Isolamento e differenziazione dei mioblasti primari dagli esopanti muscolari scheletrici del topo

Mentre spesso citato come un'indicazione della salute metabolica generale, più studi hanno dimostrato che l'indice di massa corporea (BMI) negli adulti più anziani non è costantemente associato con un rischio più elevato di mortalità. Ad oggi, l'unico fattore dimostrato di essere coerente con la mortalità ridotta in questa popolazione è l'aumento della massa muscolare¹. Il tessuto muscolare rappresenta una delle più grandi fonti di cellule sensibili all'insulina nel corpo, ed è quindi fondamentale nel mantenimento dell'omeostasi metabolica complessiva². L'attivazione del tessuto muscolare scheletrico tramite esercizio fisico è associata ad aumenti sia nella sensibilità all'insulina locale che nella salute metabolica generale³. Mentre i modelli in vivo sono essenziali per studiare la fisiologia muscolare e l'impatto della funzione muscolare sul metabolismo integrato, le colture primarie dei miotubi forniscono un sistema trattabile che riduce la complessità degli studi sugli animali.

I mioblasti derivati dai muscoli post-natali possono essere utilizzati per studiare l'impatto di numerose condizioni di trattamento e crescita in modo altamente riproducibile. Questo è stato a lungo riconosciuto e diversi metodi per l'isolamento del mioblasto e la cultura sono stati descritti^4,5,6,7,8^,9. Alcuni di questi metodi utilizzano muscoli neoiatali e producono un numero relativamente basso di mioblasti^5,8, che richiedono diversi animali per studi su larga scala. Inoltre, i metodi più diffusi per coltivare i mioblasti utilizzano il "pre-placcatura" per arricchire per i mioblasti, che sono meno aderenti rispetto ad altri tipi di cellule. Abbiamo trovato il metodo di arricchimento alternativo descritto qui per essere molto più efficiente e riproducibile per arricchire una popolazione di mioblasti altamente proliferante. In sintesi, questo protocollo consente l'isolamento dei mioblasti altamente proliferanti dagli espianti muscolari giovani adulti, attraverso l'escrescenza in mezzi di coltura. I mioblasti possono essere raccolti ripetutamente, per diversi giorni, rapidamente espansi e indotti a differenziarsi in miotubi. Questo protocollo genera riproducibilmente un gran numero di cellule mioblaste sane che si differenziano robustamente in miotubi spontaneamente contraenti. Ci ha permesso di studiare il metabolismo e i ritmi circadiani nei miotubi primari di topi di una varietà di genotipi. Infine, includiamo metodi per preparare miotubi per lo studio del metabolismo ossidativo, utilizzando misurazioni dei tassi di consumo di ossigeno in piastre 96-well.

Questo protocollo segue le linee guida per la cura degli animali di Scripps Research.

