Modellazione della geometria delle colonie di cellule staminali embrionali umane su substrati conformi per controllare la meccanica a livello di tessuto

Summary

I ligandi a matrice extracellulare possono essere modellati su idrogel di poliacrilammide per consentire la coltura di cellule staminali embrionali umane in colonie confinate su substrati conformi. Questo metodo può essere combinato con la microscopia a forza di trazione e i saggi biochimici per esaminare l'interazione tra la geometria dei tessuti, le forze generate dalle cellule e le specifiche del destino.

Abstract

Le cellule staminali embrionali umane dimostrano una capacità unica di rispondere ai morfogeni in vitro mediante modelli auto-organizzanti di specifiche del destino cellulare che corrispondono alla formazione primaria dello strato germinale durante l'embriogenesi. Così, queste cellule rappresentano un potente strumento con cui esaminare i meccanismi che guidano il primo sviluppo umano. Abbiamo sviluppato un metodo per la coltura di cellule staminali embrionali umane in colonie confinate su substrati conformi che fornisce il controllo sia sulla geometria delle colonie che sul loro ambiente meccanico al fine di ricapitolare i parametri fisici che embriogenesi. La caratteristica chiave di questo metodo è la capacità di generare idrogel di poliacrilammide con modelli definiti di legamento matrice extracellulare in superficie per promuovere l'attaccamento cellulare. Ciò si ottiene fabbricando stencil con i motivi geometrici desiderati, utilizzando questi stencil per creare modelli di ligando a matrice extracellulare su coperchi di vetro, e trasferendo questi modelli agli idrogel poliacrilamiti durante la polimerizzazione. Questo metodo è anche compatibile con la microscopia a forza di trazione, consentendo all'utente di misurare e mappare la distribuzione delle forze generate dalle cellule all'interno delle colonie confinate. In combinazione con i saggi biochimici standard, queste misurazioni possono essere utilizzate per esaminare il ruolo dei segnali meccanici nelle specifiche del destino e nella morfogenesi durante lo sviluppo umano precoce.

Introduction

Le cellule staminali embrionali umane (HESC) sono molto promettenti per l'uso nella medicina rigenerativa e nelle applicazioni di ingegneria tissutale. La natura pluripotente di queste cellule dà loro la capacità di differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula adulta. Mentre sono stati fatti grandi passi avanti nel dirigere il destino degli hESC verso particolari tipi di cellule, è rimasto molto difficile generare tessuti interi o organi de novo^1,2,3^{,4, 5}. Ciò è dovuto, in gran parte, ad una comprensione limitata dei meccanismi che guidano la formazione di questi tessuti durante lo sviluppo umano. Al fine di colmare questa lacuna nella conoscenza, negli ultimi anni sono emersi diversi metodi per modellare l'embrione precoce e le successive fasi di sviluppo con cellule staminali embrionali^{6,7,8,9 ,10,11,12,13}.

Poco dopo la derivazione delle prime linee hESC¹⁴, è stato dimostrato che i corpi embrionali formati da hESC erano in grado di produrre spontaneamente cellule dei tre strati germinali primari⁶. Tuttavia, a causa della mancanza intrinseca di controllo sulle dimensioni e la morfologia dei corpi embrionali, l'organizzazione degli strati germinali variava in modo significativo e non corrispondeva all'organizzazione dell'embrione precoce. Più recentemente, Warmflash ealtri ha sviluppato un metodo per confinare colonie di hESC su substrati di vetro tramite micropatterning, fornendo controllo e coerenza sulle dimensioni e la geometria delle colonie⁸. In presenza di BMP4, un importante morfogeno nello sviluppo iniziale, queste colonie confinate erano in grado di auto-organizzare modelli riproducibili di specificazione per i destini che rappresentano gli strati germinali primari. Anche se questo ha fornito un modello utile per studiare i meccanismi con cui vengono stabiliti gli strati germinali primari, i modelli di specifica del destino non corrispondevano esattamente all'organizzazione e alla morfogenesi osservate durante l'embriogenesi¹⁵. Una ricapitolazione più fedele dello sviluppo embrionale precoce è stata ottenuta incorporando hESC in una matrice extracellulare tridimensionale (ECM) di matrigel¹¹, fornendo la prova più forte fino ad oggi per la capacità degli hESC di auto-organizzarsi e modellare primi stadi dell'embriogenesi ex vivo. Tuttavia, questo metodo produce risultati incoerenti ed è quindi incompatibile con una serie di saggi che potrebbero essere utilizzati per rivelare i meccanismi sottostanti di auto-organizzazione e specifica del destino.

