolismo delle cellule muscolari del topo ex vivo. È importante sottolineare che, a differenza dei modelli in vivo, i metodi qui descritti forniscono una popolazione cellulare che può essere ampliata e studiata con alti livelli di riproducibilità.

Introduzione

Mentre spesso citato come un'indicazione della salute metabolica generale, più studi hanno dimostrato che l'indice di massa corporea (BMI) negli adulti più anziani non è costantemente associato con un rischio più elevato di mortalità. Ad oggi, l'unico fattore dimostrato di essere coerente con la mortalità ridotta in questa popolazione è l'aumento della massa muscolare¹. Il tessuto muscolare rappresenta una delle più grandi fonti di cellule sensibili all'insulina nel corpo, ed è quindi fondamentale nel mantenimento dell'omeostasi metabolica complessiva². L'attivazione del tessuto muscolare scheletrico tramite esercizio fi....

Protocollo

Questo protocollo segue le linee guida per la cura degli animali di Scripps Research.

1. Raccolta e trattamento di espiante di tessuto muscolare

1. Il giorno prima della dissezione, sterilizzare tutte le attrezzature di dissezione (forza, lame di rasoio e forbici) e preparare tutti i supporti necessari: fosfato bufferizzato salina (PBS), MB Plating media (12,5 mL di DMEM, 12,5 mL di HAMS F12, 20 mL di bovini siero (FBS), 5 mL di integratore medio liquido amniotico), e soluzione di rivestimento (24 mL di DMEM, 24 mL di HAMS F12, 1,7 mL di collagene, 1 mL di matrigel).
2. Il giorno della dissezione, rivestire un piatto di 6 cm c....

Risultati

La sezione 1 del protocollo fornito dovrebbe produrre cellule primarie che emergono dagli espianti che saranno visibili al microscopio luminoso standard (Figura 2). Una popolazione cellulare eterogenea sarà visto crescere da e circondare ogni espianto di tessuto muscolare. I mioblasti appariranno come piccole sfere rotonde e luminose. Seguendo la Sezione 2 del protocollo produrrà raccolti precoci di mioblasti da espianti tissutali, che conterranno poche cellu.......

Discussione

Il muscolo scheletrico è vitale per l'istituzione e il mantenimento dell'omeostasi metabolica¹¹. Lo studio della fisiologia muscolare è complicato dalla variabilità interindividuale, così come la difficoltà nell'ottenere campioni, in particolare nel caso di studi umani. Miotubes primari coltivati hanno dimostrato di ricapitolare molte caratteristiche della fisiologia muscolare, tra cui l'omeostasi di calcio¹², rigenerazione del tessuto muscolare danneggiato

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzione di rivestimento:
DMEM	Gibco	10569010	Aggiungere sempre gentamicina (1:1.000 in volume) prima dell'uso; 24 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	Aggiungere sempre gentamicina (1:1.000 in volume) prima dell'uso; 24 mL
Collagen	Life Technologies	A1064401	1,7 mL
Matrigel	Fisher	CB40234A	1 mL
Terreni di placcatura:
DMEM	Gibco	10569010	Aggiungere sempre gentamicina (1:1.000 in volume) prima dell'uso; 12,5 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	Aggiungere sempre gentamicina (1:1.000 in volume) prima dell'uso; 12,5 mL
16000044			FBS Life Technologies inattivato a caldo20 ml; può essere acquistato come normale FBS e inattivato a caldo inserendo in un 40 ° C bagnomaria per 20 minuti
Amniomax	Life Technologies	12556023	5 mL
Myoblast Media:
DMEM	Gibco	10569010	Aggiungere sempre gentamicina (1:1.000 in volume) prima dell'uso; 17,5 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	Aggiungere sempre gentamicina (1:1.000 in volume) prima dell'uso; 17,5 mL
Calore FBS	Life Technologies	16000044	10 mL; può essere acquistato come FBS normale e inattivato a caldo inserendo in un flacone da 40 ° C bagnomaria per 20 min
Amniomax	Life Technologies	12556023	5 mL
Differenziazione Terreni:
DMEM	Gibco	10569010	Aggiungere sempre gentamicina (1:1.000 in volume) prima dell'uso; 24 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	Aggiungere sempre gentamicina (1:1.000 in volume) prima dell'uso; 24 mL
di calore Siero di cavallo inattivato	Sigma	H1138	1,5 mL
insulina-selenio-transferrina	Life Technologies	41400045	0,5 mL
Altri materiali:
PBS	Gibco	14040133
Gentamicina	Sigma	G1397
TrypLE	Gibco	12604013
DMSO	Sigma	472301	Preparare al 10% DMSO in Myoblast Terreni per celle di congelamento
Pinze	Qualsiasi
Lamette da barba	Qualsiasi
Forbici	Qualsiasi
carta Whatman	VWR	21427-648
Piastra da 60 mm	VWR	734-2318
Piastra da 10 cm	VWR	25382-428 (CS)
Palloni T25	ThermoFisher	156367
Palloni T75	Provette da	ThermoFisher 156499
(15 mL)	BioPioneer	CNT-15
Tassi di consumo di ossigeno:
Analizzatore di cavallucci marini XFe96	Analizzatore Agilent	di cavalluccio marino XFe96	Strumento utilizzato per misurare i tassi di consumo di ossigeno letti mediante acidificazione del terreno extracellulare
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	102416-100	Piastre a 96 pozzetti per l'uso nell'analizzatore XFe96
componenti del kit per test da sforzo Seahorse XF Cell Mito	Agilent	103015-100	possono essere acquistati da altri fornitori una volta stabilito il test; alcune raccomandazioni sono elencate di seguito
Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate	Agilent	102720-100	possono essere acquistati da altri fornitori una volta stabilito il test; alcune raccomandazioni sono elencate di seguito
Acido palmitico	Sigma	P5585-10G	per la misurazione dell'ossidazione degli acidi grassi
Carnitina	Sigma	C0283-5G	per la misurazione dell'ossidazione degli acidi grassi
Etomoxir	Sigma	E1905	per la misurazione dell'ossidazione degli acidi grassi
BSA	Sigma	A7030	utilizzato come controllo o in coniugazione con acido palmitico per l'uso nella misurazione dell'ossidazione degli acidi grassi

in inattivato di centrifuga I I componenti