1. Raccolta e trattamento di espiante di tessuto muscolare

1. Il giorno prima della dissezione, sterilizzare tutte le attrezzature di dissezione (forza, lame di rasoio e forbici) e preparare tutti i supporti necessari: fosfato bufferizzato salina (PBS), MB Plating media (12,5 mL di DMEM, 12,5 mL di HAMS F12, 20 mL di bovini siero (FBS), 5 mL di integratore medio liquido amniotico), e soluzione di rivestimento (24 mL di DMEM, 24 mL di HAMS F12, 1,7 mL di collagene, 1 mL di matrigel).
2. Il giorno della dissezione, rivestire un piatto di 6 cm con Soluzione di rivestimento per ogni muscolo da sezionare. Aggiungere 2 mL di soluzione di rivestimento alla superficie di ogni piastra, agitare delicatamente per creare un rivestimento uniforme sulla superficie e incubare le piastre con soluzione a 4 gradi centigradi per 1 h.
3. Rimuovere la soluzione di rivestimento dalle piastre e tornare alla soluzione di riserva.
   NOT: La soluzione di rivestimento può essere riutilizzata per un massimo di sei mesi e deve essere conservata a 4 gradi centigradi.
4. Sciacquare le piastre due volte con 2 mL di PBS per rimuovere il collagene non legato e il matrigel.
5. Collocare le piastre in un'incubatrice a coltura tissutale di 37 gradi centigradi durante le dissezioni.
6. Preparare una camera umida mettendo 2-3 fogli di carta assorbente spessa in un sacchetto di plastica o in un piatto sterile di 15 cm e utilizzare una pipetta per bagnare la superficie della carta con acqua sterile.
7. Posizionare la camera sotto la luce UV per 5 min per sterilizzare.
8. Dissect muscoli desiderati da un 4 a 8 settimane vecchio topo. Per sterilizzare il tessuto muscolare, risciacquare delicatamente in PBS contenente 40 g/mL gentamicin.
   NOT: Per i muscoli quadricipiti e gastrocnemius, piastra un muscolo per piastra. Per sole, plantari ed EDL, combinare i muscoli di entrambe le gambe in un unico piatto.
9. Utilizzare pinze sterili per trasferire il muscolo in una parabola Petri sterile di 10 cm non rivestita. Aggiungere 0,5-1,0 mL di supporti di placcatura sul muscolo in modo che il tessuto sia umido ma non galleggiante (Figura 1A).
10. Utilizzare un bisturi sterile o una lama di rasoio per affettare delicatamente il muscolo in piccoli frammenti (circa 1-3 mm³).
    NOT: È importante ridurre al minimo la gestione del tessuto muscolare per ottenere i migliori risultati.
11. Utilizzare pinze o una pipetta per trasferire i frammenti muscolari sulla superficie di una piastra pre-rivestita di 6 cm. Sovrapposizione molto delicata di un ulteriore 0,8 mL di Plating Media sul tessuto. Ci dovrebbe essere abbastanza supporti per mantenere i pezzi di tessuto idratati ma non galleggianti (Figura 1B).
12. Posizionare i piatti di 6 cm contenenti i frammenti muscolari all'interno della camera umida e tornare a un'incubatrice (37 , 5% CO₂) per 48 h (Figura 1C).
    NOT: È fondamentale che i frammenti muscolari aderiscano alla superficie della piastra per consentire la crescita del mioblasto. Non spostare le piastre/camera per almeno 48 h.
13. Dopo 48 h, controllare attentamente le piastre per assicurarsi che i frammenti muscolari abbiano aderito. Sovrapposizione con 2 mL di Plating Media, facendo attenzione a non spostare i frammenti.
    NOT: Se c'è contaminazione visibile o detriti sulle piastre, lavare con cura i pezzi muscolari. Piastra 2 mL di soluzione PBS/gentamicin sul bordo della piastra e punta delicatamente per lavare sopra il tessuto muscolare. Rimuovere il PBS e ripetere la fase di lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, sovrapporre 2 mL di Plating Media.
14. Conservare le piastre nell'incubatrice da 37 gradi centigradi per altri 3 giorni (5 giorni dalla dissezione originale) prima di raccogliere i mioblasti. Controllare ogni altro giorno per la crescita di mioblasti.
    NOT: La comparsa di cellule che emergono dagli espianti muscolari sarà variabile ed eterogenea. I mioblasti primari appaiono come piccole, rotonde e luminose. Tuttavia, non è né necessario né affidabile identificarli in base al loro aspetto in questa fase (Figura 2).

2. Raccogliere Myoblasts In crescita

1. Preparare e preriscaldare Myoblast Media (17,5 mL di DMEM, 17,5 mL di HAMS F12, 10 mL di FBS, 5 mL di integratore medio liquido amniotico), trypsin e PBS/gentamicin. Cappotto una fiaschetta T25 per gruppo muscolare raccolto con Soluzione di rivestimento e come descritto nel passaggio 1.2 (vedere la tabella 1).
2. Rimuovere Plating Media e sciacquare delicatamente gli esplants muscolari con 2 mL di PBS/gentamicin. Rimuovere rapidamente PBS (risciacquare una piastra alla volta e non lasciare che la piastra si sieda in PBS in questo passaggio).
3. Aggiungere delicatamente 1 mL di PBS/gentamicin e posizionare la piastra nell'incubatrice a 37 gradi centigradi per 1 min.
4. Utilizzare una pipetta P1000 per raccogliere PBS/cellule in un tubo di centrifuga da 15 mL.
5. Aggiungete 1 mL di cipina alla piastra e tornate all'incubatrice da 37 gradi per 3 min. Raccogliere la metapina/celle e combinarle con la raccolta PBS. Aggiungere 8 mL di Myoblast Media al tubo di centrifuga e invertire delicatamente per mescolare.
6. Sovrappone delicatamente 2 mL di Soluzione di placcatura sulle piastre muscolari e tornate all'incubatrice a 37 gradi centigradi.
7. Girare i tubi di centrifuga contenenti cellule in una centrifuga per 3 min a 200 x g.
8. Aspirare il supernatante a 1 mL, facendo attenzione a evitare pellet cellulare. Aggiungete delicatamente Myoblast Media (cfr. tabella 1)e trasferite le cellule sul pallone pre-rivestito e posizionatelo nell'incubatrice a 37 gradi centigradi. Questo è il raccolto P0. Se osservate al microscopio, ci possono essere pochissime cellule (Figura 3).
9. Ripetere il raccolto descritto sopra ogni altro giorno fino a tre volte. Dopo il terzo raccolto, scartare gli espianti.

