Descriviamo protocolli per la determinazione della struttura del dominio iKK-binding di NEMO dalla cristallografia a raggi X. I metodi includono l'espressione proteica, la purificazione e la caratterizzazione, nonché strategie per il successo dell'ottimizzazione dei cristalli e la determinazione della struttura della proteina nella sua forma non associata.
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Articolo metodologico
Produzione, cristallizzazione e determinazione della struttura del dominio iKK-binding di NEMO
In questo articolo
Sommario
Abstract
NeMO è una proteina di impalcatura che svolge un ruolo essenziale nel percorso NF-B assemblando il complesso IKK con le chinasi IKK e IKK. Al momento dell'attivazione, il complesso ifosofolaIKK le molecole IB che portano alla traslocazione nucleare NF-B e all'attivazione dei geni bersaglio. L'inibizione dell'interazione NEMO/IKK è un paradigma terapeutico interessante per la modulazione dell'attività del percorso NF-B, rendendo NEMO un bersaglio per la progettazione e la scoperta degli inibitori. Per facilitare il processo di scoperta e ottimizzazione degli inibitori NEMO, abbiamo progettato un costrutto migliorato del dominio di NEMO che lega IKK di NEMO che consentirebbe la determinazione della struttura della proteina nella forma apoe e mentre è legato a piccoli inibitori del peso molecolare. Qui, presentiamo la strategia utilizzata per la progettazione, l'espressione e la caratterizzazione strutturale del dominio iKK-binding di NEMO. La proteina è espressa in cellule di E. coli, solubilificate in condizioni di detonazione e purificate attraverso tre passaggi cromatografici. Discutiamo i protocolli per ottenere cristalli per la determinazione della struttura e descriviamo le strategie di acquisizione e analisi dei dati. I protocolli troveranno ampia applicabilità alla determinazione della struttura di complessi di NEMO e piccoli inibitori di molecole.
Introduzione
La via NF-B viene attivata in risposta a una varietà di stimoli, tra cui citochine, prodotti microbici e stress, per regolare l'espressione dei geni bersaglio responsabili della risposta infiammatoria e immunitaria, della morte o della sopravvivenza cellulare e della proliferazione1. Le patologie, tra cui malattie infiammatorie e autoimmuni e cancro2,3,4,5 sono state correlate all'iperattivazione del percorso, che ha reso la modulazione dell'attività nF-B un obiettivo primario per lo sviluppo di nuove terapie
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Protocollo
1. Progettazione del costrutto per la cristallografia
- Clonare la sequenza di NEMO-EEAA come nella precedente pubblicazione12 in un vettore per l'espressione in E. coli utilizzando il promotore T7, tra cui un tag esa-issidina N-terminale e un sito di cleavazione proteasi.
NOTA: In questo protocollo, abbiamo usato un vettore modificato per includere un tag esa-istidina A N-terminale e un sito di scissione Tobacco Etch Virus (TEV)10. Questo vettore facilita la scissione del suo tag per la cristallizzazione delle proteine e lascia solo la breve estensione dei residui di GSW prima dell'inizio della seque....
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Risultati
Clonazione, espressione e purificazione del dominio iKK-binding di NEMO.
Il protocollo è seguito in questo studio per ottenere la sequenza finale di NEMO-EEAA(Figura 1A), che produceva cristalli di qualità di diffrazione, che prevedeva l'espressione e la caratterizzazione di tutti i costrutti intermedi, inclusa l'aggiunta degli adattatori a bobina a N- e o C-terminus, le mutazioni C76A, C95S e le mutazioni E56A, E57A. Figura 1
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Discussione
I tentativi di cristallizzazione di NEMO in forma non associata non hanno avuto successo, inclusi i tentativi di utilizzo della proteina a lunghezza intera e diversi costrutti di troncamento che comprendono il dominio di legame IKK. La nostra caratterizzazione biofisica del dominio iKK-binding di NEMO (residui 44-111) da dichroismo circolare, spettroscopia NMR e anisotropia fluorescenza ha indicato che il costrutto, anche se in grado di legare IKK, esisteva in uno stato di scambio conformativo, non adatto per la cristall.