Forniamo un protocollo per l'isolamento della microglia da diverse regioni sezionate di un emisfero cerebrale adulto, seguito dalla preparazione della libreria semiautomatica per il sequenziamento profondo dell'RNA unicellulare di trascrittomi a lunghezza intera. Questo metodo aiuterà a chiarire l'eterogeneità funzionale della microglia in salute e malattia.
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Articolo metodologico
Isolamento di Microglia specifico della regione da un emisfero cerebrale di topi adulto per il sequenziamento profondo dell'RNA a singola cellula
In questo articolo
Sommario
Abstract
Come macrofagi residenti nel sistema nervoso centrale, microglia controllano attivamente lo sviluppo cerebrale e l'omeostasi, e le loro disfunzioni possono guidare le malattie umane. Sono stati compiuti notevoli progressi per scoprire le firme molecolari della microglia omeostatica e le alterazioni della loro espressione genica in risposta agli stimoli ambientali. Con l'avvento e la maturazione delle metodologie genomiche unicellulari, è sempre più riconosciuto che la microglia eterogina può essere alla base dei diversi ruoli che svolgono in diverse condizioni di sviluppo e patologiche. Un'ulteriore dissezione di tale eterogeneità può essere ottenuta attraverso un isolamento efficiente delle microglia da una determinata regione di interesse, seguito da una profilazione sensibile delle singole cellule. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per il rapido isolamento della microglia da diverse regioni del cervello in un singolo emisfero certo adulto. Dimostriamo anche come utilizzare queste microglia ordinate per il sequenziamento profondo dell'RNA a cellule a base di piastre. Discutiamo l'adattabilità di questo metodo ad altri scenari e forniamo linee guida per migliorare il sistema per accogliere studi su larga scala.
Introduzione
Le microglia, che rappresentano il 5%-10% di tutte le cellule neurali, sono macrofagi residenti sparsi in tutto il sistema nervoso centrale (SNC)1. Protetto dietro barriera emato-encefalica, microglia tipica in un cervello adulto sano contengono molti processi fini che si estendono rapidamente e si ritraggono per interagire con i neuroni e altre cellule gliali nel parenchyma. La microglia può anche adottare la morfologia ameboide associata ad una maggiore funzione fagocitica durante specifiche fasi di sviluppo o su sfide immunitarie in lesioni e malattie1,2,....
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Protocollo
Tutte le procedure che coinvolgono roditori sono conformi alle linee guida della Stanford University, che rispettano le leggi e le politiche nazionali e statali. Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal gruppo amministrativo della Stanford University sulla cura degli animali da laboratorio.
NOT: Tutte le composizioni di soluzioni e buffer sono disponibili nella Tabella dei materiali.
1. Preparazione il giorno dell'isolamento cellulare
- Preparare i seguenti reagenti e raffreddarli sul ghiaccio: medio A (50 mL), buffer di smistamento cellulare ad a....
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Risultati
Questo protocollo descrive un metodo per isolare e ordinare microglia da diverse regioni del cervello in un emisfero cerebrale perfuso adulto, seguito da scRNA-seq. Usiamo il douncing per creare sospensioni a singola cellula e anche come primo passo per arricchire la microglia. Insufficiente o sovradosso riduce la resa. Inoltre, cervelli di topi adulti contengono alti livelli di mielina, che può anche ridurre l'efficienza di selezione e la resa se non rimosso correttamente. Pertanto, esaminiamo la sospensione cellulare a.......