Dati questi metodi esistenti e le rispettive limitazioni, abbiamo cercato di sviluppare un metodo per la coltura riproducibil di hESC colonie di geometrie definite in condizioni che modellano l'ambiente extracellulare del primo embrione. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo usato idrogel di poliacrilammide di elasticità regolabile per controllare le proprietà meccaniche del substrato. Utilizzando la microscopia a forza atomica sugli embrioni di pollo in stadio di gasastrulation, abbiamo scoperto che l'elasticità dell'epiblasto variava da centinaia di pascal a pochi chilodi. Così, ci siamo concentrati sulla generazione di idrogel di poliacrilammide con elasticità in questa gamma per servire come substrato per le colonie hESC. Abbiamo modificato i nostri metodi precedenti per la coltura di hESC su idrogel poliacrilammide^7,9 per fornire un controllo robusto sulla geometria delle colonie. Abbiamo ottenuto questo modellando i ligandi ECM, vale a dire matrigel, su coperture in vetro attraverso stencil microfabbricati, come precedentemente riportato¹⁶. Abbiamo quindi progettato una nuova tecnica per trasferire il ligando modellato sulla superficie degli idrogel di poliacrilammide durante la polimerizzazione. Il metodo che qui descriviamo prevede l'utilizzo della fotolitografia per fabbricare un wafer di silicio con i motivi geometrici desiderati, creando timbri di tesi geometriche con polidimetilsiloxane (PDMS), e utilizzando questi francobolli per generare gli stencil che consentire infine la modellata del ligando sulla superficie di vetro coverslips e il trasferimento alla poliacrilammide.

Oltre a riassumere l'ambiente meccanico dell'embrione precoce, confinare le colonie di hESC sulla poliacrilammide consente la misurazione delle forze generate dalle cellule con la microscopia della forza di trazione (TFM), come riportato nel nostro metodo precedente⁹. In breve, le perle fluorescenti possono essere incorporate nella poliacrilammide e utilizzate come marcatori fiduciari. Le forze generate dalle cellule sono calcolate mediante l'imaging dello spostamento di queste perline dopo la semina di hESC sul substrato modellato. Inoltre, le mappe delle forze di trazione risultanti possono essere combinate con i saggi tradizionali, come l'immunostaining, per esaminare come la distribuzione delle forze generate dalle cellule nelle colonie hESC confinate possa regolare o modulare la segnalazione a valle. Ci aspettiamo che questi metodi rivelino che le forze meccaniche svolgono un ruolo critico nella modellina delle specifiche del destino cellulare durante lo sviluppo embrionale precoce che è attualmente trascurato.

Protocol

Tutti i metodi qui descritti relativi all'uso di hESC sono stati approvati dal comitato di ricerca sulle cellule staminali umane (GESCR) presso l'Università della California a San Francisco.

1. Preparazione del wafer di silicio con caratteristiche geometriche

1. Creare una fotomaschera con le entità geometriche desiderate. Utilizzare software di disegno assistito da computer per progettare le funzionalità. Per l'uso con il fotoresist negativo, rendete trasparenti le funzioni opache e il resto della maschera.
   NOTA: per la ripetizione su tratti di 18 mm di diametro, raggruppare le funzioni per ogni condizione sperimentale in aree 10 x 10 mm per garantire che gli stencil generati nel passaggio 3 si adattino ai coperchi.
2. Girare il cappotto fotoresist negativo su un wafer di silicio da 100 mm. Utilizzare la scheda dati fotoresist per determinare la velocità e la lunghezza di rotazione per generare uno spessore della pellicola di 100-250 m.
   NOTA: Lo spessore della pellicola deve essere regolato in modo che le proporzioni della larghezza dei modelli all'altezza dello stencil siano il più vicino possibile a 1:1. Tuttavia, si consiglia uno spessore minimo di 100 m, poiché meno produce stencil delicati che si strappano facilmente.
3. Elaborare la fotoresist in base alla scheda dati del prodotto. Questo comporta in genere una cottura morbida, esposizione ai raggi UV con fotomaschera in un aligner maschera, post-esposizione cuocere, sviluppo, e duro cuocere. Ad esempio, la procedura utilizzata per elaborare i wafer utilizzati in questo protocollo è descritta nella tabella 1.
   NOTA: Prestare attenzione quando si maneggiano wafer di silicio in quanto sono fragili. Una volta generati, i wafer possono essere utilizzati ripetutamente, purché non siano danneggiati.

