Fluorescenza della riflessione interna totale ad alto consumo e microscopia della ricostruzione ottica stocastica diretta utilizzando un chip fotonico

Summary

La microscopia ottica a super-risoluzione basata su chip è un nuovo approccio alla microscopia a fluorescenza e offre vantaggi in termini di efficacia in termini di costi e produttività. Qui vengono mostrati i protocolli per la preparazione e l'imaging dei chip per la microscopia TIRF e la microscopia a super-risoluzione basata sulla localizzazione.

Abstract

La fluorescenza totale della riflessione interna (TIRF) è comunemente utilizzata nella microscopia a super-risoluzione basata sulla localizzazione a singola molecola in quanto fornisce un contrasto maggiore a causa del sezionamento ottico. L'approccio convenzionale consiste nell'utilizzare obiettivi TIRF al microscopio ad alta apertura numerica sia per l'eccitazione che per la raccolta, limitando gravemente il campo visivo e la velocità effettiva. Vi presentiamo un nuovo approccio per generare eccitazione TIRF per l'imaging con guide d'onda ottiche, chiamato nanoscopia basata su chip. Lo scopo di questo protocollo è dimostrare come l'imaging basato su chip viene eseguita in una configurazione già costruita. Il vantaggio principale della nanoscopia basata su chip è che i percorsi di eccitazione e raccolta sono disaccoppiati. L'imaging può quindi essere fatto con un obiettivo a basso ingrandimento, con conseguente ampio campo visivo immagini TIRF, al prezzo di una piccola riduzione della risoluzione. Le cellule endoteliali sinusoidali del fegato (LSEC) sono state immagini utilizzando una microscopia ottica diretta stocastica (dSTORM), mostrando una risoluzione paragonabile ai tradizionali microscopi a super-risoluzione. Inoltre, dimostriamo le capacità ad alto velocità effettiva esaminando una regione di 500 m x 500 m con un obiettivo a basso ingrandimento, fornendo una risoluzione di 76 nm. Attraverso il suo carattere compatto, l'imaging basato su chip può essere adattato ai microscopi più comuni e può essere combinato con altre tecniche ottiche su chip, come il rilevamento su chip, la spettroscopia, l'intrappolamento ottico, ecc. La tecnica è quindi ideale per l'imaging ad alta velocità di continuità con super-risoluzione 2D, ma offre anche grandi opportunità per l'analisi multimodale.

Introduction

Dalla dimostrazione iniziale della microscopia di localizzazione a singola molecola, molte variazioni sono state sviluppate per risolvere diverse sfide^1,2,3. Una sfida che è rimasta, tuttavia, è l'imaging dSTORM di ampio campo visivo. Molte configurazioni dSTORM utilizzano la stessa lente obiettivo sia per eccitare il campione che per immaginarlo. Per aumentare il campo visivo, è necessaria una lente di ingrandimento bassa. Le lenti obiettive a bassa ingrandimento e bassa apertura numerica (NA) hanno in genere una grande profondità di campo, con un conseguente aumento del segnale fuori dal piano che ridurrà la precisione di localizzazione. Gli obiettivi TIRF sono comunemente utilizzati per aumentare il contrasto dell'immagine riducendo la fluorescenza fuori dal piano. Attraverso TIRF, l'eccitazione è limitata a uno spessore ottico di circa 150 nm dalla superficie per mezzo di un campo evanescente⁴. Le lenti obiettivo TIRF richiedono una grande NA che si traduca in un piccolo campo visivo (FOV) (ad esempio, 50 x 50 m²), che limita significativamente la velocità effettiva. Esistono, tuttavia, modi alternativi per generare un campo evanescente.

Una guida d'onda ottica è una struttura che confina e guida la luce se viene accoppiata nella struttura. Più comunemente, guide d'onda sono utilizzati in telecomunicazioni a base di fibra. Grande sforzo è stato fatto al fine di sviluppare guide d'onda integrate 2D come componente principale dei circuiti integrati fotonici. La tecnologia è avanzata a un punto in cui la fabbricazione di guide d'onda ottiche nanostrutturate a bassa perdita può essere regolarmente eseguita⁵. Oggi, diverse fonderie in tutto il mondo possono essere utilizzate per sviluppare circuiti integrati fotonici. Le guide antionde guidano la luce attraverso la riflettanza interna totale che mostra anche un campo evanescente in superficie. Con un'attenta progettazione della struttura della guida d'onda, si può ottenere un'alta intensità nel campo evanescente. Un campione posizionato direttamente sopra la superficie della guida d'onda può quindi essere illuminato anche dal campo evanescente per applicazioni di imaging. Il campo evanescente sarà generato lungo l'intera lunghezza e larghezza della guida d'onda, e quindi può essere reso arbitrariamente grande⁶.