3. Espansione e arricchimento dei myoblasti proliferanti

NOT: Il raccolto di P0 sarà eterogeneo (60% di mioblasti). I successivi 2 passaggi utilizzano PBS per raccogliere in modo selettivo i mioblasti. Molte delle cellule più aderenti saranno lasciate indietro e i mioblasti che proliferano rapidamente saranno puri del 95% entro 2 passaggi. Una volta stabiliti, i mioblasti devono essere mantenuti a bassa densità per evitare la differenziazione spontanea.

1. Per ogni fiaschetta T25 di cellule confluenti del 40-50% della sezione 2, rivestire una fiaschetta T75 con 5 mL di soluzione di rivestimento e posizionarla a 4 gradi centigradi per 1-4 h.
2. Rimuovere la soluzione di rivestimento dai flaconi e tornare alla soluzione di riserva. Sciacquare i flaconi due volte con 2 mL di PBS/gentamicin e metterli nell'incubatrice a 37 gradi centigradi.
3. Aspirare i media da P0 myoblast T25 flaconi. Sciacquare brevemente le cellule con 2 mL di PBS/gentamicina calda. Aspirare PBS dal flacone.
   NOT: Lo scopo di questo passaggio (3.3) è quello di ridurre la possibilità di contaminazione batterica. Se eseguito rapidamente e delicatamente, non dovrebbe provocare la perdita di mioblasti. Può essere omesso per massimizzare la conservazione del mioblasto, se lo si desidera.
4. Pipette 2 mL di PBS caldo (non trypsin) in ogni fiaschetta contenente mioblasti. Collocare i flaconi con PBS nell'incubatrice a 37 gradi centigradi per 3 min.
   NOT: I mioblasti dovrebbero staccarsi facilmente dai flaconi con PBS. L'utilizzo di PBS anziché della trypsin in questa fase è fondamentale per ridurre la contaminazione della popolazione di mioblasti con altri tipi di cellule.
5. Rimuovere le cellule dall'incubatrice a 37 gradi centigradi e toccare con fermezza il lato dei flaconi per sloggiare le cellule. Controllare al microscopio leggero per mioblasti galleggianti liberamente.
6. Posizionare i flaconi in posizione verticale in una cappa di coltura tissutale e risciacquare il fondo dei flaconi con 10 mL di Myoblast Media 2-3 volte per garantire che tutte le cellule siano spostate.
7. Raccogliere la miscela di cellule/supporti in un tubo di centrifuga da 15 mL. Centrifuga per 3 min a 200 x g.
8. Aspirare il supporto a circa 1 mL, facendo attenzione a evitare il pellet cellulare. Aggiungere delicatamente un volume appropriato di Myoblast Media per centrifugare il tubo e mescolare delicatamente.
9. Distribuire la miscela cellulare ai nuovi flaconi T75. Aggiungete 10 mL di Myoblast Media a ogni nuova fiaschetta T75. Agitare delicatamente i flaconi orizzontalmente per distribuire le cellule e mettere nell'incubatrice a 37 gradi durante la notte.
10. Due giorni dopo, passa ancora una volta con PBS, dividendo ogni flacone T75 in tre flaconi T75.
    NOT: Non permettere che i mioblasti diventino più del 50%-60% di confluente, in quanto ciò li farebbe sì che inizino a differenziarsi e perdano la capacità di prolifaterive.
11. Per passaggi aggiuntivi, utilizzare trypsin. Passaging due volte con rese PBS >95% mioblasti; i tentativi di migliorare ulteriormente la purezza tendono a tradursi in una differenziazione più scarsa.

4. Differenziazione dei mioblasti primari ai miotubi

1. I mioblasti di piastra P2 (o passaggio successivo) in Myoblast Media su piastre rivestite (vedere la tabella 1 per i volumi di rivestimento e placcatura suggeriti e i numeri di cella). Due o tre giorni dopo, quando le cellule sono al 70-80% di confluenza, cambiare il supporto in Supporto di differenziazione (24 mL di DMEM, 24 mL di HAMS F12, 1,5 mL di calore inattivato siero di cavallo, 0,5 mL di insulino-selenio-Transferrin).
2. Cambia i media di differenziazione a giorni alterni durante la differenziazione dei mioblasti primari in miotubi. La differenziazione è in genere completata dal giorno 4-5 e sarà contrassegnata da cellule sfuse allungate che si contraeno spontaneamente. Esegui esperimenti su miotubi differenziati entro 6 giorni. Tipicamente le cellule vengono modellate cinque o sei giorni dopo l'avvio della differenziazione.