2. Preparazione di copricoperture

1. Preparazione di coverlip "top" lavati con acido
   1. Posizionare 18 mm di diametro #1 copertura spessorein una parabola Petri di vetro. Il numero appropriato di coverlips dipende dalle dimensioni del piatto. Per un piatto da 100 mm, preparare 50-100 coverlips alla volta. Le quantità di volume fornite durante il resto di questa sezione corrispondono a un piatto da 100 mm.
   2. Aggiungere 20 mL di 1 M HCl al piatto Petri e scuotere delicatamente il piatto per disperdere i copricoproe. Assicurarsi che tutti i copricopertine siano sommersi e rilasciare bolle d'aria tra i copricopertine. Incubare pernottamento a temperatura ambiente con agitazione delicata.
      AVVISO: HCl è acido e corrosivo. Prestare attenzione e indossare un PPE appropriato mentre si lavora con HCl.
   3. Decant HCl dal piatto. Aggiungere 20 mL di acqua ultrapura e lavare con agitazione delicata per 10 min. Scartare l'acqua e ripetere per un totale di cinque lavaggi.
   4. Dopo aver scartato il lavaggio finale, aggiungere 20 mL di 100% etanolo al piatto. Utilizzando pinze, rimuovere i copricoperture singolarmente e disporre tra due pezzi di carta da filtro per asciugare.
   5. Conservare i coperchi secchi in un contenitore sigillato. I coperchi lavati acidi possono essere preparati in anticipo e conservati per un mese o più in condizioni di assenza di polvere.
2. Preparazione di coverlips "bottom" attivati dalla glutaraldeide
   NOTA: fare riferimento ai metodi precedenti per ulteriori dettagli^7,9.
   1. Posizionare 18 mm di diametro #1 coperture di spessorein un piatto Petri.
   2. Aggiungere 20 mL di 0,2 m di HCl alla piastra di Petri e scuotere delicatamente il piatto per disperdere i coprilabbra. Assicurarsi che tutti i copricopertine siano sommersi e rilasciare bolle d'aria tra i copricopertine. Incubare pernottamento a temperatura ambiente con agitazione delicata.
   3. Decant HCl dal piatto. Aggiungere 20 mL di acqua ultrapura e lavare con agitazione delicata per 10 min. Scartare l'acqua e ripetere per un totale di cinque lavaggi.
   4. Dopo aver scartato il lavaggio finale, aggiungere 20 mL di 0,1 M NaOH e agitare delicatamente per disperdere e sommergere i coverlip. Incubare a temperatura ambiente con agitazione delicata per 1 h.
   5. Decant NaOH dal piatto. Aggiungere 20 mL di acqua ultrapura e lavare con agitazione delicata per 10 min. Scartare l'acqua e ripetere per un totale di cinque lavaggi.
   6. Dopo aver scartato il lavaggio finale, aggiungere 20 mL di una diluizione di 1:200 di 3-aminopropyltrimethoxysilane in acqua ultrapura e agitare delicatamente per disperdere e sommergere i coperchi. Incubare a temperatura ambiente con agitazione delicata per 1 h o durante la notte.
      AVVISO: 3-aminopropyltrimethoxysilane è infiammabile e può causare irritazione della pelle. Maneggiare con cura, indossare un PPP appropriato e scartare i rifiuti secondo le normative locali di smaltimento.
   7. Decant la soluzione diluita 3-aminopropyltrimethoxysilane dal piatto. Aggiungere 20 mL di acqua ultrapura e lavare con agitazione delicata per 10 min. Scartare l'acqua e ripetere per un totale di almeno cinque lavaggi. È fondamentale rimuovere tutti i 3-aminopropyltrimethoxysilane prima di procedere.
   8. Dopo aver scartato il lavaggio finale, aggiungere 20 mL di una diluizione di 1:140 di glutaraldeide 70% nel fosfato tamponato salina (PBS) e agitare delicatamente per disperdere e sommergere i coperchi. Incubare a temperatura ambiente con agitazione delicata per 1 h o durante la notte.
      AVVISO: il 70% di glutaraldeide è tossico e può causare irritazione cutanea. Maneggiare con cura, indossare un PPP appropriato e scartare i rifiuti secondo le normative locali di smaltimento.
   9. Decant la soluzione diluita glutaraldeide dal piatto. Aggiungere 20 mL di acqua ultrapura e lavare con agitazione delicata per 10 min. Scartare l'acqua e ripetere per un totale di cinque lavaggi.
   10. Dopo aver scartato il lavaggio finale, aggiungere 20 mL di 100% etanolo. Utilizzando pinze, rimuovere i copricoperture singolarmente e disporre tra due pezzi di carta da filtro per asciugare.
   11. Conservare i coperchi secchi in un contenitore sigillato. I coperchi attivati dalla glutaraldeide possono essere preparati in anticipo e conservati per un massimo di sei mesi.

