Utilizzando le cellule epiteliali primarie umane, riportiamo un nuovo metodo privo di biomarcatori di caratterizzazione funzionale delle cellule staminali da un saggio di ritenzione di etichette basato su sferoidi. Viene descritto un protocollo passo-passo per l'etichettatura delle celle 2D BrdU, CFSE o Far Red; formazione di sferoidi tridimensionali; l'identificazione delle cellule staminali di conservazione dell'etichetta mediante immunocitochimica; e l'isolamento da parte della FACS.
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Articolo metodologico
Isolamento di cellule simili a stelo dalle colture speroidi a 3 dimensioni
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nonostante i progressi nella ricerca sulle cellule staminali adulte, l'identificazione e l'isolamento delle cellule staminali dai campioni di tessuto rimane una sfida importante. Mentre le cellule staminali residenti sono relativamente quiescenti con vincoli di nicchia nei tessuti adulti, entrano nel ciclo cellulare in coltura tridimensionale senza ancora (3D) e subiscono sia la divisione cellulare simmetrica che asimmetrica, dando origine sia al gambo che al progenitore Cellule. Questi ultimi proliferano rapidamente e sono la popolazione cellulare principale in varie fasi dell'impegno di lignaggio, formando sferoidi eterogenei. Utilizzando le normali cellule epiteliali della prostata umana primaria (HPrEC), è stato sviluppato un saggio basato su sferoide di ritenzione di etichette che consente l'identificazione e l'isolamento funzionale delle cellule staminali che lo sferoide operino a una risoluzione a singola cellula.
HPrEC o linee cellulari sono bidimensionali (2D) coltivate con BrdU per 10 giorni per consentire la sua incorporazione nel DNA di tutte le cellule che si dividono, comprese le cellule staminali auto-rinnovanti. Wash out inizia al momento del trasferimento alla coltura 3D per 5 giorni, durante i quali le cellule staminali si auto-rinnovano attraverso la divisione asimmetrica e avviano la formazione di sferoidi. Mentre le cellule staminali figlie relativamente quiescenti conservano il DNA parentale etichettato da BrdU, i progenitori della figlia proliferano rapidamente, perdendo l'etichetta BrdU. BrdU può essere sostituito con CFSE o Far Red pro-dyes, che consentono l'isolamento delle cellule staminali vive da FACS. Le caratteristiche delle cellule staminali sono confermate dalla formazione in vitro sferoide, dai saggi di rigenerazione dei tessuti in vivo e dalla documentazione delle loro divisioni cellulari simmetriche/asimmetriche. Le cellule staminali isolate che conservano l'etichetta possono essere rigorosamente interrogate da studi molecolari e biologici a valle, tra cui RNA-seq, ChIP-seq, cattura a singola cellula, attività metabolica, profilazione del proteoma, immunocitochimica, formazione di organiidi e rigenerazione dei tessuti in vivo. È importante sottolineare che questo approccio di isolamento delle cellule staminali funzionali privo di marcatori identifica le cellule staminali provenienti da campioni di cancro freschi e linee cellulari tumorali di più organi, suggerendo un'ampia applicabilità. Può essere usato per identificare biomarcatori cellulari simili a tumori, prodotti farmaceutici di schermata che prendono di mira le cellule staminali tumorali e scoprire nuovi bersagli terapeutici nei tumori.
Introduzione
La ghiandola prostatica umana contiene epitelio luminoso con funzione secretoria e cellule basali sottostanti insieme a un insolito componente delle cellule neuroendocrine. Le cellule epiteliali, in questo caso, sono generate da una rara popolazione di cellule staminali prostate che sono relativamente quiescenti in vivo e fungono da sistema di riparazione per mantenere l'omeostasi ghiandolare per tutta la vita1. Nonostante molti progressi, l'identificazione e l'isolamento funzionale delle cellule staminali prostata rimane una sfida importante nel settore. I biomarcatori delle cellule staminali staminali, comprese le metodologie basate su marcat....
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Protocollo
Tutte le manipolazioni delle cellule e i preparati dei supporti devono essere eseguiti con tecnica asettica in un mobile di sicurezza biologica di classe II (BSC).
1. Cultura e manutenzione delle cellule HPrEC in 2D
- Cappotto 100 mm piatti di coltura con 2 mL di 2,5 g / cm2 soluzione fibronectina durante la notte a temperatura ambiente (RT). Aspirare la soluzione e lasciare asciugare i piatti della coltura nel BSC per 45 min.
- Aggiungere 9 mL del mezzo di crescita delle cellule epiteliali prostata (ad esempio, PrEGM) in un piatto di coltura di 100 mm rivestito di fibronectina e mantenere il piatto caldo in un'in....
