Contusione Mitraglio Cavolo spinale con una MicrochirurgicA laminectomia nell'Axolotl Rigenerativo

Sommario

Questo manoscritto presenta protocolli per infliggere chirurgicamente le lesioni del midollo spinale smussate e taglienti controllate ad un axolotl rigenerativo (Ambystoma mexicanum).

Abstract

Lo scopo di questo studio è quello di stabilire un modello di lesione del midollo spinale smussato rigenerativo standardizzato e riproducibile nell'axolotl (Ambystoma mexicanum). La maggior parte delle lesioni cliniche del midollo spinale si verificano come traumi contundenti ad alta energia, inducendo lesioni da contusione. Tuttavia, la maggior parte degli studi nel midollo spinale axolotl sono stati condotti con traumi acuti. Pertanto, questo studio mira a produrre un modello rigenerativo più rilevante dal punto di vista clinico. A causa della loro impressionante capacità di rigenerare quasi tutti i tessuti, gli axolotl sono ampiamente utilizzati come modelli negli studi rigenerativi e sono stati ampiamente utilizzati negli studi sulle lesioni del midollo spinale (SCI). In questo protocollo, gli assilotls sono anestesizzati da un'immersione in una soluzione di benzocaina. Al microscopio, un'incisione angolare viene fatta bilateralmente ad un livello semplicemente caudale agli arti posteriori. Da questa incisione, è possibile sezionare ed esporre i processi spinosi. Utilizzando pinze e forbici, viene eseguita una laminectomia a due livelli, esponendo il midollo spinale. Viene costruito un dispositivo traumatologico personalizzato costituito da una canna che cade in un cilindro, e questo dispositivo viene utilizzato per indurre una lesione di contusione al midollo spinale. Le incisioni vengono poi suturate e l'animale recupera dall'anestesia. L'approccio chirurgico è riuscito a esporre il midollo spinale. Il meccanismo del trauma può produrre lesioni da contusione al midollo spinale, come confermato da istologia, risonanza magnetica, ed esame neurologico. Infine, il midollo spinale si rigenera dalla lesione. La fase critica del protocollo è la rimozione dei processi spinosi senza infliggere danni al midollo spinale. Questo passaggio richiede una formazione per garantire una procedura sicura. Inoltre, la chiusura delle ferite dipende fortemente dal non infliggere danni inutili alla pelle durante l'incisione. Il protocollo è stato eseguito in uno studio randomizzato di 12 animali.

Introduzione

L'obiettivo generale di questo studio era quello di stabilire un metodo microchirurgico controllato e riproducibile per infliggere SCI contundente e tagliente all'axolotl (Ambystoma mexicanum), producendo un modello di lesione del midollo spinale rigenerativo.

La SCI è una condizione grave che, a seconda del livello e dell'estensione, infligge disabilità neurologiche alle estremità insieme a un controllo alterato della vescica e dell'intestino^1,2,3. La maggior parte delle SCI sono il risultato di traumi contundenti ad alta energia come incidenti stradali e cadute^4,5. Le lesioni taglienti sono molto rare. Pertanto, il tipo di lesione macroscopica più comune è contusioni.

Il sistema nervoso centrale dei mammiferi (CNS) è un tessuto non rigenerativo, quindi nessun ripristino del tessuto neurologico seguito a SCI è visto^6,7,8. D'altra parte, alcuni animali hanno un'intrigante capacità di rigenerare i tessuti, tra cui il tessuto CNS. Uno di questi animali è l'axolotl. È ampiamente usato negli studi di biologia rigenerativa ed è di interesse nella rigenerazione del midollo spinale, perché è un vertebrato^9,10,11,12.

La maggior parte degli studi SCI nell'axolotl vengono eseguiti come amputazione dell'intera coda o ablazione di una parte più grande del midollo spinale^9,10,11,12. Recentemente, è stato pubblicato un nuovo studio sulle lesioni contundenti¹³ che imitano meglio le situazioni cliniche. Mentre l'amputazione completa dell'appendice nell'axolotl comporta una rigenerazione completa, alcuni fenomeni rigenerativi non basati sull'amputazione dipendono dal difetto di dimensione critica (CSD)^14,15. Ciò significa che le lesioni che superano una soglia critica non vengono rigenerate. Per sviluppare un modello rigenerativo con un valore traslazionale clinico più elevato, questo studio ha studiato se un trauma contundente di 2 mm supererebbe il limite di CSD.

Questo metodo è rilevante per i ricercatori che lavorano sulla rigenerazione del midollo spinale in piccoli modelli animali, in particolare nell'axolotl. Inoltre, può essere di interesse più generale, perché presenta un modo di utilizzare attrezzature di laboratorio standard per sviluppare un meccanismo di trauma contundente che è adatto per l'uso in piccoli animali in generale.