3. Generazione di stencil per la modellazione del ligando ECM

1. Generazione di stampi intermedi poliditilsiloxane (PDMS)
   1. Mescolare la base PDMS con l'agente di polimerità PDMS a un rapporto 10:1, in base al peso. Mescolare accuratamente.
      NOTA: Per l'applicazione iniziale di PDMS, preparare circa 100 g di PDMS per riempire un piatto da 100 mm. Per le applicazioni successive, rimuovere PDMS solo dal centro del piatto in cui si trovano le caratteristiche wafer di silicio e preparare 20-30 g di nuovo PDMS.
   2. Degas la miscela PDMS in un desiccatore per 30-60 min o fino a quando tutte le bolle d'aria vengono rimosse.
   3. Collocare il wafer di silicio modificato dal punto 1 in un piatto di plastica da 100 mm. Versare lentamente e uniformemente la miscela PDMS sulla superficie del wafer. Toccare il piatto sulla superficie di lavoro per rilasciare eventuali bolle d'aria dalla superficie del wafer.
   4. Degas la miscela PDMS versato sopra il wafer per 10 min o fino a quando tutte le bolle d'aria vengono rimossi o sono venuti alla superficie del PDMS.
   5. Cuocere il PDMS a 70 gradi centigradi per 2 h. Lasciare raffreddare a temperatura ambiente.
   6. Utilizzando un bisturi o una taglierina, ritagliare la sezione di PDMS dal centro del piatto che contiene le caratteristiche geometriche.
   7. Tagliare il PDMS in circa 10 x 10 mm quadrati, ciascuno contenente le caratteristiche per una singola condizione sperimentale. Questi sono indicati come "timbri" nei passaggi successivi del protocollo.
2. Generazione di lastre piatte di PDMS
   1. Mescolare la base PDMS con l'agente di polimerità PDMS con un rapporto 8:1, in base al peso. Preparare circa 20 g per ogni piatto da 100 mm da utilizzare. Mescolare accuratamente.
   2. Degas la miscela PDMS in un desiccatore per 30-60 min o fino a quando tutte le bolle d'aria vengono rimosse.
   3. Versare lentamente e uniformemente il PDMS in un piatto pulito da 100 mm. Toccare il piatto sulla superficie di lavoro per rilasciare eventuali bolle d'aria.
   4. Cuocere il PDMS a 70 gradi centigradi per 2 h. Lasciare raffreddare a temperatura ambiente.
   5. Rimuovere il PDMS dal piatto. Invertire in modo che la superficie del PDMS che era in contatto con il fondo del piatto sia rivolta verso l'alto.
   6. Per ogni timbro generato nel passaggio 3.1, tagliare un quadrato di 15 x 15 mm di PDMS. Queste sono definite "lastre piatte" nelle fasi successive del protocollo.
3. Generazione di stencil
   1. Disporre lastre piatte di PDMS sul coperchio di un piatto da 150 mm o di un'altra superficie piana per una maneggevolezza più semplice. Garantire una spaziatura sufficiente tra le lastre (ad esempio, per un piatto da 150 mm, disporre nove lastre piatte con spaziatura uniforme).
   2. Invertire ogni timbro generato nel passaggio 3.1 su una lastra piatta di PDMS, in modo che le caratteristiche del timbro siano in contatto con la lastra piatta di PDMS. Premere delicatamente sulla parte superiore del timbro con pinze per garantire un contatto uniforme.
   3. Sostenere con attenzione le coppie timbro/lastra PDMS sulla base del piatto, in modo che il coperchio poggia ad angolo. Questo aiuta il wicking del polimero UV-curable nella fase successiva.
   4. Posizionare una piccola goccia di polimero UV-curable nell'interfaccia superiore di ogni coppia timbro/soletta. Il polimero sarà malvagio tra i due dalla tensione superficiale, assistito dalla gravità.
      NOTA: Molti polimeri UV-curable diversi possono funzionare in questo protocollo. Abbiamo selezionato Norland Optical Adhesive 74 per le seguenti proprietà: i) polizzatura rapida sull'esposizione alla luce UV, ii) Facile rimozione dai francobolli PDMS dopo la polimerità, iii) Robusta adesione ai coperchi di vetro con pressione manuale.
   5. Una volta che il polimero è stato completamente malvagio attraverso, posizionare il coperchio con le coppie timbro / lastra piatta sulla superficie di lavoro. Posizionare una piccola goccia di polimero UV-curable su ciascuno dei restanti tre lati di ogni interfaccia timbro/lastre.
   6. Utilizzando una punta di pipetta da 200 l,l, collegare le gocce di polimero intorno ai bordi dell'interfaccia timbro/lastre. Questo crea un bordo che manterrà la soluzione di ligando nel passaggio 4.
      NOTA: Fare attenzione quando si lavora il polimero intorno ai bordi del timbro. Se l'interfaccia timbro/soletta viene interrotta, il polimero si blocca sotto le caratteristiche e lo stencil non si formerà correttamente.
   7. Posizionare con cura le coppie timbro/lastra in una scatola di sterilizzazione UV. Utilizzare l'impostazione di alimentazione sterile "Str" ed esporre per 10 min.
   8. Rimuovere le coppie timbro/lastra dalla scatola di sterilizzazione UV. Utilizzando due coppie di pinze, rimuovere delicatamente il timbro PDMS tenendo premuto la lastra piatta e lo stencil che si formava dal polimero UV-curable.
   9. Utilizzando le pinze, rimuovere con attenzione lo stencil e invertirlo in modo che la superficie che era in contatto con la lastra piatta di PDMS sia rivolta verso l'alto.
      NOTA: gli stencil sono delicati. Fare attenzione durante la consegna, soprattutto durante la rimozione iniziale dal PDMS, in modo che non si strappino.
   10. Riportare gli stencil invertiti in una scatola di sterilizzazione UV. Utilizzare l'impostazione di alimentazione sterile "Str" ed esporre per 3 min.