Vi presentiamo un nuovo approccio a TIRF dSTORM che offre un campo visivo arbitrariamente ampio. Invece di usare una lente TIRF sia per l'eccitazione che per la raccolta, entusiasmiamo usando il campo evanescente delle guide d'onda ottiche. Questo disaccoppia il percorso di luce di eccitazione e raccolta, consentendo la totale libertà lungo il percorso di luce di raccolta senza compromettere la sezionamento ottico per una determinata lunghezza d'onda fornita dall'illuminazione del chip guida d'onda. Le lenti a basso ingrandimento possono quindi essere utilizzate per l'immagine di regioni molto grandi in modalità TIRF, anche se una NA più piccola ridurrà la risoluzione laterale. Inoltre, l'imaging multicolore è anche notevolmente semplificato utilizzando guide d'onda⁷, in quanto diverse lunghezze d'onda possono essere guidate e rilevate senza riadattare il sistema. Questo è vantaggioso per dSTORM, in quanto le basse lunghezze d'onda possono essere utilizzate per migliorare il fluoroforo lampeggiante e per l'imaging multicolore. Vale la pena notare che la profondità di penetrazione del campo evanescente cambierà in funzione della lunghezza d'onda, anche se non influisce sulle modalità di esecuzione della procedura di imaging. Il chip è compatibile con l'imaging a celle vive⁸ ed è ideale per applicazioni come l'integrazione della microfluidica. Ogni chip può contenere decine di guide d'onda, che possono consentire all'utente di immagine in condizioni diverse o applicare trapping ottico⁹ e spettroscopia Raman¹⁰.

Il sistema basato su chip funziona altrettanto bene sia per l'imaging con limitazione diffrazione che per l'imaging a super-risoluzione. Un approccio simile è stato introdotto nel 2005 utilizzando un prisma per generare eccitazione sul campo evanescente^{4 .} Il chip fotonico eccita anche attraverso il campo evanescente, ma con le moderne tecniche di fabbricazione della guida d'onda, si possono generare modelli di luce esotici con guide d'onda. L'attuale implementazione della nanoscopia basata su chip è limitata solo all'imaging 2D, poiché il campo di eccitazione è bloccato all'interno della superficie della guida d'onda. Lo sviluppo futuro sarà destinato alle applicazioni 3D. Inoltre, altre tecniche di super-risoluzione come la microscopia ad illuminazione strutturata sono in fase di sviluppo utilizzando lo stesso microscopio basato su chip¹¹.

Protocol

1. Preparazione dello strato polidimetiloxana (PDMS)

1. Preparare un mix 10:1 di Sylgard 184 monomero e agente di cura.
2. Mettere il composto in una camera a vuoto fino a quando le bolle d'aria non sono sparite.
3. Versare 1,7 g di miscela PDMS al centro di una parabola Petri da 3,5 pollici (diametro).
4. Posizionare il piatto Petri sul mandrino a vuoto di un rivestimento di spin.
5. Cappotto Petri per 20 s a 900 giri/min, con un'accelerazione di 75 giri/s.
6. Curare il piatto su una piastra calda a 50 gradi centigradi per almeno 2 h.

