Questo protocollo fornisce ai ricercatori un metodo rapido e indiretto per misurare l'attività del fattore di trascrizione NF-B-B/AP-1 dipendente da TLR in una linea cellulare murina di macrofaci in risposta a una varietà di superfici polimeriche e strati proteici adzuolabili che modellano il microambiente implantare biomateriale.
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Articolo metodologico
Un analisi della cella del Macrophage Reporter per esaminare la segnalazione NF-kB/AP-1 mediata da un rata a tollo su superfici polimetiche
In questo articolo
Sommario
Abstract
La persistente risposta infiammatoria all'uso di un biomateriale impiantato, noto come reazione del corpo estraneo, è una sfida significativa nello sviluppo e nell'implementazione di dispositivi biomedici e costrutti di ingegneria tissutale. I macrofagi, una cellula immunitaria innata, sono attori chiave nella reazione del corpo estraneo perché rimangono nel sito dell'impianto per tutta la durata del dispositivo e sono comunemente studiati per comprendere questa risposta dannosa dell'ospite. Molti ricercatori di biomateriali hanno dimostrato che gli strati proteici adsorbiti sui materiali impiantati influenzano il comportamento dei macrofafi e successivamente influenzano la risposta dell'ospite. I metodi di questo documento descrivono un modello in vitro utilizzando strati proteici adsorbiti contenenti molecole di danno cellulare su superfici biomateriali polimeriche per valutare le risposte dei macrofagi. Una linea cellulare di macrofasi reporter nF-B/AP-1 e l'addetto altest alcalino metrico sono stati utilizzati come metodo rapido per esaminare indirettamente l'attività del fattore di trascrizione NF-B/AP-1 in risposta a complessi strati proteici adsorbiti contenenti proteine ematiche e modelli molecolari associati ai danni, come modello dei complessi strati proteici adsorbenti formati sulle superfici biomateriali in vivo.
Introduzione
La reazione del corpo estraneo (FBR) è una risposta cronica dell'ospite che può influire negativamente sulle prestazioni di un materiale o dispositivo impiantato (ad esempio, dispositivi di somministrazione di farmaci, biosensori), attraverso il rilascio persistente di mediatori infiammatori e impedendo l'integrazione tra il materiale impiantato e il tessuto circostante1. Questa risposta immunitaria innata è iniziata dalla procedura di impianto ed è caratterizzata dalla presenza a lungo termine di cellule immunitarie innate e formazione di capsule fibrose intorno all'impianto1. Nel contesto delle risposte materiali dell'....
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Protocollo
1. Preparazione dei supporti e dei reagenti
- Preparare i supporti fibroblasti. Unire 450 mL di Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), 50 mL di siero bovino fetale (FBS) e 5 mL di penicillina/streptomicina. Conservare a 4 gradi centigradi per un massimo di 3 mesi.
- Preparare i media di crescita del macrofago reporter in aliquote da 50 mL. Unire 45 mL di DMEM, 5 mL di FBS, 5 reagente di eliminazione del micoplasma/mL(Tabella dei materiali) e 200 fleomycin D1 (Tabella dei materiali). Conservare a 4 gradi centigradi per un massimo di 3 mesi.
- Preparare reporter macrophage saggio media in 50 mL aliquots. Unire ....
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Risultati
Sono stati testati metodi di pulizia per le superfici rivestite di polimeri per garantire che non vi fosse alcuna interruzione del rivestimento, che sarebbe stato visto come un cambiamento dell'angolo di contatto con l'acqua a una vetrina di vetro non rivestita (Figura 2). L'immergenza di vetrini al microscopio rivestiti pmMA in 70% etanolo per 1 h è stato trovato per rimuovere il rivestimento PMMA (Figura 2, pannello sinistro), probabilmente a causa della solub.......