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo il professor D. Madden, per molte discussioni utili durante questo progetto. Ringraziamo il prof. Ringraziamo il Dottor B. Guo per i plasmidi NEMO. Ringraziamo Christina R. Arnoldy, Tamar Basiashvili e Amy E. Kennedy per aver dimostrato la procedura. Ringraziamo il BioMT Crystallography Core Facility e i dipartimenti di Chimica e di Biochimica & Biologia Cellulare a Dartmouth per l'uso delle attrezzature di cristallografia e del personale BioMT per il loro supporto. Questa ricerca ha utilizzato la linea di fascio AMX del National Synchrotron Light Source II, un U.S. Department of Energy (DOE) Office of Science User Facility gestito per l'Ufficio DOE della ....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 20% p/v γ-PGA (forma Na+, LM) | Dimensioni molecolari | MD2-100-150 | Per la cristallizzazione a schermo fine di NEMO-EEAA |
| 3,5 kDa MWCO Spettri della membrana per dialisi | 132724 | Per la rimozione in dialisi dell'imidazolo | |
| Millipose a cellule agitate Amicon | Sigma | UFSC 05001 | Per la concentrazione di proteine |
| Cloruro di ammonio | Millipore Sigma | G8270 | Per la marcatura minima dei terreni |
| Benzonasi Nucleasi | Millipore Sigma | 9025-65-4 | Per la digestione dell'acido nucleico |
| BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Cellule competenti | Tecnologie Agilent Modello | : 230245 | Espressione TEV |
| CryoPro | Hampton Research | HR2-073 | Kit crioprotettori |
| D-glucosio (destrosio) | Millipore Sigma | A9434 | Per Etichettatura minima dei terreni |
| Difco Terrific Brodo | ThermoFisher | DF043817 | Per la crescita delle colture |
| Ditiotreitolo > 99% | Goldbio | DTT25 | Per la riduzione dei disolfuri |
| E. coli: Rosetta 2 (DE3) | Novagen | 71400-3 | Espressione del formulatore NEMO-EEAA non marcato |
| Formulatrix | Gestore di liquidi/ costruttore di schermi | ||
| HCl & ndash; Soluzione 1.0 M | Hampton Research | HR2-581 | Per la cristallizzazione su schermo fine di NEMO-EEAA |
| HiLoad 16/600 Superdex 75 pg | GE Healthcare | 28989333 | Per la purificazione ad esclusione dimensionale |
| Colonna HisTrap HP da 5 mL | GE Healthcare | 17524802 | Per la purificazione di NEMO-EEAA |
| HT 96 MIDAS | con tag His-Dimensions molecolari | MD1-59 | Per lo screening a matrice sparsa di NEMO-EEAA |
| HT 96 Dimensioni | molecolari | MD1-46 | Per lo screening di matrici sparse di NEMO-EEAA |
| Imidazolo | ThermoFisher | 288-32-4 | Per l'eluizione dalla colonna His-trap |
| Isopropil-beta-D-tiogalattoside | Goldbio | I2481C5 | Per l'induzione di colture |
| Piastra di cristallizzazione MRC2 | Hampton Research | HR3-083 | Piastra di cristallizzazione |
| NT8 - Drop Setter | Formulatrix | Cristallizzazione | |
| pET-16b | Millipore Sigma | 69662 | Per la clonazione di NEMO-EEAA |
| pET-45b | Millipore Sigma | 71327 | Per la clonazione di NEMO-EEAA |
| Fenilmetilsulfonile fluoruro | ThermoFisher | 36978 | Per l'inibizione delle proteasi |
| Flacone in policarbonato per l'uso in Ultracentrifuga Rotore Tipo 45 Ti | Beckmann Coulter | 339160 | Flacone per ultracentrifuga |
| Glicole polietilenico 20.000 | Hampton Research | HR2-609 | Per la cristallizzazione a schermo fine di NEMO-EEAA |
| pRK793 (TEV) | Addgene | Plasmid 8827 | Per la produzione di TEV |
| QuikChange XL II | Agilent Technologies | 200522 | Mutagenesi diretta al sito |
| Assemblaggio del tappo richiesto: | Beckmann Coulter | 355623 | Tappo di bottiglia Ultracenttrifuge |
| ROCK IMAGER | Formulatrix | Crystallization Imager | |
| Kit di perline di semi | Hampton Research | HR2-320 | Generazione di semi |
| Cloruro di sodio ≥ 99% | Millipore Sigma | S9888 | Per il tamponamento di soluzioni di purificazione |
| TCEP (Tris (2-Carbossiethyl) phosphine Hydrochloride) | Goldbio | TCEP1 | Agente riducente |
| Lo schermo Berkeley | Rigaku | MD15-Berekely | Per lo screening a matrice sparsa di NEMO-EEAA |
| Lo schermo PGA | Dimensioni molecolari | MD1-50 | Per la cristallizzazione a schermo fine di NEMO-EEAA |
| Tris – 1.0 M Solution | Hampton Research | HR2-589 | Per la cristallizzazione a schermo fine di NEMO-EEAA |
| Tris Buffer ultrapuro (polvere | Thermofisher | 15504020 | Per il tamponamento delle soluzioni di purificazione |
| Urea | ThermoFisher | 29700 | Per la denaturazione di NEMO-EEAA |
Riferimenti
- Gilmore, T. D. Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives. Oncogene. 25 (51), 6680-6684 (2006).
- Bassères, D. S., Baldwin, A. S. Nuclear factor-kappaB and inhibitor of kappaB kinase pathways in oncogenic initiation and progression. Oncog....
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Ristampe e permessi