Protocollo

Nel corso dello studio sono state seguite tutte le normative istituzionali e governative applicabili relative all'uso etico degli animali. Lo studio è stato condotto con l'id di approvazione: 2015-15-0201-0061 dall'Ispettorato danese per gli esperimenti sugli animali. Gli animali erano assolotl messicani (Ambystoma mexicanum, massa corporea media : STD: 12,12 g 1,25 g).

1. Preparazione

1. Preparare axolotl per l'anestesia.
   1. Utilizzare acqua del rubinetto non trattata chimicamente di alta qualità. Se non è disponibile, utilizzare la soluzione di 40% Holtfreter.
   2. Sciogliere 200 mg di etilo 4-aminobenzoato (benzocaina) in 3 mL di acetone. Sciogliere questa soluzione in 1 L di acqua di rubinetto o al 40% di quella di Holtfreter.
2. Utilizzare un piatto Petri standard (100 mm di diametro) posto sotto un microscopio stereo come tavolo chirurgico. Posizionare un panno tessile chirurgico sul piatto Petri.
   NOT: L'utilizzo di una parabola Petri come area chirurgica consente lo spostamento e la rotazione dell'animale senza toccarlo, garantendo la stabilità spinale durante l'intervento chirurgico.
3. Preparare tutti gli strumenti microchirurgici sterili (ad esempio, forbici e pinze anatomiche).

2. Anestesia

1. Mettere l'axolotl in un contenitore con soluzione di benzocaina per circa 45 min per garantire un'anestesia profonda e stabile.
   NOT: La concentrazione data di benzocaina causerà anestesia in tutte le dimensioni di axolotls.
2. Verificare la presenza di segni di anestesia generale entro 30-45 min. Questi includono una completa mancanza di movimenti branchiali, rettidamento riflesso, o risposta a stimoli tattili o dolorosi (pizzicamento delicato della tela delle dita dei piedi).
3. Per mantenere l'anestesia, avvolgere gli animali in asciugamani di carta bagnati nella soluzione anestetica. Seccoli regolarmente con questa soluzione durante la procedura chirurgica per garantire che la pelle e le branchie siano mantenute umide.
4. Recuperare l'animale dopo l'intervento mettendolo in un contenitore contenente acqua di rubinetto fresca. Osservare i segni di recupero, come il movimento delle branchie e il riflesso di radderamento riacquistato, entro 1 h¹⁶.

3. Microchirurgica Laminectomia

NOT: La laminectomia viene eseguita sotto uno stereoscopio.

1. Posizionare l'animale in posizione prona sul piatto Petri. Avvolgerlo in asciugamani di carta in modo che la coda sia esposta.
   NOT: Gli asciugamani di carta sono eccellenti per garantire la stabilità durante tutta la procedura.
2. Identificare gli arti posteriori. Fare la prima incisione appena caudale a loro.
   1. Con un paio di microscisors, eseguire un'incisione verticale dalla chiglia fino a quando si avverte la prominenza ossea dei processi spinosi.
      NOT: Fare molta attenzione quando si afferra la chiglia e la pelle con pinze, perché questi infliggono facilmente danni alla pelle delicata.
   2. Estendere il taglio lateralmente, in modo che l'incisione attraversi l'intera larghezza della coda.
   3. Afferra il processo spinoso con pinze per garantire la giusta profondità.
   4. Estendere le incisioni verticali di 1 mm sotto il processo spinoso su entrambi i lati.
3. Posizionare l'animale su un lato per eseguire incisioni ventrali e orizzontali come indicato di seguito.
   1. Con un paio di microscissori, a partire dal punto ventrale dell'incisione verticale, fare un'incisione orizzontale di circa 15 mm per gli animali 10-20 g di peso. Rendere l'incisione più lunga per gli animali più grandi e più breve per gli animali più piccoli.
   2. Usando le forbici, sezionare mediamente attraverso l'incisione orizzontale fino a quando la colonna vertebrale si sente nella linea mediana.
   3. Ripetere i passaggi 3.3, 3.3.1 e 3.3.2 sull'altro lato dell'animale.
4. Dopo aver sezionato nel piano mediale profondo da entrambi i lati, sezionare attraverso la linea mediana, collegando così le due incisioni orizzontali.
   1. Spostare il pezzo libero di coda e chiglia su un lato, esponendo i processi spinosi (Figura 1).
   2. Fissare il pezzo di coda con asciugamani di carta bagnati.
5. Posizionare nuovamente l'animale nella posizione prona con la testa rivolta verso il lato non dominante del chirurgo.
   1. Con un paio di pinze, afferrare i processi spinosi semplicemente caudale agli arti posteriori. Applicare un sollevamento delicato sia verso l'alto che verso la testa dell'animale.
   2. Posizionare le lame di un paio di microscissorri orizzontali intorno al processo e tagliarlo delicatamente. L'ascensore sul processo assicura che sia ora rimosso, esponendo il midollo spinale.
   3. Afferrare il processo spinoso appena caudale a quello che è stato appena rimosso e ripetere i passaggi 3.5.1 e 3.5.2.
      NOT: Questo dovrebbe lasciare un midollo spinale esposto corrispondente a due livelli vertebrali. Quando si esegue la laminectomia, appare spesso una secrezione bianca schiumosa. Il midollo spinale è facilmente identificabile dalla sua lucentezza distintiva, insieme a un recipiente che corre lungo la linea mediana.
   4. A seconda delle dimensioni dell'animale, l'area esposta potrebbe non essere abbastanza ampia. Utilizzando due coppie di pinze, afferrare le lamine su entrambi i lati del midollo spinale e ruotarle lateralmente con un movimento delicato.