4. Modellazione ligando ECM su copricopre

1. Pressione di stencil su coverlip lavati acidi
   1. Posizionare uno scivolo di copertura lavato acidi per ogni stencil su un pezzo pulito di pellicola da laboratorio.
   2. Utilizzando pinze, posizionare con cura ogni stencil, flat-side-down, su una coverslip acid-washed. Posizionare in modo che le funzioni siano centrate sul coperchio.
   3. Posizionare un piccolo pezzo di pellicola da laboratorio sopra ogni stencil. Premere saldamente e uniformemente verso il basso sullo stencil per creare un forte contatto tra lo stencil e la coverslip.
      NOTA: Questo è un passo fondamentale! Premere con fermezza e su tutta la superficie dello stencil. Se non viene creato un contatto sufficiente, la soluzione di ligando perderà tra lo stencil e i trattiri e la modelliera avrà esito negativo. FACOLTATIVO: Per confermare un contatto sufficiente tra lo stencil e la coverslip, pipette 100 -L di acqua sterile ultrapura sulla superficie di ogni stencil e incubare a temperatura ambiente. Dopo 1 h, verificare la presenza di perdite. Aspirare l'acqua da stencil con successo incollati e procedere.
2. Pulizia al plasma della superficie dei coperchi stencil per aumentare l'idrofilia
   1. Posizionare i copricopertine con stencil in un detergente al plasma. Applicare plasma ad alta potenza per 30 s.
3. Preparazione della soluzione di ligando ECM
   NOTA: Tutti i passaggi successivi devono essere completati in condizioni sterili, se possibile.
   1. Mettere sulla ghiaccio una soluzione sterile da 100 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 8.0. Una volta ghiacciato, aggiungere il matrigel e il collagene per ottenere concentrazioni rispettivamente di 225 g/mL e 25 g/mL. OPTIONAL: Per la risoluzione dei problemi o per la visualizzazione del ligando, includere un ligando con tag fluorescente nella soluzione di ligando.
      1. NOTA: con questo metodo è possibile utilizzare diversi ligandi ECM. Per i diversi ligandi, può essere necessaria un'ottimizzazione aggiuntiva per determinare la concentrazione ideale, il tempo di incubazione e la temperatura di incubazione. Per ulteriori informazioni, vedere la sezione Discussione.
   2. Pipette la soluzione di ligando sulla superficie di ogni stencil. Per gli stencil realizzati con timbri quadrati da 10 x 10 mm, applicare 100 L per stencil.
   3. Controllare le bolle d'aria nelle funzioni di stencil. Se necessario, utilizzare pinze a punta fine o una punta di pipetta da 2 luna per rimuovere le bolle d'aria dalle funzioni.
      NOTA: Questo è un passo fondamentale! Se le bolle d'aria rimangono intrappolate sulla superficie della coverslip, il ligando non adsorberà alla superficie e il modello risultante sarà incompleto.
   4. Posizionare i coperchi stencil con ligando in un piatto, avvolgere con pellicola da laboratorio, e incubare a 4 gradi durante la notte.