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Discussione
Uno degli obiettivi principali del nostro laboratorio è la risposta dell'ospite agli impianti di tessuti molli biomateriali solidi, e in particolare il modo in cui il danno cellulare subito durante la procedura di impianto influisce sulla risposta dell'ospite. Il lavoro qui presentato descrive gli esperimenti preliminari utilizzando una linea cellulare del macrofago reporter e il lisa cellulare contenente DAMP generato in vitro, per studiare l'influenza delle molecole rilasciate durante i danni cellulari (cioè dalla chir.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori riconoscono con gratitudine il finanziamento operativo del Canadian Institutes of Health Research Project (PTJ 162251), del Queen's University Senate Advisory Research Committee e del sostegno alle infrastrutture della Canadian Foundation for Innovation John Evan's Leadership Fund (Project 34137) e del Ministry of Research and Innovation Ontario Research Fund (Progetto 34137). L.A.M. è stato sostenuto da una Queen's University R. Samuel McLaughlin Fellowship, da un Natural Sciences and Engineering Research Council del Canada Canadian Graduate Scholarship Master's Award e da una borsa di studio Ontario Graduate. Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Myron....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagenti per colture cellulari | |||
| anti-topo/umano CD282 (TLR2) | Biolegend | 121802 | |
| CLI-095 (inibitore TLR4) | Invivogen | TLRL-CLI95 | |
| C57 complemento plasma K2 EDTA 10ml, grado innovativo di origine statunitense | Innovative Research | IGMSC57-K2 EDTA-Compl-10ml | Plasma di topo |
| Terreno dell'aquila modificato di Dulbecco (DMEM) | Sigma Aldrich | D6429-500ML | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbco (DPBS) | Fisher Scientific | 14190250 | Senza calcio, senza magnesio |
| Siero fetale bovino (FBS), grado di ricerca | Wisent | 98150 | |
| LPS-EK | Invivogen | TLRL-EKLPS | Lipopolisaccaride da Escherichia coli K12 |
| Fibroblasti NIH/3T3 | ATCC | CRL-1658 | |
| Pam3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | Lipopeptide triacilato sintetico - ligando TLR1/2 |
| Penicillina/streptomicina | Sigma Aldrich | P4333-100ML | |
| Plasmocin | Invivogen | ANT-MPP | Reagente per l'eliminazione del micoplasma |
| RAW-Blue cells | Invivogen | raw-sp | NF-κ Linea cellulare di macrofagi reporter B/AP-1 |
| Soluzione di blu di tripano, 0,4% | Fisher Scientific | 15250061 | |
| Enzima espresso di TrypLE (1X) | Fisher Scientific | 12604021 | Enzima di dissociazione cellulare ricombinante privo di origine animale |
| Zeocin | Invivogen | ANT-ZN-1 | |
| Kit e saggi | |||
| Piastre prerivestite ELISA, piastre prerivestite IL-6 | Biolegend | B213022 | |
| ELISA di topo, TNF-&alpha di topo; | Biolegend | B220233 | |
| Endotossina (Escherichia coli) - Controllo standard endotossina (CSE) | Associates di Cape Cope Inc. | E0005-5 | Endotossina per curva standard nel saggio dell'endotossina cromogenica |
| LAL acqua, 100 ml | Associates of Cape Cope Inc. | WP1001 | Utilizzato con il test dell'endotossina cromogenica |
| Saggio della proteina Micro BCA | Fisher Scientific | ||
| pirocromo lisato di amebociti (LAL) Associati | di Cape Cope Inc. | C1500-5 | Reagente per il dosaggio dell'endotossina cromogenica |
| QUANTI-Blue Terreno di rilevamento della fosfatasi alcalina | Invivogen | rep-qb2 | Dosaggio della fosfatasi alcalina per misurare indirettamente NF-κ B/AP-1 attività |
| Reagenti di rivestimento polimerici | |||
| Cloroformio, anidro | Sigma Aldrich | 288306-1L | |
| Alcool etilico anidro | Alcoli commerciali | P006EAAN | Sigma: Alcool reagente, anidro, 676829-1L |
| Pinze diritte a punta fine affusolata | Fisher Scientific | 16-100-113 | |
| Solvente Fluorinert FC-40 | Sigma Aldrich | F9755-100ML | Solvente fluorurato per fPTFE |
| Acqua per colture cellulari (senza endotossine) | Fisher Scientific | SH30529LS | |
| Poli(metilmetacrilato) (PMMA) | Sigma Aldrich | 182230-25G | |
| Sylgard 184 kit di elastomeri | Fisher Scientific | 50822180 | |
| Teflon-AF (fPTFE) | Sigma Aldrich | 469610-1G | Poli[4,5-difluoro-2,2-bis(trifluorometil)-1,3-diossole-co-tetrafluoroetilene] |
| Consumabili | |||
| Guarnizioni per piastre adesive | Fisher Scientific | AB-0580 | |
| Microprovette Axygen, 1,5 mL | Fisher Scientific | 14-222-155 | |
| Fiale a scintillazione in vetro borosilicato, con tappi in polipropilene bianco | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| Piastra PS a 48 pozzetti trasparente | Fisher Scientific | 08-772-52 | |
| Piastra TCPS a 96 pozzetti trasparente | Fisher Scientific | 08-772-2C | |
| Piastra TCPS a 48 pozzetti | trasparente Fisher Scientific | 08-772-1C | |
| Copribicchieri, cerchi | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Flaconi trattati per colture tissutali Falcon, T25 | Fisher Scientific | 10-126-10 | |
| vetrini adesivi a 8 pozzetti | Ibidi | 80828 | |
| vetrini per microscopio Superfrost | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Fiasche trattate per colture tissutali, T150 | Fisher Scientific | 08-772-48 |
Riferimenti
- Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Seminars in Immunology. 20 (2), 86-100 (2008).
- Anderson, J. M., Miller, K. M. Biomaterial biocompatibility and the macrophage. Biomaterials. 5 (1), 5-10 (1984).
- Collier, T. O., Anderson, J. M.
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Ristampe e permessi