5. Misurazione del consumo di ossigeno in mioblasti o miotubi in piastre da 96 pozze

1. Cappotto 96 pozzetti con 25 -L di soluzione di rivestimento per pozzo. Centrifugare le piastre a 58 x g per 1 min per rimuovere eventuali bolle.
2. Incubare le piastre in una soluzione di rivestimento per 1-4 h a 4 gradi centigradi. Utilizzare la pipetta multicanale per rimuovere la soluzione di rivestimento e lavare tre volte in 25 gradi di PBS/gentamicin freddo. Centrifuga almeno uno di questi lavamenti per garantire che non ci siano bolle intrappolate.
3. Aggiungete 40 l di supporti di differenziazione ad ogni pozzo. Centrifugare il supporto sulla piastra rivestita senza cellule per 1 min a 58 x g per evitare bolle e rimuovere la tensione superficiale per ottenere uno strato uniforme di supporto.
4. Aggiungere le celle sospese in altri 40 gradi di supporto ad ogni pozzo. Girare di nuovo a 58 x g.
   NOT: La coerenza nella placcatura è importante per i migliori risultati e il numero di cellule placcate per pozzo dovrebbe essere ottimizzato per ogni configurazione sperimentale, e sarà probabilmente nella gamma di 10.000-25.000 mioblasti placcati in mezzi di differenziazione per pozzo di una piastra di 96 pozzetti.
5. Cambiare delicatamente il supporto ogni giorno durante la differenziazione. Non aspirare i media, ma rimuoverlo con una pipetta, lasciando un piccolo volume dietro per evitare di sloggiare le cellule o di espole in aria. Ad esempio, sostituire 50 l alla volta per tre ripetizioni anziché tutti gli 80 l contemporaneamente.
6. Utilizzare 8-15 pozzi per condizione. Potrebbe essere necessario omettere alcuni pozzi se le cellule non formano uno strato uniforme di miotubi.
   NOT: Omettere pozzi sui bordi della piastra perché sono altamente suscettibili all'evaporazione. Variare la configurazione della piastra per le repliche sperimentali per evitare errori sistematici.
7. Eseguire il saggio desiderato su miotubi differenziati entro 1-2 giorni di piena differenziazione (giorno 4-6 dall'inizio della differenziazione). Gli strumenti e i reagenti raccomandati per la misurazione dei tassi di consumo di ossigeno sono elencati nella Tabella dei Materiali.

La sezione 1 del protocollo fornito dovrebbe produrre cellule primarie che emergono dagli espianti che saranno visibili al microscopio luminoso standard (Figura 2). Una popolazione cellulare eterogenea sarà visto crescere da e circondare ogni espianto di tessuto muscolare. I mioblasti appariranno come piccole sfere rotonde e luminose. Seguendo la Sezione 2 del protocollo produrrà raccolti precoci di mioblasti da espianti tissutali, che conterranno poche cellule e saranno eterogenei (Figura 3). La sezione 3 del protocollo descrive i raccolti precoci con PBS (piuttosto che la trypsin), che fornirà una popolazione relativamente pura di mioblasti per ulteriori colture. Seguendo la sezione 4 del protocollo si produrrà miotubi completamente differenziati per ulteriori manipolazioni sperimentali. La differenziazione dei mioblasti richiede in genere 4-6 giorni, durante i quali la morfologia delle cellule cambierà da singole sfere rotonde a fibre multinucleate lunghe, allungate e lunghe (Figura 4). Seguendo la sezione 5 del protocollo produrrà miotubi differenziati in piastre 96-well per consentire una varietà di caratterizzazioni metaboliche basate sui cambiamenti nel consumo di ossigeno e tassi di acidificazione extracellulare10 (Figura 5).

Figura 1: Dissezione e lavorazione del muscolo quadricipite. (A) Muscolo quadriceps che è stato appena sezionato e sciacquato con PBS prima del trasferimento in un piatto di 10 cm. 1 mL di supporti di placcatura è stato sovrapposto per la lavorazione. (B) Quadriceps pezzi di tessuto muscolare dopo il trasferimento alla piastra pre-rivestita 6 cm. (C) piastre di 6 cm all'interno della camera umida prima del posizionamento nell'incubatrice a 37 gradi centigradi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Escrescenza dei mioblasti. La crescita dei mioblasti dagli espedii muscolari del quadricipite. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Mioblasti di passaggio precoce. P0 mioblasti dopo il trasferimento e l'attaccamento al flacone T25. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: placcatura e differenziazione dei miotubi primari. (A) Il mioblasto un giorno dopo l'avvio dell'esposizione ai supporti di differenziazione. (B, C) Miotubi differenziati cinque (B) o sei (C) giorni dopo l'avvio della differenziazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Miotubi pronti per la misurazione dei tassi di consumo di ossigeno. Miotubi completamente differenziati cinque giorni dopo la placcatura di 20.000 mioblasti in Diversivo Media in ogni pozzo di una micropiastra di coltura cellulare 96-well. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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