5. Trasferimento di ligando al gel poliacrilammide

1. Rimozione della soluzione di ligando e dello stencil da ogni coverslip
   1. Aspirare la soluzione di ligando dalla superficie di uno stencil. La soluzione Ligand può essere raccolta e immagazzinata a 4 gradi centigradi e riutilizzata per un massimo di un mese.
   2. Utilizzando pinze, immergere brevemente il coperchio con stencil in un piatto contenente PBS sterile da lavare.
   3. In breve tempo immergere il coperchio con stencil in un secondo piatto di PBS sterile per lavare.
   4. Rimuovere lo stencil dalla superficie dello scivolo. Fare attenzione a non rompere il coverslip.
   5. Immergi brevemente il coperchio in un piatto contenente acqua sterile ultrapura per rimuovere i sali dai lavatori PBS. Toccare il bordo della coverslip per un compito delicato pulire per spazzare via l'acqua in eccesso.
   6. Asciugare il coperchio sotto un gas inerte, come l'azoto. Contrassegnare la parte inferiore della coverslip per tenere traccia dell'orientamento da questo punto in avanti. Fare attenzione a mantenere il lato modellato rivolto verso l'alto.
   7. Ripetere i passaggi da 5.1.1 a 5.1.6 per ogni copertina stampata.
2. Realizzazione di idrogel di poliacrilammide con coperchi a motivi geometrici
   NOTA: Fare riferimento ai metodi precedenti per ulteriori dettagli^7,9 Sterilizzare tutti i portatappo, tubi e distanziali utilizzati per fare gel poliacrilammide lavando con 10% candeggina durante la notte, risciacquo con acqua almeno cinque volte per rimuovere la candeggina, e lavando brevemente nel 70% di etanolo. Mettere tutti i pezzi su salviette compito delicato in un armadio di biosicurezza sterile per asciugare prima dell'uso.
   1. Preparare la soluzione poliacrilammide per ottenere l'elasticità dell'idrogel desiderata (Tabella 2). Mescolare tutti i componenti ad eccezione delle microsfere fluorescenti e del persulfato di potassio (PPS).
      NOTA: Preparare ogni volta una soluzione persovolta all'1% di potassio fresco.
   2. Degas la soluzione di poliacrilammide, microsfere e PPS in tubi separati sotto vuoto per 30 min.
   3. Per ogni coverslip a motivi geometrici, preparare una coverslip "bottom" attivata con glutaraldeide con un distanziale (18 mm di diametro esterno, 14 mm di diametro interno) posto sulla parte superiore.
   4. Dopo il degassamento, sonicare brevemente le microsfere e aggiungere il volume appropriato alla soluzione di poliacrilammide. Mescolare pipetting su e giù, facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria. Sonicare brevemente.
   5. Aggiungere il volume appropriato di SPA alla soluzione di poliacrilammide. Pipette su e giù per mescolare la soluzione, facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria.
      NOTA: Dopo aver aggiunto PPS, lavorare rapidamente per completare i passaggi da 5.2.6 a 5.2.11 prima che la poliacrilammide venga polimerizzata.
   6. Pipetta 75-150L (a seconda dello spessore del distanziale) al centro di ogni coverslip attivato dalla glutaraldeide.
   7. Utilizzando pinze, posizionare un coperchio a motivi geometrici su ogni coverslip attivato dalla glutaraldeide con poliacrilammide e distanziale, in modo che il ligando modellato si trovi di fronte alla soluzione poliacritilmide. Se è stata aggiunta una soluzione di poliacrilammide sufficiente, la tensione superficiale insidia la poliacrilammide tra i due copricapi e non saranno presenti bolle d'aria.
   8. Raccogliere ogni "sandwich" poliacrilammide e toccare con attenzione il lato per una delicata pulizia compito per evitare la soluzione poliacrilammide in eccesso.
   9. Posizionare con cura ogni "sandwich" poliacrilamide in un portatappo con fili compatibili con tubi conicali da 15 mL. L'orientamento dovrebbe essere tale che il fondo della ghiarfine a forma di glutaraldeide è in contatto con il fondo del supporto del tappo, e il coperchio modellato è in cima.
   10. Avvitare un tubo conico-basso da 15 mL in ogni porta tappo per tenere in posizione i "panini" di poliacrilammide. I tubi dovrebbero essere stretti per evitare perdite, ma attenzione a non stringere eccessivamente e rompere i copricopro.
   11. Centrifugare i "sandwich" poliacrilamiti nei tubi in altalena a 200 x g per 10 min a temperatura ambiente. Rimuovere i tubi dalla centrifuga e metterli in rack tubo per mantenere l'orientamento per un ulteriore 50 min per garantire la piena polimerizzazione. Tenere coperto di pellicola per evitare lo sbiancamento delle microsfere fluorescenti.
       NOTA: la centrifugazione è fondamentale quando si utilizza questo metodo per eseguire la TFM. La forza centrifuga sposta tutte le microsfere su un unico piano, che alla fine sarà appena sotto la superficie dell'idrogel. Questo è l'ideale per l'imaging di spostamenti della microsfera che vengono utilizzati per calcolare le sollecitazioni di trazione generate dalla cellula. Se non esegue La TFM, le microsfere possono essere lasciate fuori dalla soluzione di poliacrilammide e la polimerizzazione può verificarsi in cima senza centrifugazione.
   12. Rimuovere i "sandwich" poliacriti polimerizzati dai tubi e immergersi in PBS in un piatto da 100 mm. Avvolgere in pellicola da laboratorio e incubare per 3 h a temperatura ambiente o pernottamento a 4 gradi centigradi.
3. Preparazione di gel modellati per le cellule di semina
   1. Utilizzare un bisturi e pinze per rimuovere con attenzione il coverslip a motivi geometrici e il distanziale dal "sandwich" poliamcrita mentre rimane immerso nella PBS. Il ligando modellato sarà trasferito alla poliacrilammide durante la polimerizzazione e rimarrà dopo aver rimosso il coperchio. Il gel di poliacrilammide rimarrà attaccato al coperchio attivato dalla glutaraldeide.
      NOTA: Questo è un passo fondamentale! La poliacrilammide deve essere sommersa in PBS mentre si rimuove il coperchio o i modelli di ligando saranno distrutti.
   2. Posizionare ogni coverslip con poliacrilammide a motivi geometrici in un supporto per tappo. Posizionare una guarnizione (18 mm di diametro esterno, 14 mm di diametro interno) sopra il coperchio e intorno alla poliacrilammide, dove si trovava il distanziale. Avvitare un tubo a fondo conico segato da 15 mm nel supporto del tappo, formando un pozzo con la poliacrilammide modellata nella parte inferiore. Questi assiemi si inseriscono nei pozze di una piastra standard da 12 pozze per una facile maneggevolezza.
   3. Lavare ogni gel aggiungendo 500 luna di PBS all'assemblaggio del pozzo. Incubare per 10 min a temperatura ambiente con agitazione delicata. Rimuovere PBS e ripetere due volte per un totale di tre lavamenti.
   4. Dopo il lavaggio finale del PBS, aggiungere 500 -L di supporto knockout-DMEM ai gel e incubare a 37 gradi durante la notte. I gel possono essere tenuti a 37 gradi centigradi con supporti per un massimo di 5 giorni prima di seminare le cellule.
   5. Il giorno prima della semina delle cellule, sostituire il knockout-DMEM per i supporti KSR completi e incubare a 37 gradi centigradi durante la notte.