4. Introduzione di un infortunio di tipo contusione (Figura 2)

1. Mantenere l'animale in posizione prona.
2. Utilizzare il piatto Petri per trasferire l'animale all'unità trauma.
3. Chiedi a un assistente di far brillare una torcia sul midollo spinale.
4. Posizionare il cilindro dell'unità trauma di contusione sopra il midollo spinale esposto utilizzando i microregolatori sull'unità. Puntare attraverso il cilindro.
5. Abbassare il cilindro fino a quando non è in piano con la laminae.
6. Attaccare l'asta cadente all'elettromagnete. Posizionare il cilindro di regolazione dell'altezza di caduta desiderato sull'unità traumatizzato.
7. Posizionare l'asta cadente nel cilindro.
   NOT: Per uno studio cieco, il chirurgo dovrebbe ora lasciare la stanza senza sapere se l'animale sarà assegnato a una lesione o a un gruppo di chirurgia fittizia.
8. Spegnere l'elettromagnete. L'asta cade al midollo spinale esposto.
9. Utilizzare la vite di regolazione dell'altezza per sollevare l'asta dal midollo spinale.
10. Confermare la lesione osservando il midollo spinale al microscopio. Il sito ferito apparirà più scuro, e sanguinamento dal vaso di linea mediana sarà evidente.

5. Introduzione di una lesione acuta

NOT: Eseguire questi passaggi dopo la 3.5.4.

1. Con un paio di microscissori tagliare il midollo spinale in un taglio verticale perfetto.
2. Ripetere il taglio 2 mm sul lato caudale del corpo.
   NOT: La lunghezza del pezzo rimosso del midollo spinale può essere regolata in base al requisito dello studio. Tuttavia, un taglio di 2 mm sarà rigenerabile¹⁰.
3. Assicurarsi che i tagli siano completi. Al termine, senti le lame delle forbici che raschiano lungo la parte ventrale del canale spinale.
4. Sollevare il pezzo di midollo spinale da 2 mm dal canale spinale.

6. Chiusura della ferita chirurgica

1. Riportare l'animale al tavolo chirurgico. In uno studio cieco, riposizionare la chiglia in modo che il midollo spinale non sia visibile al chirurgo.
2. Mantenere l'animale in posizione prona.
   1. Iniziare a posizionare 10.0 suture di nylon dalla parte più caudale dell'incisione orizzontale. Chiudi le ferite in uno strato.
      NOT: Non afferrare la pelle troppo stretta, perché infliggerà necrosi.
   2. Lavorare verso la parte verticale dell'incisione.
   3. Quando si raggiunge l'angolo, ruotare la piastra Petri e suturare l'altra incisione orizzontale.
   4. Impostare suture sulle incisioni verticali.
   5. Non posizionare le suture nella parte superiore della chiglia, perché la pelle qui non sarà in grado di tenere.

7. Restituire l'animale alla soluzione senza anestesia

1. Sollevare il piatto Petri con l'animale e immergere entrambi molto delicatamente in acqua dolce solo 5 cm di profondità e lasciare che l'animale scivolare via.
   NOT: La profondità dell'acqua poco profonda assicura che l'animale non tenterà di nuotare verso la superficie per respirare.
2. Non cambiare l'acqua durante la prima settimana.
3. Quando si nutrono gli animali, assicurarsi che il cibo sia posizionato vicino alla testa dell'animale.
   NOT: Lo scopo di queste misure è quello di evitare il maggior movimento possibile durante la prima settimana.