2. Preparazione del campione

1. Pulizia Waveguide
   1. Preparare 100 mL di una diluizione dell'1% del concentrato detergente per la pulizia (Tabella dei materiali)in acqua deionizzata (DI).
   2. Mettere il chip in una piastra di vetro Petri utilizzando una pinzetta di wafer e coprire completamente con la soluzione detergente.
   3. Disporre il piatto Petri su un piatto caldo a 70 gradi centigradi per 10 min.
   4. Mentre ancora sulla piastra calda, strofinare la superficie con un tampone di tessuto di pulizia.
   5. Togliere il chip dalla parabola Petri. Risciacquare con almeno 100 mL di acqua DI.
   6. Risciacquare con almeno 100 mL di isopropanolo, facendo attenzione che il solvente non si asciughi sulla superficie per evitare macchie di evaporazione.
   7. Risciacquare con almeno 100 mL di acqua DI. Soffia il chip a secco con una pistola ad azoto.
2. Preparazione della camera
   1. Preparare uno strato di 150 m poliditilsiloxane (PDMS) in un piatto di Petri (sezione 1).
   2. Utilizzare un bisturi per tagliare un telaio di 1,5 cm x 1,5 cm dallo strato PDMS.
   3. Sollevare il telaio dal piatto Petri con una pinzetta. Depositarlo piatto su un chip pulito e lucido. Il campione è ora pronto per il seeding delle cellule.
3. Etichettatura fluorescente
   1. Preparare le seguenti sostanze chimiche: soluzione salina tampone fosfata, soluzione di tintura, dbuffer di imaging STORM.
   2. Dopo il seeding delle cellule, rimuovere il chip dal supporto.
   3. Utilizzare una pipetta per rimuovere eventuali fluidi in eccesso dall'esterno della camera PDMS.
   4. Rimuovere il liquido corrente dall'interno della camera PDMS con una pipetta aggiungendo allo stesso tempo circa 60-L di PBS pulito.
      NOTA: l'importo aggiunto alla camera dovrà essere modificato in base alle dimensioni della camera. Fare attenzione a non rimuovere tutti i supporti dalla superficie cellulare.
   5. Sostituire il PBS con 60 gradi di PBS pulito e lasciarlo incubare per 1 min.
   6. Ripetere il passaggio precedente, lasciandolo incubare per 5 min questa volta.
   7. Rimuovere il PBS e sostituirlo con 60 gradi della soluzione di tintura. Lasciare il campione inincubare per circa 15 minuti, proteggendolo dalla luce.
      NOTA: questo passaggio potrebbe dover cambiare in modo significativo, a seconda del tinrito fluorescente utilizzato. Usiamo CellMask Deep Red per etichettare la membrana cellulare per questo esperimento
   8. Lavare l'esempio con PBS come nei passaggi 2.3.3-2.3.5.
   9. Rimuovere il PBS e sostituirlo contemporaneamente con 40 gradi di l del buffer di imaging.
      NOTA: Esistono diversi buffer di imaging per diversi coloranti fluorescenti.
   10. Posizionare un coperchio sulla parte superiore, evitando la formazione di bolle d'aria sotto. Premere delicatamente il coperchio sulla camera di imaging per rimuovere eventuali supporti in eccesso.
   11. Utilizzare una pipetta per rimuovere eventuali supporti in eccesso al di fuori del coperchio. Pulire l'area esterna al coperchio con un tampone umido d'acqua per evitare cristalli formati da residui di supporti a immersione essiccata.