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Risultati
Le normali cellule epiteliali umane primarie vengono inserite in piatti di coltura rivestiti di fibronectina e la crescita cellulare è mantenuta nellacoltura2D ( Figura 1a). Al momento del trasferimento nella coltura 3D con una matrice di membrana seminterrato, le cellule epiteliali differenziate si esauriscono lentamente. Solo le cellule staminali della prostata possono sopravvivere in una coltura senza ancora e formare sferoidi in 5 giorni (Figura 1
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Discussione
La citometria di flusso con più marcatori di superficie di cellule staminali è un approccio comunemente usato per la ricerca sulle cellule staminali, nonostante manchi sia di specificità che di selettività1,5,6. Mentre la formazione di sferoidi in un sistema di coltura 3D è un altro metodo utile per arricchire la popolazione di cellule staminali rare da cellule epiteliali primarie, tra cui HPrEC, gli sferoidi risultanti sono anc.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno rapporti finanziari da rivelare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni del National Cancer Institute R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH). Ringraziamo il Flow Cytometry Core dell'Università dell'Illinois a Chicago per l'assistenza sullo smistamento delle cellule.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,05% Tripsina-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Siringhe per tubercolina da 1 mL | Bectin Dickinson | BD 309625 | |
| Provette per microcentrifuga da 1,5 mL, piastre di coltura sterili | |||
| da 100 mm | Piastra di coltura Corning/Falcon | 353003 | |
| 12 pozzetti | Centrifuga Corning/Falcon | 353043 | |
| da 15 mL tubi | Corning/Falcon | 352097 | |
| vetrini coprioggetti 22 x 22 mm, quadrati | Corning | 284522 | Per MatTek Piatto di coltura da 35 mm |
| 24 x 50 mm Vetrini coprioggetti | Corning | 2975245 | |
| 26G x 1,5 pollici Ago ipodermico | Monoject | 1188826112 | |
| 2N HCl | |||
| 35 mm con coperchio fondo in vetro | MatTek Corp | P35G-0-10-C | Fondo in vetro n. 0, non rivestito,  irradiato |
| 40 µ filtro cellulare in nylon a poro | m Corning | 352340 | |
| incubatore per coltura CO2 al 5%, 37 gradi C | Forma | ||
| Provette da centrifuga da 50 ml | Corning/Falcon | 352098 | |
| Provetta a fondo tondo in polistirene da 5 ml con tappo a scatto | Corning | 352235 | 35 &; m Piastre |
| coltura a 6 pozzetti | in rete di nylon Corning | 353046 | |
| Vetrini per camera a 8 pozzetti | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Terreno di montaggio acquoso contenente DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | A colorante fluorescente nucleare |
| Cabina di sicurezza biologica, certificata | |||
| BrdU di livello 2 (5-bromo-2'-deossiuridina) | Sigma-Aldrich | B5002 | 1 mM soluzione madre in DMSO |
| Centrifuga per provette da microcentrifuga da 1,5 mL | Eppendorf | ||
| Centrifuga per provette da 15 mL | Beckman Coulter | Allegra 6 | |
| CFSE (carbossifluoresceina succinimidil estere) | Thermo Fisher Scientific | C34554 | 5 mM soluzione madre in DMSO |
| citocalasina D | Thermo Fisher Scientific | ||
| Dispase 1U/mL | StemCell Technologies | 07923 | |
| FACS CellSorter MoFlo XDP | Beckman Coulter | s | |
| Far-Red pro-dye | Thermo Fisher | C34564 | 5 mM soluzione madre in DMSO |
| Siero fetale bovino (FBS) | |||
| Fibronectina | Sigma-Aldrich | F0895 | Per il rivestimento di piastre di coltura da 100 mm |
| Microscopio fluorescente con fotocamera digitale a colori | Microscopio fluorescente Carl Zeiss | Axioskop 20; digitale a colori Axiocamera | |
| Capra anti-topo IgG (H+L) Anticorpo secondario altamente adsorbito, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11029 | |
| HPrEC (Cellule epiteliali prostatiche umane normali primarie) | Lifeline Cell Technology | FC-0038 | Raggruppato da 3 giovani donatori di organi liberi da malattia (19-21 anni); 1 x 105 cellule/mL; conservato in secchiello |
| per il ghiaccio | |||
| Microsope invertito con fotocamera | |||
| Matrigel, basso fattore di crescita, privo di rosso fenolo | Corning | 356239 | |
| Metanolo | Corning | A452-4 | |
| Anticorpo anti-BrdU di topo | Segnalazione cellulare | 5292S | |
| Anticorpo IgG di topo ( controllo negativo) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Siero di capra normale | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,4 | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Pipettatori e punte, varie dimensioni | |||
| PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium) | Lifeline Cell Technology | LL-0041 | |
| Ioduro di propidio (PI) | R & D Sistemi | 5135/10 | 10 μ g/mL di PI in PBS conservato a 4 ° C nel buio |
| Pipette sierologiche, varie dimensioni | |||
| Software per il conteggio delle sfere e le misure | |||
| Software: Immagini 3D con Imaris un software di imaging con capacità | |||
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Bagnomaria, 37 ° Immagini C | |||
| z-stack con un microscopio |
Riferimenti
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single cell. Nature. 456, 804-808 (2008).
- Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells. Stem Cells
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Ristampe e permessi