6. Coltura di hESC su gel a motivi geometrici

NOTA: Se si pianifica la correzione di campioni per l'immunostaining dopo la TFM, scattare immagini di posizioni di microsfera non accentate prima di seminare le cellule. In questo caso, il ligando marcato fluorescente deve essere utilizzato nel passaggio 4.3.1 in modo che le posizioni eventuali delle cellule siano conosciute prima che la semina e le microsfere possano essere imagete in tali regioni.

1. Mantenere le colture stock hESC e le colture secondarie prive di alimentatore preparate su piastre rivestite di matrigel in supporti KSR condizionati prima della seeding su gel di poliacrilammide modellati come descritto in precedenza⁹.
   NOTA: Generare supporti KSR condizionati colticce fibroblasti embrionali di topo irradiati in supporti KSR integrati con 4 fattore di crescita del fibroblasto di base ng/mL (bFGF). Raccogliere e sostituire i supporti ogni 24 ore.
2. Aspirati i media da hESC. Lavare brevemente con supporti knockout-DMEM. Aggiungere lo 0,05% di tripsina-EDTA integrato con 10 s S Y27632 (inibitore della chinasi di Rho) e incubare a 37 gradi centigradi per 5-10 min.
3. Aggiungere supporti con siero per inibire la trypsin. Aspirare delicatamente i supporti e la pipetta sul piatto per rimuovere le cellule. Continuare a pipettare delicatamente per rimuovere tutte le cellule e dissociare gli ammassi di cellule a singole celle.
4. Raccogliere la sospensione cellulare e centrifugare a 200 x g per 3 min.
5. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet in un volume equivalente di supporti KSR per lavare. Centrifuga a 200 x g per 3 min.
6. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet in supporti KSR condizionati integrati con 10 ng/mL bFGF e 10 Y27632.
7. Contare le cellule con un emocitometro e regolare la sospensione cellulare ad una concentrazione di 300.000 cellule per mL. Pipette 500 -L della sospensione cellulare su ogni gel a motivi geometrici (150.000 cellule per gel).
8. 3 h dopo la seeding, utilizzare una pipetta per aspirare con attenzione il supporto da ogni gel e sostituire con supporti KSR con condizioni fresche integrati con 10 ng/mL bFGF e 10 Y27632. Questo rimuove le cellule in eccesso che non hanno aderito alle regioni modellate della poliacrilammide.
   NOTA: Questo è un passo fondamentale! In questa fase le cellule saranno vagamente aderenti al ligando modellato. Fare molta attenzione quando si scambiano supporti per non staccare le cellule. La parità di attenzione dovrebbe essere presa con ciascuno degli scambi di media nelle fasi successive.
9. 24 h dopo la seeding, utilizzare una pipetta per aspirare con attenzione il supporto e lo scambio di supporti KSR condizionati integrati con 10 ng/mL bFGF e 5 Y27632.
10. 48 h dopo la seeding, utilizzare una pipetta per aspirare con attenzione il supporto e lo scambio di supporti KSR condizionati integrati con 10 ng/mL bFGF. Questo rimuove l'inibitore della chinasi Rho dai media e gli esperimenti possono iniziare il giorno successivo, 72 h dopo la seeding.

7. Esecuzione di TFM

1. Se lo si desidera, eseguire il TFM come descritto in precedenza⁹ nelle condizioni sperimentali desiderate.
2. Se le posizioni della microsfera non in difficoltà sono state imagete prima della semina delle cellule, fissare le cellule dopo aver assunto posizioni della microsfera stressata ed eseguire l'immunostaining per determinare la localizzazione delle proteine di interesse rispetto alle regioni di forze ad alta e bassa trazione.