3. Procedura di imaging

1. Impostazione dei componenti
   NOTA: Questa versione dell'installazione è costituita da tre componenti principali: il microscopio, la fase di accoppiamento e lo stadio di campionamento. Vedere la Tabella dei materiali.
   1. Utilizzare un microscopio con un supporto di filtro, una fonte di luce bianca, una fotocamera e un revolver obiettivo.
   2. Utilizzare una fase di accoppiamento piezo a 3 assi con un laser accoppiato in fibra e una lente di accoppiamento.
   3. Utilizzare uno stage campione manuale a un asse con punta e inclinazione e un supporto sottovuoto.
   4. Montare sia l'accoppiamento che la fase campione su una fase motorizzata a 2 assi per la traslazione campione.
2. Accoppiamento Waveguide
   1. Posizionare il chip sul mandrino a vuoto con la sfaccettatura di accoppiamento verso l'obiettivo di accoppiamento. Assicurarsi che il chip si trova approssimativamente di una lunghezza focale rispetto all'obiettivo di accoppiamento.
   2. Accendere la pompa a vuoto.
   3. Accendere il laser a 1 mW. Regolare approssimativamente l'altezza del chip in modo che il fascio colpisca il bordo di esso. Spegni il laser.
   4. Accendere la sorgente di luce bianca. Scegliere una lente obiettivo a basso ingrandimento (ad es. 10x). Concentrare il microscopio su una guida d'onda.
   5. Traduci il microscopio lungo la guida d'onda per vedere se è ben allineato con il percorso ottico. Spostare il microscopio sul bordo di accoppiamento.
   6. Accendere il laser a 1 mW o meno. Traduci il microscopio lungo il bordo di accoppiamento per trovare la luce laser. Mettere a fuoco il fascio sul bordo del chip.
   7. Regolare la fase di accoppiamento lungo il percorso ottico nella direzione che riduce la dimensione del punto del raggio laser fino a scomparire. Il fascio è ora sopra o sotto la superficie del chip.
   8. Regolare l'altezza della fase di accoppiamento fino a quando il punto del fascio riappare e non viene ingrandito.
   9. Ripetere i due passaggi precedenti fino a formare un punto focale.
   10. Spostare il punto focale sulla guida d'onda di interesse.
   11. Trasla il microscopio a breve distanza dal bordo in modo che il punto del fascio a fuoco non sia più visibile. Spegnere la luce bianca.
   12. Regolare il contrasto. Se la guida d'onda sta guidando, la luce diffusa lungo la guida d'onda dovrebbe essere chiaramente visibile.
   13. Regolare gli assi della fase di accoppiamento per massimizzare l'intensità della luce diffusa. Spegni il laser.
   14. Accendere la luce bianca. Regolare il contrasto se necessario.
   15. Passare alla regione di imaging.
3. Imaging limitato alla diffrazione
   1. Concentrarsi sull'obiettivo di imaging desiderato. Spegnere la luce bianca.
   2. Inserire il filtro a fluorescenza e ruotare la potenza laser a 1 mW.
   3. Impostare il tempo di esposizione della fotocamera a circa 100 ms. Regolare il contrasto in base alle esigenze. Assicurarsi che l'accoppiamento sia ancora ottimizzato.
   4. Individuare una regione di interesse per l'imaging. Attivare lo stage piezo looping per modalità di media.
      NOTA: la gamma di scansione di 20 m con una dimensione di passo di 50 nm è adatta per la maggior parte delle strutture di guida d'onda.
   5. Cattura almeno 300 immagini.
   6. Caricare la pila di immagini acquisita in Fiji utilizzando una pila virtuale. Dal menu immagine in Figi, scegliete Stack e progetto z.
   7. Calcolare l'immagine TIRF scegliendo il tipo di proiezione intensità media.
4. d Imaging Tempestoso
   1. Accendere il laser a 1 mW e impostare il tempo di esposizione della fotocamera a 30 ms.
   2. Regolare il contrasto e la messa a fuoco.
   3. Aumentare la potenza del laser fino a quando non si osserva un lampeggiamento.
      NOTA: l'operazione potrebbe richiedere un po' di tempo, a seconda dell'intensità del campo evanescente.
   4. Ingrandire una piccola area del campione.
   5. Regolare il contrasto.
   6. Cattura alcune immagini per vedere se i lampeggi sono ben separati.
   7. Regolare il tempo di esposizione della fotocamera per lampeggiare ottimalmente.
      NOTA: L'ottimizzazione delle palpebre è un compito complesso, ma è disponibile un sacco di letteratura adatta¹².
   8. Attivare il ciclo dello stadio piezo.
   9. Registrate una pila di immagini di almeno 30.000 fotogrammi, a seconda della densità lampeggiante.
5. d Ricostruzione dell'immagine STORM
   1. Aprire Fiji e caricare lo stack dSTORM come immagini virtuali.
   2. Regolare il contrasto, se necessario.
   3. Utilizzare lo strumento rettangolo per selezionare l'area da ricostruire.
   4. Apri l'analisi di Run nel plugin Thunderstorm¹³ in Fiji.
   5. Impostare le impostazioni di base della fotocamera in Thunderstorm corrispondente al dispositivo. I restanti parametri predefiniti sono in genere soddisfacenti.
   6. Inizia la ricostruzione.
      NOTA: per l'intero campo visivo, potrebbe essere necessario dividere i dati in sottostack, a causa delle dimensioni del file di grandi dimensioni.
   7. Filtrare l'elenco di localizzazione fornito dal software di ricostruzione per rimuovere le localizzazioni non specifiche. Apple un'ulteriore deriva-correzione, se necessario.