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Discussione
Microglia interagiscono attivamente con altri tipi di cellule nel SNC, e sono molto sensibili agli stimoli ambientali. Al fine di ridurre al minimo le risposte infiammatorie e i cambiamenti aberranti nella loro espressione genica durante il processo di isolamento, questo protocollo è stato semplificato da un metodoprecedentementepubblicato 9 ed è ora adatto per isolare la microglia da più regioni di un singolo emisfero cerebrale del topo in parallelo. I tessuti e i reagenti sono tenuti a temperatu.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Mariko L. Bennett, Liana Nicole Bonanno e Spyros Darmanis per il loro aiuto durante lo sviluppo di questo protocollo. Ringraziamo anche lo Stanford Shared FACS Facility, in particolare Meredith Weglarz e Lisa Nichols; Yen Tran, Michael Eckart di Stanford Protein and Nucleic Acid Facility (PAN) per il loro grande supporto per le riprese. Questo lavoro è finanziato dalla Fondazione JPB e dalla Fondazione Vincent J. Coates.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 5 M Betaina | Sigma-Aldrich | Cat# B0300-5VL | |
| 10 mM dNTP miscela | Thermo Fisher Scientific | Cat# R0192 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific Cat | # 15575020 | |
| 10X Hanks' Soluzione salina bilanciata | Thermo Fisher Scientific | Cat# 14185-052 | |
| 1 M HEPES | Thermo Fisher Scientific Cat | # 15630080 | |
| 1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix | Kapa Biosciences | Cat# KK2602 | |
| Provetta in polistirene a fondo tondo da 5 mL, con tappo del filtro | cellulare Corning | Cat# 352235 | |
| AATI, kit di analisi dei frammenti NGS ad alta sensibilità (1 bp – 6.000 bp) | Advanced Analytical | Cat# DNF-474-1000 | |
| Albumina sierica bovina | Sigma Aldrich | Cat# A8806 | |
| DNase I | Worthington | Cat# LS002007 | Soluzione di lavoro: 12500 unità/ml |
| DTT, grado molecolare | Promega | Cat# P1171 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4456740 | |
| Siero fetale bovino | Thermo Fisher Scientific | Cat# 10437-028 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indici) | Illumina | Cat# FC-131-2001 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indici) | Illumina | Cat# FC-131-2002 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indici) | Illumina | Cat# FC-131-2003 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indici) | Illumina | Cat# FC-131-2004 | |
| Lambda Esonucleasi (5 U/μ l) | New England BioLabs | Cat# M0262S | |
| Mouse Fc block | BD Pharmingen | Cat# 553142 | |
| Perline per la rimozione della mielina | Miltenyl Biotec | Cat# 130-096-433 | |
| Nextera XT Kit di preparazione del campione di DNA | Illumina | Cat# FC-131-1096 | |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 cicli) | Illumina | Cat# 20024907 | |
| PBS ( 10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 70011044 | |
| Perline PCRClean DX | Aline Biosciences | Cat# C-1003-50 | |
| Ioduro di propidio | Thermo Fisher Scientific Cat | # P3566 | Colorazione: 1:1000 |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermal Fisher Scientific | Cat# Q32851 | |
| Monoclonale di ratto anti topo/umano CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70) | BioLegend | Gatto# 101236; RRID: AB_11203704 | Colorazione: 1:300 |
| Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625 | Colorazione: 1:300 |
| Inibitore della RNasi ricombinante | Takara Bio | Cat# 2313B | |
| SMARTScribe Trascrittasi inversa (100 U/μ l) | Clontech | Cat# 639538 | Contenente 5x |
| Oligonucleotidi tampone strong | |||
| 0.1 μ M ISPCR Oligo: 5' - AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3' | (Picelli et al., 2014) | ||
| Oligo-dT30VN primer: 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3' | (Picelli et al., 2014) | ||
| TSO 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' ("r" è per forribobasi e "+" è per una base LNA) | (Picelli et al., 2014) | ||
| Solutions | |||
| FACS tampone | Ricetta: 1% FBS filtrato sterile, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS | ||
| MCS tampone | Ricetta: 0,5% BSA filtrato sterile, 2 mM EDTA in 1X PBS | ||
| Medium A | Ricetta: 15 mM HEPES, 0,5% glucosio in 1X HBSS senza rosso fenolo | ||
| Plates | |||
| 384 pozzetti Rigi-Plate PCR Micropiastre, Axygen Scientific | VWR | 89005-556 | |
| Piastre PCR a 96 pozzetti | Bio-Rad | HSP9631 | |
| Others | |||
| Dumont #55 pinze | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Omogeneizzatore Dounce, 2 ml | Wheaton | ||
| Colonna di esaurimento grande | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Colonna di selezione grande | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Separatore QuadroMACS | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RNAzap | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Filtro (70 μ m) | Falcon | 352350 | |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II | BD Biosciences | http://www.bdbiosciences.com/ | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| Analizzatore di frammenti | Agilent | 5300 | |
| Mosquito HTS robot di pipettaggio nanolitri | TTP Labtech | https://www.ttplabtech.com/ | |
| Qubit 4 Fluorimetro | Thermo Fisher Scientific | Q33226 |
Riferimenti
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Li, Q., et al. Developmental Heterogeneity of Microglia and Brain Myeloid Cells Revealed by Deep Singl....
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