Results

La sfida principale da superare nel tentativo di coltura hESC in colonie di geometria controllata su substrati conformi è quello di generare un modello omogeneo di ECM-ligand ondoso sulla superficie del substrato. La strategia presentata in questo metodo prevede prima la generazione del modello desiderato sulla superficie di un vetrino e successivamente il trasferimento di tale modello sulla superficie di un idrogel di policrilmide durante la polimerizzazione del gel (

Discussion

Per semplificare un protocollo lungo e dettagliato, questo metodo consiste in tre fasi critiche: 1) la generazione di modelli di ligando ECM su coperchi in vetro, 2) trasferendo i modelli agli idrogel di polimembrana metà durante la polimerizzazione del gel, e 3) seeding hESC sul idrogel a motivi geometrici. Ci sono passi critici che devono essere considerati in ciascuna di queste tre fasi. Per generare modelli ad alta fedeltà sui coperchi di vetro, lo stencil deve essere saldamente premuto sul coperchio per evitare perd...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,05% Tripsina	Gibco	25300054
Piastra di Petri in vetro da 100 mm	Fisher Scientific	08-747B
Piastra di Petri in plastica da 100 mm	Fisher Scientific	FB0875712
Provette a fondo conico da 15 mL	Corning	352095
Piastra di Petri in plastica da 150 mm	Fisher Scientific	FB0875714
18 mm diametro #1 vetrini	coprioggetti Thermo Scientific	18CIR-1
2% bisacrilammide	Bio-Rad	161-0142
3-amminopropiltrimetossisilano	ACROS Organics	313251000
40% acrilammide	Bio-Rad	161-0140
Foglio di alluminio	Fisher Scientific	01-213-100
Fattore di crescita base dei fibroblasti	Sigma-Aldrich	F0291
Bleach	Clorox	N/A
Centrifuga con secchi oscillanti	Eppendorf	22623508	Modello: 5804 R
Essiccatore per	354236		collagene
	Fisher Scientific	08-642-7
Etanolo	Fisher Scientific	AC615095000
fetale siero bovino	Gibco	16000044
Microsfere fluorescenti	Thermo Scientific	F8821
Pinze (per vetrini)	Fisher Scientific	16-100-122
Pinze (per wafer)	Fisher Scientific	17-467-328
Portagel	N/A	N/A I	portagel sono stampati in 3D personalizzati, disegno CAD disponibile su richiesta
Glutaraldeide	Fisher Scientific	50-261-94
HEPES	Thermo Scientific	J16926A1
Piastra riscaldante	Fisher Scientific	HP88854100
Acido cloridrico	Fisher Scientific	A144S-500
Alcool isopropilico	Fisher Scientific	A416-500
Kimwipes (salviette per attività delicate)	Kimberly-Clark Professional	34120
Sostituzione del siero	knockout Gibco	10828028
Knockout-DMEM	Gibco	10829018
Allineatore di maschere (per fotolitografia)	Karl Suss America, Inc.	Karl Suss MJB3 Allineatore
Matrigel	Corning	354277
Microscopio per forza di trazione	Nikon	N/A	Modello: Eclipse TE200 U
Tavolino di posizionamento motorizzato	Prior Scientific	N/A	Modello: HLD117
Azoto gassoso	Airgas	NI 250
Adesivo ottico Norland 74 (polimero polimerizzabile UV)	Norland Prodotti	NOA 74
Forno	Thermo Scientific	PR305225G
Parafilm (pellicola da laboratorio)	Fisher Scientific	13-374-12
PDMS (Sylgard 184)	Fisher Scientific	NC9285739
Photomask	CAD/Art Services, Inc.	N/A	sono realizzate su misura. Disegno CAD per i nostri disegni disponibile su richiesta
Detergente al plasma	Fisher Scientific	NC9332171
Plastica per guarnizione	Marian Chicago	HT6135
Plastica per distanziatore	TAP Plastics	N/A Foglio	policarbonato, spessore .01 pollici
Cloruro di potassio (per la produzione di PBS)	Fisher Scientific	P217-500
Fosfato di potassio monobasico (per la produzione di PBS)	Fisher Scientific	P285-500
Persolfato di pottassio	ACROS Organics	424185000
Bisturi	Fisher Scientific	14-840-00
Wafer di silicio	Microscopia elettronica	Sciences 71893-06	Tipo P, 3 pollici, wafer di silicio
Cloruro di sodio (per la produzione di PBS)	Fisher Scientific	S271-1
Idrossido di sodio	Fisher Scientific	S318-100
Fosfato di sodio bibasico diidrato (per la produzione di PBS)	Fisher Scientific	S472-500
SU8-3050 Fotoresist	MicroChem	SU8-3000
SU8-Developer	MicroChem	Y020100
TEMED	Bio-Rad	161-0800
scatola di sterilizzazione UV	Bio-Rad	N/A	Bio-Rad GS Gene Linker UV Camera
Y27632 (inibitore della chinasi Rho)	StemCell Technologies	72304