Results

La microscopia TIRF è una tecnica popolare in quanto rimuove la fluorescenza fuori dal piano, aumenta il contrasto e quindi migliora la qualità dell'immagine, ed è meno fotototossico rispetto ad altre tecniche di microscopia basata sulla fluorescenza. Rispetto al tradizionale approccio basato sugli obiettivi, la microscopia basata su chip offre l'eccitazione TIRF senza la velocità effettiva limitata che di solito è accompagnata da una lente TIRF. Una panoramica della configurazione presentata è disponibile nella Figura 1A. Vi presentiamo immagini diffrazione limitata e STORMdi cellule endoteliali sinusoidali (LSEC) estratte dai topi. Viene inoltre presentato un ampio campo visivo dei LSEC con microtubulina etichettata, dimostrando le capacità dell'imaging ad alta produttività. Una configurazione convenzionale dSTORM utilizzando una lente TIRF ad immersione dell'olio (ingrandimento 60x o 100x) in genere immagini un'area di 50 x 50 m, che è 100 volte più piccola dell'immagine basata su chip nella Figura 2, immagine con un obiettivo 25x, 0.8 NA.

In questo metodo, usiamo multi-moded Si₃N₄ guide d'onda per l'eccitazione. I chip utilizzati consistono in uno strato guida inciso da 150 nm Si₃N₄ depositato su uno strato ossidato di 2 m di un chip di silicio. Uno schema del chip può essere trovato in Figura 1B. La larghezza della guida d'onda può variare tra 200 e 1000 m. I dettagli di fabricazione possono essere trovati altrove⁸. Attraverso l'interferenza tra le modalità di propagazione la luce di eccitazione non avrà una distribuzione omogenea dell'intensità, ma piuttosto un modello spazialmente variabile. Figura 2A presenta un'immagine con modelli di modalità chiaramente visibili. Questo modello di interferenza cambierà con la posizione del raggio laser sul bordo della guida d'onda. Per ottenere un'eccitazione omogenea nelle immagini finali, usiamo uno stadio piezo per oscillare lungo la sfaccettatura accoppiata. Nel corso della procedura di imaging, esiste una variazione sufficiente dei modelli di interferenza in modo che possano essere mediati, rimuovendo le fluttuazioni di intensità nell'immagine. Lo stack di immagini sarà costituito da diverse immagini, ad esempio in Figura 2A, anche se con modelli diversi, ma quando media, la pila produrrà un'immagine con eccitazione omogenea come Figura 2B. Un approccio alternativo consiste nell'utilizzare il tapering adiabatico per ottenere guide d'onda ampie e a moderini^8,14, che elimina la necessità di modalità media. Tuttavia, sono necessari diversi millimetri di lunghezza di mantenimento per mantenere la condizione monomodale per ottenere una larghezza di 100 m. Le guide d'onda multi-moded aggirano questa necessità di tapering e non lasciano limiti alla larghezza della struttura. Al di là del modello di illuminazione, l'indice di rifrazione altamente efficace delle modalità consente possibilità senza precedenti verso la microscopia strutturata^{dell'illuminazione 11} e i metodi di microscopia a fluttuazione⁷.

Il primo passo nell'imaging è quello di raccogliere un'immagine limitata di diffrazione. L'esperimento si traduce in una pila di circa 300 immagini e l'immagine finale viene realizzata prendendo la media della pila. Nella Figura 2, presentiamo diffrazione limitata e dSTORM imaging di LSEC etichettati con CellMask Deep Red utilizzando un 60x, 1.2 NA obiettivo di immersione dell'acqua. Figura 2A mostra illuminazione omogenea causata da modalità media insufficiente. La media della modalità di esito positivo viene visualizzata nella Figura 2B. Figura 2C è un'immagine dSTORM della stessa regione, con l'area contrassegnata illustrata nella Figura 2D. Le cellule endoteliali endotalidali del fegato hanno pori nano-dimensionali nella membrana^{plasmatica 15}, che possono essere visti qui. Un'analisi di correlazione dell'anello di Fourier ha fornito una risoluzione di 46 nm.

