Fabbricazione e implementazione di una piattaforma di microscopia della forza di trazione senza riferimenti

Summary

Questo protocollo fornisce istruzioni per l'implementazione della litografia multifotone per fabbricare array tridimensionali di marcatori fiduciari fluorescenti incorporati in idrogel a base di poli(etilene glicole) per l'uso come microscopia a forza di trazione senza riferimenti Piattaforme. Utilizzando queste istruzioni, la misurazione della deformazione del materiale 3D e il calcolo delle trazioni cellulari è semplificata per promuovere misurazioni della forza di trazione ad alta produttività.

Abstract

La quantificazione della deformazione del materiale indotta dalle cellule fornisce informazioni utili sul modo in cui le cellule rilevano e rispondono alle proprietà fisiche del loro microambiente. Sebbene esistano molti approcci per misurare la deformazione dei materiali indotta dalle cellule, qui forniamo una metodologia per monitorare la deformazione con risoluzione sub-micron in modo privo di riferimenti. Utilizzando un processo di modellazione fotolitografica attivata a due fotoni, dimostriamo come generare substrati sintetici meccanicamente e bio-attivamente regolabili contenenti array incorporati di marcatori fiduciali fluorescenti per misurare facilmente tridimensionali ( 3D) profili di deformazione del materiale in risposta alle trazioni superficiali. Utilizzando questi substrati, i profili di tensione delle cellule possono essere mappati utilizzando una singola pila di immagini 3D di una cella di interesse. Il nostro obiettivo con questa metodologia è quello di rendere la microscopia a trazione uno strumento più accessibile e più facile da implementare per i ricercatori che studiano i processi di meccanotrazione cellulare, in particolare i nuovi arrivati sul campo.

Introduction

La microscopia a forza di trazione (TFM) è il processo di approssimazione delle trazioni cellulari utilizzando campi di spostamento interpolati di marcatori fiduciari generati da una cellula aderente e contrattile. Utilizzando TFM, l'influenza dei segnali meccanici nell'ambiente extracellulare su importanti processi cellulari come la proliferazione, la differenziazione e la migrazione può essere studiata^{1,2,3,4 ,5,6,7,}

Protocol

1. Fotopolimerizzare un idrogel di base PEGDA

1. Raccolta di reagenti
   1. Raccogliere fenilio di litio-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP), 3.4 kDa poli(ethylene) diacritaglio glicole (PEGDA), n-vi Pirrodonenyl (NVP), AlexaFluor 488 con etichetta PEGDA (PEG-488), AlexaFluor 633 con etichetta PEGDA (PEG-633) e peptide RGDS PEGylated ( PEG-RGDS) dai rispettivi congelatori e portare ciascuno a temperatura ambiente.
   2. Nei tubi separati di microcentrismo d'ambra, misurare 3 mg di LAP, 10 mg di PEGDA, 5 mg di PEG-488, 20 mg di PEG-633 e 6 mg di peptide RGDS.
2. Preparazione della soluzione pre-polimero....

Results

Nel corso del protocollo, vi sono una serie di punti di controllo che forniscono feedback per valutare la qualità della procedura di modellazione. Per fornire alcune informazioni su come valutare i progressi in ciascuno di questi punti di controllo, forniamo risultati rappresentativi di un esperimento vero e proprio. I risultati evidenziano l'applicazione di questo protocollo eseguito su un idrogel fotofatto preparato per l'analisi TFM delle cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC). I risultati includono i.......

Discussion

L'obiettivo di questo protocollo è quello di fornire un flusso di lavoro che allevia gran parte della difficoltà associata alla generazione e all'analisi dei dati TFM. Una volta preparati, gli idrogel fotodorali sono semplici da usare, richiedendo solo la conoscenza delle pratiche standard di coltura dei tessuti e la microscopia a fluorescenza. L'aspetto senza riferimenti consente una navigazione spensierata sugli idrogel carichi di cellule ed elimina passaggi di elaborazione delle immagini ingombranti come la registrazi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Filtro per siringa Acrodisc, 0,2 &; m Membrana Supor, palla a basso legame proteico		PN 4602	Consente il filtraggio delle soluzioni macromeriche prima della sintesi del gel di base e delle successive fasi di litografia.
I vetrini coprioggetti funzionalizzati #1.5 acrilato-silano	in-house	in-house	Gli acrilati consentono di legare l'idrogel di base alla superficie del vetro per immobilizzare gli idrogel. Vedi riferimento: 21-24
Axio-Observer Z1 con microscopio a campo largo Apotome	Zeiss		con modulo di illuminazione strutturata utilizzato per acquisire immagini per TFM.
Camaleonte Visione ii	Coherent Inc.		Equipaggiato con microscopio a scansione laser utilizzato per la litografia multifotone.
Nastro biadesivo, 9500PC, 6,0 mil	3M		Lega i vetrini protettivi funzionalizzati con acrilato-silano alle piastre di Petri.
Flexmark90 PFW Liner	FLEXcon	FLX000620	Consente il rivestimento di nastro biadesivo consentendo l'alimentazione del nastro nel plotter.
LSM-880	Microscopio a scansione laser Zeiss		utilizzato per la litografia multifotonica.
MATLAB	Mathworks	R2018a	Esegue script personalizzati per generare istruzioni di litografia per il microscopio e per l'analisi dei dati TFM.
Modello SC Plotter	USCutter	SC631E	Taglia il nastro biadesivo in anelli per legare i vetrini coprioggetti alle piastre di Petri.
Obiettivo C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27	Zeiss		Equipaggiato sia su microscopio a campo largo che su microscopio a scansione laser per essere utilizzato sia per litografia che per TFM.
PEG-AF633<	em>in-house	in-house	Variante PEG in acrilato marcata con fluoroforo per la creazione di marcatori fiduciali. Vedi riferimento: 21
PEG-DA	em>in-house	in-house	Materiale di base per idrogel. Vedere riferimento: 21
PEG-RGDS	in-house	in-house	RGDS variante PEG monoacrilato marcata con peptidi per promuovere l'adesione cellulare. Vedi riferimento: 21
piastre di Petri	CELLTREAT	229638	fori da 8 mm vengono tagliati al centro di ogni piastra utilizzando una punta di carotaggio per adattarsi agli idrogel di base.
Kit elastomero siliconico Sylgard 184	Dow Corning	3097358-1004	Per la creazione di distanziatori per controllare lo spessore dell'idrogel di base (noto anche come PDMS).
Siringa, Leur-Lok, 1 mL	BD	309628	Consente il filtraggio delle soluzioni macromeriche prima della sintesi del gel di base e delle successive fasi di litografia.
Lampada UV	UVP	Blak-Ray® B-100AP	polimerizza l'idrogel di base.
1-vinil-2-pirrolidinone (NVP)	Sigma-Aldrich	V3409-5G	Accelerante radicale e co-monomero. Migliora l'incorporazione del fluoroforo pegilato durante la litografia.