8. Ultrasuoni postoperatori

1. Prima della terminazione dell'anestesia, utilizzare un sistema a ultrasuoni ad alta frequenza per acquisire immagini della lesione che possono essere utilizzate per la costruzione di immagini tridimensionali del sito SCI.
2. Attaccare il trasduttore a un micromanipolatore preferibilmente regolato da un joystick remoto.
3. Immergere l'animale anestetizzato nella posizione prona in un piccolo contenitore riempito con soluzione anestetica.
   NOT: Fissare l'animale con sacchi di sabbia in miniatura o altre attrezzature per evitare il movimento durante la sequenza di scansione.
4. Allineare la punta del trasduttore con l'asse di lunghezza dell'animale e immergerlo nella soluzione di benzocaina fino a poco più millimetri sopra la chiglia dietro gli arti posteriori dell'animale.
5. Identificare il sito SCI.
   NOT: Il sito di lesioni è facilmente riconoscibile a causa dei processi spinosi mancanti direttamente sopra la SCI.
6. Ottimizzare l'immagine regolando le impostazioni degli ultrasuoni. Assicurarsi che il sito SCI si trova al centro dell'immagine. Regolare il campo visivo (ad esempio, profondità dell'immagine, scostamento della profondità e larghezza dell'immagine) per coprire il sito SCI e il tessuto sano adiacente. Regolare il guadagno bidimensionale per ottimizzare il contrasto dell'immagine.
7. Spazzando il trasduttore ad ultrasuoni attraverso il sito SCI con un micromanipolatore azionato elettronicamente, acquisire immagini in modalità B che coprono il sito SCI in più posizioni sagittali trasversali, con fette consecutive con un intervallo trasversale acquisire immagini cine contenenti 500 fotogrammi con una frequenza fotogrammi di 50 fotogrammi/s e una frequenza di trasduttore di 40 MHz.
   NOT: Questa configurazione richiede un micromanipolatore elettronico governato da un joystick remoto (passaggio 8.2).
8. Dopo aver terminato la sequenza di scansione tornare al punto 7.

Risultati

Lo scopo del protocollo è quello di produrre una SCI che paralizzerà le funzioni motorie e sensoriali caudale alla lesione. Poiché l'axolotl è competente per la rigenerazione, ripristina la funzione in poche settimane, consentendo ai ricercatori di studiare la rigenerazione del SNC per un breve lasso di tempo.

L'anestesia è stata fornita per 45 min a tutti gli animali, e non sono stati sperimentati episodi di recupero pretermine. Tutti gli animali si sono ripresi entro un'ora e non hanno mostr...

Discussione

Poiché il rischio di lesioni al midollo spinale è significativo, le fasi critiche del protocollo sono la rimozione dei processi spinosi e l'allargamento dell'accesso osseo al canale spinale, se necessario. Come accennato nel protocollo, si raccomanda vivamente di rimuovere il processo più cranico. Ciò significa che i processi più caudali proteggono il midollo spinale da essere colpiti dalle forbici. Si raccomanda di garantire un accesso chirurgico sufficiente, il che significa non fare troppo piccolo un'incisione primari...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
25 g asta cadente personalizzata
			su misura
Acetone	Sigma-Aldrich	67-64-1	Propanone
Axolotl (Ambystoma mexicanum)	Exoterra GmbH	N/A	12-22 cm e 10 g - 80 g, Tutti i ceppi (wildtype, melanoide, bianco, albino, bianco transgenico con GFP)
Benzocaina	Sigma-Aldrich	94-09-7	etile 4-amminobenzoato
Electromaget	personalizzato fatto
Excel 2010		Microsoft N / A	Excel 2010 o più recente
ImageJ	National Institutes of Health		ImageJ 1.5e o più recente. Rasband, W.S., ImageJ, Istituti Nazionali di Sanità degli Stati Uniti, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.
Kimwipes
Strumenti microchirurgici	N/A	N/A	Pinze e forbici
MS550s	Fujifilm, Visualsonics	MS550s	40 MHz frequenza centrale, trasduttore
MS700	Fujifilm, Visualsonics	MS700	50 MHz frequenza centrale, trasduttore
Piastra di Petri	qualsiasi maker
Panno	morbidoN/A	N/A	Qualsiasi pezzo di stoffa morbida di circa 70 x 55 cm2 ad es. uno strofinaccio
Stereomicroscopio
Vevo 2100	Fujifilm, Visualsonics	Vevo 2100	Sistema a ultrasuoni ad alta frequenza

tubo in PVC da 30 mm fatto in casa in casa