La figura 3 presenta un'immagine dSTORM di una regione di 500 m x 500 m, dimostrando le elevate capacità di throughput della tecnica. Un'immagine ingrandita della figura 3A, corrispondente a un tipico campo di visualizzazione dSTORM, viene presentata insieme all'immagine limitata di diffrazione nella figura 3B. È stata eseguita una correlazione dell'anello di Fourier per stimare la risoluzione, producendo un valore di 76 nm.

Figura 1: Sistema di imaging e guida d'onda. (A) Fotografia del sistema di imaging. Il campione viene posto su un mandrino a vuoto sul palco del campione, con la sfaccettatura dell'accoppiamento della guida d'onda verso l'obiettivo di accoppiamento. Un laser accoppiato in fibra e un obiettivo di accoppiamento è posto sopra uno stadio piezo 3D. Una torretta per lenti con lenti di imaging cattura l'immagine dall'alto e la trasmette a una fotocamera. (B) Schematico della guida d'onda con lenti di accoppiamento e imaging. La lente di accoppiamento accoppia la luce nella guida d'onda. I campioni (perline arancioni) sono conservati all'interno di una camera PDMS sigillata. Il campo evanescente lungo la guida d'onda entiterà il campione e l'obiettivo di imaging catturerà la fluorescenza emessa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Immagini STORM limitate con diffrazione e dSTORM. (A) Immagine di cellule endoteliali epatiche con media in modalità insufficiente, con conseguente modello di eccitazione chiaramente visibile. (B) La stessa regione di (A), ma con una media di modalità sufficiente, con conseguente eccitazione omogenea. (C) Diffrazione immagine limitata dell'inset to (B); (D) dSTORM della stessa regione. (E) Inset di (D), mostrando chiaramente le fenestrazioni nella membrana plasmatica della cellula. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: dimmagine STORM di LSEC ratto. (A) Grande campo visivo della tubulina macchiata di Alexa 647 nei LSEC di ratto. Barra di scala - 50 m. (B) Più grande regione marcata da (A) confrontando la diffrazione limitata (in basso a sinistra) e l'immagine dSTORM (in alto a destra). (C) Area contrassegnata più piccola da (A). Barra della scala: 1 m. L'immagine ha una risoluzione di 76 nm. Adattato con il permesso di Helle et al. 2019⁶. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

L'imaging basato su chip è simile all'imaging dSTORM convenzionale. La qualità dell'immagine può quindi essere misurata utilizzando gli stessi approcci dell'imaging dSTORM tradizionale. La differenza principale per l'utente è che la diapositiva di vetro trasparente viene scambiato con un Si-wafer opaco. Anche se appaiono molto diversi, la manipolazione del campione è praticamente analoga a uno scivolo di vetro. I chip sono abbastanza robusti e possono essere facilmente maneggiati utilizzando una pinzetta di wafer. La procedura di imaging e la ricostruzione dell'immagine sono le stesse di un normale esperimento dSTORM. La configurazione di un microscopio funzionale basato su chip non richiede componenti speciali, ad eccezione dei chip fotonici. Ulteriori dettagli del set-up possono essere trovati nel lavoro precedente^6,7. I chip utilizzati in questo lavoro sono stati fabbricati utilizzando la fotolitografia standard⁸.

La preparazione del campione comprende la preparazione della camera campione. Quando si collega il telaio PDMS al chip, è fondamentale evitare piccole pieghe o strappi in cui potrebbe entrare l'aria. Se il PDMS si piega quando lo si attacca, è sufficiente rimuoverlo con attenzione con una pinzetta e riattaccarlo. Quando il campione è pronto all'interno della camera PDMS, la copertura deve essere premuta contro di esso, sigillando la regione. È importante evitare eventuali bolle d'aria che potrebbero formarsi quando si attacca la copertura. Se si forma una bolla d'aria, rimuovere delicatamente la copertura e aggiungere PBS alla camera campione per assicurarsi che il campione sia coperto. La preparazione e l'attaccamento dello slittamento di copertura possono quindi essere semplicemente rifatti.

