Caratterizzazione citometrica a flusso simultaneo di più tipi di cellule recuperate dal cervello del mouse/cavo spinale attraverso diversi metodi di omogeneizzazione

Summary

Vi presentiamo un metodo di citometria di flusso per identificare contemporaneamente diversi tipi di cellule recuperate dal cervello del topo o dal midollo spinale. Questo metodo potrebbe essere sfruttato per isolare o caratterizzare le popolazioni di cellule pure nelle malattie neurodegenerative o per quantificare l'estensione del targeting cellulare sulla somministrazione in vivo di vettori virali o nanoparticelle.

Abstract

I recenti progressi nelle scienze dei vettori virali e dei nanomateriali hanno aperto la strada a nuovi approcci all'avanguardia per studiare o manipolare il sistema nervoso centrale (SNC). Tuttavia, un'ulteriore ottimizzazione di queste tecnologie trarrebbe vantaggio da metodi che consentano una rapida determinazione e una snellimento della portata del SNC e del targeting specifico per le cellule sulla somministrazione di vettori virali o nanoparticelle nel corpo. Qui, presentiamo un protocollo che sfrutta l'alta produttività e le capacità multiplexing della citometria di flusso per consentire una semplice quantificazione di diversi sottotipi di cellule isolati dal cervello del topo o dal midollo spinale, vale a dire microglia/macrofagi, linfociti, astrociti, oligodendrociti, neuroni e cellule endoteliali. Applichiamo questo approccio per evidenziare le differenze critiche tra due metodi di omogeneizzazione dei tessuti in termini di resa cellulare, vitalità e composizione. Questo potrebbe istruire l'utente a scegliere il metodo migliore a seconda del tipo di cella o dei tipi di cella di interesse e dell'applicazione specifica. Questo metodo non è adatto per l'analisi della distribuzione anatomica, poiché il tessuto è omogeneizzato per generare una sospensione a cella singola. Tuttavia, permette di lavorare con cellule vitali e può essere combinato con lo smistamento cellulare, aprendo la strada a diverse applicazioni che potrebbero espandere il repertorio di strumenti nelle mani del neuroscienziato, che vanno dall'istituzione di colture primarie derivate da popolazioni di cellule pure, ad analisi gene-expression e saggi biochimici o funzionali su sottotipi cellulari ben definiti nel contesto di malattie neurodegenerative, sul trattamento farmacologico o sulla terapia genica.

Introduction

Le tecnologie di somministrazione di geni e farmaci (come vettori virali e nanoparticelle) sono diventate un potente strumento che può essere applicato per ottenere migliori informazioni su percorsi molecolari specifici alterati nelle malattie neurodegenerative e per lo sviluppo di approcci terapeutici innovativi^1,2,3. L'ottimizzazione di questi strumenti si basa sulla quantificazione di: (1) l'entità della penetrazione nel SNC su diverse vie di somministrazione e (2) targeting di specifiche popolazioni cellulari. Le analisi istologiche sono di solito applicate per visualizza....

Protocol

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Dana Farber Cancer Institute (numero di protocollo 16-024).

1. Preparazione delle soluzioni necessarie per l'esperimento

1. Preparare 1x soluzione di sale equilibrato di Hank (HBSS) diluindo 10x HBSS con acqua sterile. Pre-raffreddare la soluzione sul ghiaccio. Per ogni campione sono necessari almeno 25 mL di soluzione.
2. Preparare la soluzione ISotonica Percoll (IPS) mescolando 10x sterile HBSS 1:10 con grado di gradiente di densità (cioè Percoll). Pre-freddo sul ghiaccio.
   NOTA: l'IPS può essere conservato per un....

Results

Abbiamo confrontato due diversi metodi di omogeneizzazione (DH contro PD) applicati al cervello del topo e al midollo spinale, per testare l'efficienza nel recupero di diversi tipi di cellule vitali adatti per applicazioni a valle. Per farlo, abbiamo sfruttato un pannello di citometria a flusso a 9 colori progettato per caratterizzare, nello stesso campione, diversi tipi di cellule SNC tra cui microglia, linfociti, neuroni, astrociti, oligodendrociti ed endotelio.

I tessuti cerebrali e del mid.......

Discussion

Qui descriviamo un protocollo per la co-purificazione e l'analisi citometrica del flusso simultaneo di alcune delle cellule CNS più rilevanti dal cervello del topo e dal midollo spinale. Tradizionalmente, le analisi istologiche sono state applicate per descrivere la distribuzione delle nanoparticelle o l'efficienza di trasduzione dei vettori virali nel CNS^5,13, o per fornire informazioni sui cambiamenti morfologici e molecolari che si verificano in specifici tipi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X HBSS (senza calcio, cloruro di magnesio e solfato di magnesio)	Gibco	14185-052
Filtro cellulare da 70 mm	Corning	431751
ACSA/ACSA2 anticorpo anti-topo	Miltenyi Biotec	130-117-535	APC coniugato
Albumina sierica bovina	Sigma Aldrich	A9647-1KG
CD11b anticorpo anti-topo	per rattiInvitrogen	47-0112-82	APC-eFluor 780 coniugato
CD31 anticorpo anti-topo di ratto	BD Bioscience	562939	BV421 coniugato
CD45 anticorpo anti-topo di ratto	Biolegend	103138	Brilliant Violet 510 coniugato
CD90.1/Thy1.1 anticorpo anti-topo di ratto	Biolegend	202518	PE/Cy7 coniugato
CD90.2/Thy1.2 anticorpo	anti-topo di rattoBiolegend	1005325	PE/Cy7 provette coniugate coniugate
(15 mL)	CellTreat	229411
provette coniche (50 mL)	CellTreat	229422
Dounce Tissue Grinder set (include mortaio e pestelli A e B)	Sigma-Aldrich	D9063-1SET
Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse anticorpo	BD Pharmingen	553142
Siero fetale bovino	Benchmark	100-106
Kit di dissociazione del tessuto neurale (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628
O4 anti anticorpo topo/ratto/umano	Miltenyi Biotec	130-095-895	Biotina coniugata
Percoll	GE Healthcare	10266569	venduto come reagente non sterile
Percoll	Sigma	65455529	reagente sterile (da utilizzare per applicazioni che richiedono sterilità)
Reagente Percoll PLUS	Sigma	GE17-5445-01	contenente tracce molto basse di endotossina
Streptavidina	Invitrogen	S3258	Alexa Fluor 680 coniugato