L'accoppiamento della luce nella guida d'onda viene semplificato utilizzando il protocollo proposto in questo documento. Ci sono, tuttavia, alcune sfide comuni che possono limitare l'accoppiamento. In primo luogo, se il chip non è stato pulito correttamente e qualsiasi PBX residuo rimosso completamente, ci potrebbe essere sporcizia o PBS cristallizzato sulla guida d'onda. Questo può introdurre perdite importanti, con conseguente scarsa potenza nella regione di imaging. L'utilizzo di un tampone umido per pulire la regione al di fuori del vetro di copertura può migliorare significativamente la potenza. In secondo luogo, se l'aspetto di accoppiamento della guida d'onda è danneggiato (ad esempio, da una manipolazione impropria), la perdita di accoppiamento può aumentare drasticamente. L'ispezione ottica del bordo di solito rivela facilmente eventuali danni. L'intera sfaccettatura di accoppiamento del chip può essere lucidata con attenzione, proprio come una fibra ottica, e darà una sfaccettatura di accoppiamento liscia, che poi aumenta la potenza accoppiata.

Dopo che la luce è stata accoppiata, la procedura di imaging è la stessa di qualsiasi configurazione dSTORM convenzionale. Se l'immagine ha un'eccitazione omogenea, come illustrato nella Figura 2A, molto probabilmente la modalità media non ha funzionato bene. Le due ragioni più comuni per questo sono: 1) troppo poche immagini catturate per creare una pila media e 2) troppo breve di una distanza oscillazione / troppo grande di una dimensione di passo. Raccogliere troppo poche immagini può tralasciare alcuni modelli di eccitazione e la media sarà quindi inomogenea. Questo può essere facilmente risolto aumentando il numero di immagini nella pila media. Una distanza di oscillazione troppo breve può anche causare un'immagine inomogenea, in quanto non abbastanza modelli di modalità sono eccitati. Questo può anche essere facilmente risolto aumentando la distanza di oscillazione e / o diminuendo la dimensione del passo. In questo lavoro abbiamo usato uno stadio piezo per scansionare il raggio laser di ingresso oltre 20 m e acquisire almeno 300 immagini. Un altro approccio potrebbe essere quello di utilizzare galvo-mirror ad alta velocità per eseguire la scansione della luce attraverso la sfaccettatura della guida d'onda di ingresso entro un singolo tempo di acquisizione, ad esempio 10-30 ms. Questa opzione è adatta per l'imaging TIRF a cellule vive, dove gli organelli subcellulari sono in costante movimento.

DSTORM, basato su chip, offre un'eccitazione TIRF ad ampia area senza precedenti, che la rende ideale per l'imaging ad alta velocità effettiva. Il carattere compatto consente l'ammodernamento ai sistemi commerciali, in cui il chip può essere posizionato a testa in giù per configurazioni invertite o substrati trasparenti. I trucioli sono fabbricati in massa e possono essere modificati per soddisfare molte esigenze. Attualmente, la restrizione principale è che è limitato a 2D. Il campo evanescente è disponibile solo a circa 200 nm dalla superficie della guida d'onda, quindi solo i fluorofori all'interno di questa regione saranno entusiasti. Complessivamente, il campo dell'ottica integrata offre molte opportunità per la microscopia basata su chip nel prossimo futuro, affrontando nuove domande di imaging e fornendo nuove possibilità a quelle esistenti.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
piastra di posizionamento per campioni a 1 asse	Standa	7T173-20
piastra di traslazione di campioni a 2 assi	Mad City Labs Ordine		personalizzato
Tavolino NanoMax a 3 assi	Thorlabs	MAX311D
Corpo del microscopio BXFM	Olympus	OLY-LSM-037018
CellMask Deep Red, Life technologies	ThermoFisher	C10046
Tamponi per camera bianca Tecnologia	MRC	MFS-758
Laser accoppiato a fibra	Cobolt	Portafiltro flamenco
	Fatto in casa
Hellmanex III, Hellma Gmbh	Sigma-Aldrich	Z805939	Detergente detergente concentrato
Isopropanolo	Sigma-Aldrich	563935-1L
KL 1600 LED	Olympus	OLY-LSM-E0433314
Olympus Lente di accoppiamento	Olympus	LMPLFLN 50x/0.5
Orca Flash 4.0 V2	Hamamatsu
PBS compresse	Sigma-Aldrich	P4417-50TAB	Mix secondo le descrizioni
SYLGARD 184 Elastomero siliconico 1.1 kg kit	Dow	1673921
Tip-tilt stage	Thorlabs	APR001
Portavuoto	Thorlabs	HWV001
Pinzetta per wafer Tipo 2W	Agar scientific	AGT5051